164色谱法在药品研发中的应用及常见问题分析

发布日期 20061130

栏目 化药药物评价>>化药质量控制

标题 色谱法在药品研发中的应用及常见问题分析 作者 张哲峰 部门 正文内容

审评三部 张哲峰

摘要：色谱方法在药物研发中占据重要地位，本文介绍了一些常用的色谱方法原理以及在药物研发，尤其质量控制中应用的注意之处，并列举了申报资料中色谱法应用的一些常见问题，以引起大家的关注。 关键词：色谱法 类型 常见问题

色谱法是一种分离分析技术，通过将样品中的组分分离，再逐个分析，因此是分析混合物、检测化合物纯度的有力手段，因而在药物研发中广为应用，包括原料药、中间体、制剂和生物体液中化合物的定性和定量，涉及的待测物包括手性或非手性药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂（如防腐剂）、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的杂质、植物药中的农药和代谢物等，包括制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性及药物动力学研究等过程。因此，色谱方法在药物研发中占据举足轻重的地位。

一、色谱法的几种常见类型 1、HPLC法： （1）手性液相色谱

将“手性识别”或“手性环境”引入色谱系统中，以形成暂时非对映异构体复合物，从而直接分离药物对映体；或将对映体衍生化生成非对映体，而得以分离。即分离光学异构体可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流动相手性添加剂形成非对映体来实现。 （2）离子交换色谱

使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。可用pH程序洗脱。 （3）离子对/亲和色谱

常用反相离子对色谱，用缓冲液和加入的对离子（与被分离的样品荷相反电荷）分离。分离受pH、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影响，亲和色谱，一般用于大分子，使用配合体（共价结合在固体基质上的生物活性分子），与其同类的抗原（分析介质）反应，生成可逆转的复合物，通过改变缓冲条件洗脱。 （4）正相色谱

将各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，固定相极性＞流动相极性。常用固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分离水溶性的极性、强极性化合物，此时较小极性的组分比较大极性组分更快地洗脱。 （5） 反相色谱

将各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，固定相极性＜流动相极性。常用固定相：烷基、苯基等非极性有机分子，最常用ODS柱或C18柱，其极性很小，适于分离非机性、弱极性离子型样品。是目前药物研发中液相色谱的主要分离模式，通常用紫外检测器，用水作基本溶剂，选择性受溶剂强度、柱温和pH的影响，一般来说较大极性比较小极性组分洗脱更快。

紫外检测器可以用于各类液相色谱，这类检测器要注意的是氘灯老化后的灵敏度降低，其灵敏度因仪器的设计和/或者制造厂家的不同而异。用紫外检测器和反相HPLC组合得到的色谱图不一定能真实的反映实际情况，原因是：①极性比目标化合物大得多的化合物可能被掩盖（在溶剂前沿或死体积时同时洗脱）；极性比目标化合物小得多的化合物洗脱出来晚，甚至保留在柱上。为避免此情况发生，最好使用梯度洗脱法。②无紫外吸收或在检测波长处吸收相差较大的多种化合物，有时在某一检测波长处不能被检出，因为通常只用一个检测波长。为避免此情况发生，可改用其它类型检测器，如示差折光检测器；流动相许可时，最好使用蒸发光散射检测器。 （6） 分子排阻色谱

以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被滞留，后被洗脱。

根据样品性质可分为两类：凝胶过滤（GFC）—用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖；凝胶渗透（GPC）—用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。SEC主要依据分子量大小进行分离，因此与样品、流动相间的相互作用无关，因此不采用改变流动相的组成来改善分离度。 2、 气相色谱（GC）

气相色谱基于挥发性样品由作为流动相的载气运载，通过色谱柱内的固定相时发生吸附和解吸附过程进行分离。

通常GC分析的样品是低分子量、易挥发、高温稳定的化合物。药物和药物制剂中的残留溶剂适于GC分析。常用的检测器有用于含碳化合物的火焰离子化检测器（FID），用于卤化物的电子捕获检测器（ECD），用于含硫或磷化合物的火焰光度检测器（FPD），以及用于含氮或磷化合物的氮磷检测器（NPD）。填充柱已多被毛细管取代来改进分离度和分析时间，分析物位置与HPLC一样，用保留时间（Rt）表示。 3、薄层色谱（TLC）

薄层色谱是一种最简便普通的色谱技术，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定（已少用）的方法。对于本身没有颜色的化合物，检出技术包括荧光、紫外和喷雾显色剂。分析物在薄层板上的位置用Rf值（化合物的展开距离与溶剂前沿的比值）来表示。

