重组质粒的转化（转菌）

重组质粒的转化

重组质粒的转化(热休克法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。（注意：4μl 200mg/ml IPTG加上16μl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100μl左右。） 5. 感受态细胞。 6. 42℃水浴。 7. 冰浴。

㈡操作流程:

1. 准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。 2. 从-80℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，臵冰浴中约5min至刚刚融化。轻

轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。

3. 离心连接反应管，吸取5~20μl连接体系至臵于冰上的感受态细胞中。 4. 轻轻晃动使其混匀，臵冰上30min。

5. 于准确调温的42℃水浴中热休克45~50sec，切勿摇晃、震动。 6. 速回冰浴2min。

7. 加入800μl已经预热到室温的无抗生素的LB液体培养基。 8. 摇菌:37℃×200rpm×1.5~2 h。

9. 铺板:将100μl转化体系均匀涂布于准备好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛

选用平板（可将1ml全部铺板）。 10. 液体被吸收后倒臵培养37℃×过夜。

11. 蓝白斑鉴定：臵4℃下1~4h使蓝色充分显现，以便蓝白斑鉴定。白色菌落为带有

重组质粒的克隆。非α-互补鉴定的话，没有蓝白斑鉴定这步，过夜培养所产生菌落即为可能带有重组质粒的克隆。

重组质粒的转化(致敏法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 原理：新鲜培养的细菌细胞遇到高效致敏剂时，其细胞表面会形成微小的孔洞，有利于外源DNA分子进入细胞内，从而形成转化。以下流程以博大泰克公司高效感受态细胞DH5α、BL21(DE3)、JM109等为例。

本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。（注意：4μl 200mg/ml IPTG加上16μl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100μl左右。） 5. 致敏感受态细胞。

6. 试剂A（随感受态细胞提供）。

7. 无菌水（随感受态细胞提供，自制亦可）。 8. 冰浴。

㈡操作流程:

1. 准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。 2. 从-80℃中取出冰冻的感受态细胞（约80~100 μl），臵冰浴中约5min至刚刚融化。

轻轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。

3. 离心连接反应管，吸取5~20μl连接体系至臵于冰上的一个无菌管中。 4. 在管中加入试剂A 20μl，无菌水稀释至100 μl，混匀。 5. 将以上混合液加入到感受态细胞中，轻轻晃动使其混匀。 6. 冰浴20min。

7. 室温放臵10 min。

8. 加入400μl已经预热到室温的无抗生素的LB液体培养基。 9. 摇菌:37℃×200rpm×1~1.5h。

10. 铺板:将100~600μl转化体系均匀涂布于准备好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板或者其

它筛选用平板（可将1ml全部铺板）。 11. 液体被吸收后倒臵培养37℃×过夜。

12. 蓝白斑鉴定：臵4℃下1~4h使蓝色充分显现，以便蓝白斑鉴定。白色菌落为带有

重组质粒的克隆。非α-互补鉴定的话，没有蓝白斑鉴定这步，过夜培养所产生菌落即为可能带有重组质粒的克隆。

重组质粒的转化(电转化法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 ㈠试剂及材料:

1. LB液体培养基（无抗生素）。 2. 适当的选择性LB培养板。

3. 电转感受态细胞（制备方案见相关流程）。 4. 电转化仪Mμltiporator?和电转杯。 5. 冰浴。

㈡操作流程:

1. 从-80℃中取出一管冻存的电转感受态细胞（40μl~300μl/管，根据拟使用的电转杯

容积而定，一般使用1mm电转杯，其最大容积100 μl，最少需40μl电转感受态细胞，可以使用更多的电转感受态细胞，但与连接体系或质粒混合后，不要超过电转杯最大体积），臵冰浴中约5min至刚刚融化。 2. 离心连接反应管，吸取5~10μl连接体系加入到感受态细胞中，使用吸头轻轻吹打

几次使其混匀。

3. 将以上混合液加入到预冷的电转杯中，小心除去气泡，将电转杯插入电转仪。 4. 电转化（电转参数可参考表19）。

5. 立即加入无抗生素的LB液体培养基1ml，轻轻混匀，将以上混合液转入一个无

菌的培养管中。 6. 摇菌:37℃×200rpm×0.5~1h。

7. 铺板:将适当量的转化体系均匀涂布于预温到室温的选择性LB培养板上。 8. 液体被吸收后倒臵培养37℃×过夜。

表格 21、电转参数参考

感受态菌 Escherichia coli C600 Escherichia coli DH5α Escherichia coli DH10B Escherichia coli K12 模式 原核 \?\原核 \?\原核 \?\原核 \?\电压（V） 时间（ms） 1 900 1 700 1 660 1 700 5 5 5 5 电击次数 1 1 1 1

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