三种方法中，薄层色谱最普通，因为薄层板上所有的组分都可用适宜的检测技术检出，但通常不如HPLC准确和灵敏。虽然选用适宜的检测技术，TLC法能见到分析的“全图”（whole picture）,但分析变异比HPLC大。 二、色谱法在药物研发中的一般应用

TLC法主要用于药物的定性鉴别，可从斑点的位置（Rf值）与颜色两方面对药物进行定性，优于HPLC和GC法（只能从色谱峰保留时间把握药物的定性性质），定量时仅用于有关物质的限度检测（半定量），结合不同原理的检视技术，TLC法能见到分析的“全图”（whole picture）,使各有关物质斑点均可显示，但变异比HPLC法大；HPLC和GC法的主要优势为定量，但如果运用得当，尤其在含量测定或有关物质项下已采用本法的情况下，利用对照品与供试品保留时间相同的特性作为鉴别依据，既不必专门实验又增加了鉴别的专属性，是非常可取的。由于分离分析的定量优势，HPLC或GC法成为新药研发不可缺少的手段，尤其生物样品中药物的定量，HPLC或GC法为最常用的分析手段。 1、定性鉴别

色谱法对同系物或具有相同母核药物（尤其制剂）的鉴别具有光谱法和化学法无可比拟的优势。但方法专属性须经充分验证，确保结构相近化合物或最难分离物质对在拟定色谱条件下能良好分离。申报资料所用鉴别法的色谱条件多数与有关物质、含量测定一致，实际上，在后两者的方法学研究中，多以合成中间体、起始原料以及降解产物考察其专属性，但在鉴别中，则以能够与结构相似的同类药物良好分离为主要考虑，故在专属性验证中宜得到体现。

但在实际操作中有时遇到同一物质在完全相同的色谱系统中保留时间不一致的情况，药典中对保留时间（斑点位置）的一致性未予具体规定。对此，可采用如下措施：（1） 注意色谱系统的稳定性，流动相（展开剂）与固定相相匹配，在C18柱的反相色谱系统中，流动相有机溶剂比例不低于5％，避免C18链的随机卷曲将造成色谱系统不稳定导致组份保留值波动的现象；TLC的色谱展开要适中，使主斑点的Rf值在0.2～0.7间。（2） 操作中另配制一供试品与对照品等量混合的溶液，进样（点样）后出现单一色谱峰（斑点）作为鉴别依据，以弥补该法之不足。 2、有关物质检查

2.1 TLC法因设备和操作简便、检视（显斑）方法多而较常用，但由于其变异性大，应充分验证系统的适用性，使各斑点Rf值在0.2－0.7之间，并应分离清晰。新版欧洲药典提出了斑点分离度计算公式：Rs=1.18α(RF2-RF1)/ωh1+ωh2(Rs:分离度，α：溶剂前沿，RF2、RF1：比移值，ωh1、ωh2：斑点宽)，可积累经验予以采纳。杂质检测可用对照品比较法或自身对照法，前者用于已知杂质控制并需杂质对照品，也可两种方法结合应用，自身对照法应注意杂质斑点与主成分斑点色调应一致，具有可比性，必要时可选用荧光薄层板，利用荧光熄灭法检视，或两种检视方法结合应用。结果的判断，除控制杂质的斑点数与限度外，也可采用两种以上不同浓度的对照溶液分别比较。如某药品，用自身稀释成1.5%和0.5%两种浓度的对照液，供试液如显杂质斑点，不得多于3个，允许1个超过0.5%，但不得过1.5%，其余杂质斑点均不得过0.5%作限量要求。

在TLC法的方法学研究中，可配制多个展开剂系统及不同的吸附剂，进行几种组合的试验，将主成分与已知的中间体、副产物、降解物或异构体斑点的颜色及分离情况进行对比，确定最佳色谱系统。同时要采用适宜的稀溶液验证其灵敏度，确定合适的检视方法，处理好灵敏度与杂质限度的关系。并通过适当改变展开剂比例及pH值，考察检测方法的耐用性。由于影响TLC法重现性因素较多，如薄层板质量、点样技术、展开室温湿度等都可能影响色谱分离度或灵敏度，需在质量标准中对分离度和灵敏度做出明确要求，如：实验时，除供试液、对照液点样外，主药与另一结构相近化合物（最难分离物质对）混合溶液，以及另一低于标准限度的对照溶液同时点样，要求混合溶液应显示分离良好的斑点，后者应显示清晰斑点，以确保检测结果的可靠性。

2.2 根据药物的理化性质，HPLC法首选C18柱；流动相首选甲醇－水系统，必要时加入某种溶剂如乙腈或少量酸碱溶液、缓冲液等，以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相，pH大于8时，可使载体硅胶溶解，此时应选用包覆聚合物填充剂、高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、非硅胶填充剂或有机－无机杂化填充剂等耐碱填充剂；pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落，此时应选用有机－无机杂化填充剂、具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或而异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶等耐酸填充剂；如分离不好可选用其它类型柱和流动相，对某些品种需用特定牌号的填充剂方能满足分离要求时，可注明适用的牌号；检测器首选UV检测器，流动相合适时，蒸发光散射检测器可能更好，可积极研究，成熟时予以采用。 采用的定量方法有：

（1）杂质对照品法，即外标法。仅限于对已知杂质的控制，如采用该法，则应注意对该对照品进行定性研究，并制订其质量要求。

（2）加校正因子的主成分自身对照法，即以主成分作对照的内标法，校正因子可在检测时测定，但需提供杂质对照品，也可在建立方法时将测得的校正因子载入质量标准，供以后常规检验使用，无需长期提供杂质对照品，但也仅适于已知杂质的控制。 （3）不加校正因子的主成分自身对照法，实质上也是以主成分作对照的内标法，但其前提是假定杂质与主成分的响应因子相同，适用于具有与主成分相同或类似发色团的杂质，因一般情况下，有关物质与主成分具有相似的分子结构，此法不致发生太大误差。

（4）峰面积归一法，简便快捷，但因各杂质响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不同等因素，可产生较大的误差。

一般情况下，校正因子在0.9～1.1时可不予校正，即3法，校正因子在0.5～5.0以外时，应改变检测波长使在该范围内，如无法调节，应采用（1）法；由于有关物质中有已知的亦有未知的杂质，故采用（1）＋（3）法或（2）＋（3）法比较理想，同时控制产品中的已知杂质和未知杂质；使用（3）法时，应在考察已知有关物质的校正因子（应位于0.5～5.0以内）或结合二极管阵列检测结果（主成分与各有关物质的UV吸收偏差应不大）后采用，也可根据物料平衡原理（含量测定值与有关物质值的和与供试品理论总量的偏差）验证方法是否可行； 一般不主张在质量标准中采用（4）法，但在对映体杂质的检测中是一个简捷的方法，也可用于稳定性研究中对杂质变化的监测。

3、含量测定：色谱法按外标法或内标法以峰高或峰面积进行定量。

内标法用于GC和HPLC减小测定误差，曾经起到很好的作用，特别是在GC中，进样量小，内标法能显著提高定量精度，随着现代分析仪器的发展，原手动进样已被定量环或自动化程度高的进样器所取代，内标法的应用受到挑战，尤其在HPLC中，由于进样量大，外标法已具有很好的进样精度，加入内标，有时反而对分析不利，有研究者曾随机选取药典中八个内标法测定含量的药品进行试验，结果表明，内标法均不能提高分析精度，实际上，内标法使分析误差与经常校准的外标法相比增加了√2倍，说明测定两个峰比测定一个峰引入的误差要大。一般情况下，如下情况适合于使用内标法：复杂的样品制备过程，如多次提取；低浓度的样品（灵敏度是确定的），如药代动力学的研究；在样品分析中预计是很宽的浓度范围，如药代动力学研究。外标法多用于原料验收、成品质控、稳定性和TLC法，内标法多生物体液和GC法。需要注意的是，在外标法中，保持供试品浓度与对照品浓度相近可以改善方法的准确性。 峰高定量仅在峰高随样品量呈线性变化时使用，当峰形不正或色谱柱超载时，峰高法会出现较大误差，由于峰高测量受相邻重叠峰的干扰较小，故比峰面积定量更为准确，如BP中庆大霉素C组份检测明确要求峰高定量。峰面积定量的好处是其精度受仪器参数变化的影响较小，对不是高斯分布的峰形也能较好定量，但其准确度受相邻峰重叠的影响。一般情况下，为得到较好的精确度，宜用峰面积定量；为最大限度地排除其它组份的干扰，则多用峰高定量。痕量分析中多用峰高法定量。 三、申报资料中几种常见问题

1、方法灵敏度不够－－定量限高于杂质限度

例1.有关物质检查法的定量限为0.75ng，标准规定杂质限度不得过1.0%，折算为0.5ng，表明此法不能有效检测产品杂质，需重新建立有效的杂质检测方法。 2、检测方法缺乏互补性

例2.某药品有关物质研究中显示，合成中重要中间体N－环己基－5－（4－氯丁基）－1，2，3，4－四氮唑在检测波长处无吸收，故建立的有关物质检查方法无法检测该物质。需建立该中间体适宜的检测方法，考察其在产品中的残留情况，视情况订入质量标准。

例3.提供的有关物质检查方法不能检测中间体，请制订合适的中间体检测方法（如TLC法等），并提供方法学研究资料，考察其在产品中的残留情况，视情况订入质量标准。

3、强制降解忽视药物的敏感条件

例4.对乙酰氨基酚水解后极易受到氧化破坏，需补充考察本品氧化破坏后主成分与降解物的分离情况，以验证有关物质检测方法的可行性。

4、强制降解条件过于剧烈，无法判断主峰与降解产物的分离情况

例5.样品经碱解、氧化破坏后，主药头孢特仑匹酯被完全破坏，无法说明其降解物与主峰的分离情况，需调整降解条件的剧烈程度，考察主峰与降解产物的分离情况。 5、供试液制备处理欠妥，不能如实反映产品有关物质情况

例6.某药品有关物质检查中供试液制备经过了碱化、萃取等复杂过程，是否会引起产品中有关物质的变化而影响检出结果，需说明或改进供试液制备方法。

例7.为提高供试液中主药浓度，其制备经过了固相萃取过程，测定结果难以如实反映产品中杂质情况，建议改用其他合适方法。 6、检测波长缺乏针对性

例8.从提供的UV图谱可见，氢溴酸右美沙芬具有很强的末端吸收，220nm附近的吸收强度远高于278nm波长处，需提供同一份加速破坏样品分别用该两波长检测时的色谱图，并比较其杂质峰的个数及峰面积，以确定合适的检测波长。 7、忽视合成中间体、粗品在方法专属性验证中的作用

例9.某药品在合成中，可产生其产品或中间体的顺式异构体等副产物，其结构相似难以分离，需考察在拟定色谱条件下，主成分与各中间体、副产物的分离情况，必要时在系统适应性验证中规定最难分离物质对的分离度要求，以确保色谱系统的有效性。 8、积分时间不充分，不能有效检出有关物质

例10.氧化破坏试验中，主峰保留时间的3倍处，仍有降解物峰出现，而标准规定色谱图记录至主成分峰保留时间的2倍，不能有效检出有关物质，需改进，并用改进后的方法重新进行影响因素试验及长期稳定性研究的后续试验。

例11.某药品有关物质检查色谱图记录时间为30分钟，但仅选择“基线平坦、无任何杂质峰”的3－15分钟内积分，应在全记录时间段内积分以有效检出有关物质，并以此重新进行稳定性研究。

9、方法学研究结论未充分反映到质量标准中

例12.溶液稳定性试验表明供试液仅在1小时内稳定，需在质量标准有关物质和含量测定项下注明“供试液及对照品溶液应配制后立即进样”，以保证测定结果的准确可靠。 例13.某药品在拟定色谱条件下，主峰与杂质Ⅱ的分离度仅为1.3，需在质量标准有关物质检查的“色谱条件与系统适应性试验”中规定该物质对的分离度要求，以确保有关物质有效检出。

10、方法学研究不全面

例14.某药品有关物质检查的流动相水－磷酸（100：0.1）中缺少有机改性剂，且与对照品保留时间的一致性也作为本品鉴别依据，需提供同一供试液重复5次进样的峰面积和保留时间的RSD值，以验证色谱系统的稳定性。 11、限度确定明显欠妥，或依据不充分

例15.某输液剂有关物质限度为不得过1.0%（HPLC法）,但中国药典2005年版二部收载的本品原料及其片剂的有关物质限度（TLC－自身对照法）为不得过0.25%，需照此修订有关物质限度，制订单个杂质限度为不得过0.25%，以确保产品质量。 例16.本品（粉针剂）有关物质限度较宽（20.0%），其依据尚显不足，需用相同方法检测原发厂市售效期内同品种注射液有关物质含量，作为本品有关物质限度制订的依据之一。 备注

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