生物化学仪器分析答案合成版

《生物仪器分析原理与方法》复习题

一、《绪论》复习题

1.谈谈科学仪器在生命科学中的重要性。 科学仪器促进科学技术的发展

科学仪器是经济发展的推动力倍增器 科学仪器是可持续发展的保证和指路标 科学仪器是打破贸易壁垒的强有力工具 科学仪器是确保国家安全的利剑 科学仪器是打击犯罪的有力手段 科学仪器是开展生命科学研究的支撑 2.什么是标准曲线？如何制作标准曲线？

标准曲线是被测物质的浓度或含量与仪器响应信号的关系曲线。

标准曲线是依据标准系列(或含量)和其相应的响应信号测量值来绘制的。 一元线性回归法 y = a + bx

3.什么是相关系数？如何计算？相关系数大小具有什么意义？

在分析化学上，相关系数是用来表征被测物质的浓度（或含量）x与其响应信号值y之间线性关系好坏程度的一个统计参数。

n y)Σ(xix)(yii =1r=+

nn1/22x)yy)(x(]i i[i =1ΣΣi =1

当|r|=1时，y与x之间存在着严格的线形关系。|r|越接近1,则y与x 之间的线形关系就越好。相关性也就越高。

4.什么是灵敏度？灵敏度的意义？

物质单位浓度或单位质量的变化引起响应信号值变化的程度，称为方法的灵敏度，用 S 表示

dxS= =dxS或dcdm

灵敏度也就是标准曲线的斜率，斜率越大，方法的灵敏度就越高。 5.什么是精密度？精密度的意义？

精密度是指使用同一方法，对同一试样进行多次测定所得测定结果的一致程度。 精密度常用测定结果得标准偏差 s 或相对标准偏差（sr）量度。

n(xix)2 ΣS=i =1

n1

S

6.什么是准确度？什么是仪器的检出限？如何计算？

试样含量的测定值与试样含量的真实值(或标准值)相符合的程度称为准确度。准确度常用相对误差量度。

Sr=x×100%某一方法在给定的置信水平上可以检出被测物质的最小质量，称为这种方法对该物质的检出限，以浓度表示的称为相对检出限，以质量表示的称为绝对检出限。

XLXb3sb

D== SS

二、《PCR仪》习题

1.什么是RT-PCR?现拟检测细胞中X基因mRNA水平表达，给你如下试剂：AMV逆转录

酶（带5×RT buffer等）、10mM dNTP，热启动Taq DNA聚合酶、上下游引物，请编写出在PCR仪用一步法扩增该基因的程序。

RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

一步法，能克隆微量mRNA而不需要构建cDNA文库，即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行，一部分完成，省略了cDNA与PCR之间的过程。扩增具体操作可按RT-PCR反应试剂盒说明书进行。可做25μL反应体系：总RNA0.5μL，5×RT buffer 5μL，AMV逆转录酶1.25μL，10mM dNTP 0.5μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，其余用超纯水补齐。

反应条件：58℃30min，94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,35个循环，72℃7min,4℃-∞

2.什么是热启动Taq DNA聚合酶？实现Taq DNA聚合酶热启动常采用哪些方法？

存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。 第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。

3.什么是Touch down PCR? Touch down PCR有什么用途？请编写出在PCR仪进行Touch down PCR扩增的程序。

Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到―Touchdown‖退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。

该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。具体过程如下：使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各长18个碱基（6个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。使用简并引物即可以进行―Touchdown PCR‖。 94度预变性3分钟，

94度变性30秒，65度（Tm若为55度）退火30秒，72度延伸1分钟。

以后每个循环依次降低1度，直到50度，共15个循环。

94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分钟。15－20个循环。 72度延伸10分钟。

4.什么是Touch up PCR? Touch up PCR有什么用途？请编写出在PCR仪进行Touch up PCR扩增的程序。

Touch up PCR是指每隔一个循环升高1°C反应退火温度，直至达到―Touch up‖退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。

该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。 94度预变性3分钟，

94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分钟。 以后每个循环依次升高1度，直到65度，共15个循环。

94度变性30秒，65度退火30秒，72度延伸1分钟。15－20个循环。 72度延伸10分钟。

5.什么是梯度PCR?梯度PCR有什么用途？请编写出在PCR仪进行梯度PCR扩增的程序。 梯度PCR其实就是将多个的PCR反应放在一起做，不用一次一次的作很多次，温度梯度PCR可以很快的找出最适合的退火温度，或者说可以在最适合的退火温度下扩增出目的条带 。

梯度PCR简单、直观、快速,适用于各种核酸分子的扩增,具有高效率、高通量的优点,有着广阔的应用前景。

在一台PCR仪上同时做多管PCR： 94度预变性3分钟，

94度变性30秒，退货温度设置梯度（退火温度50℃~60℃可以分6管，分别为50，52，54，56，58，60度）退火30秒，72度延伸1分钟。15－20个循环。 72度延伸10分钟。

6.某人在进行PCR扩增时，得不到扩增产物，经分析引物（Tm = 55℃）、模板、试剂均不存在问题，梯度PCR也没能解决问题，请用你所学的PCR知识帮他解决试验问题，并写出拟采用PCR仪扩增的程序。 用Touchdown PCR

7.某人在进行PCR扩增时，虽然扩增得到产物，但引物二聚体太多，经优化反应试剂浓度、PCR扩增条件后仍没能解决问题，请用你所学的PCR知识帮他解决试验问题，并写出你拟在PCR仪扩增的程序。

引物二聚体的产生原因比较多，其中很重要的一个就是引物自身的原因，也就是设计的引物特异性不好，不能有效的和模板进行结合，而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现；还有可能是退火温度的问题，可以做个梯度PCR或降落PCR，来摸索一个合适的退火温度，也可有效地减少二聚提的出现。

三、《荧光定量PCR仪》习题

1.什么是实时荧光定量PCR？其工作原理是什么？

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

工作原理：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。

样品载台的容量常见的是36孔、48孔、96孔、384孔。基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。微量荧光检测系统由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。探测光路设计，有的厂家采用步进电机加导轨的装置带动探测器的检测位置来测量每个样本的荧光，如博日公司的―Line-gene’实时定量PCR仪；有的产品采用光开关来转换荧光检测位置，如西安天隆科技有限公司的―TL998A’型实时定量PCR仪。配套的计算机和软件提供热循环编程、数据分析、热循环温度和荧光值实时监测图形显示、数据库管理等功能。

2.什么是SYBR Green I？用SYBR Green I进行实时荧光定量PCR的工作原理是什么？ SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 。 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 3.什么是Taqman探针？用Taqman探针进行实时荧光定量PCR的工作原理是什么？

TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

4.什么是分子信标探针？用分子信标探针进行实时荧光定量PCR的工作原理是什么？ 分子信标探针(Molecular beacons probe) 可形成发夹结构的寡核苷酸探针，5′末端标记荧光素（EDANS)，3′末端标记淬灭剂(DABCYL) ，探针噜扑环与目的DNA 碱基互补，噜扑环两侧为与目的DNA 无关的碱基互补的臂。当探针与靶序列相连，淬灭基团与报告基团逐渐远离，遂发出荧光。

5.什么是看家基因？为什么常在实时荧光定量PCR扩增目的片段同时扩增看家基因？ 看家基因(house-keeping gene) 又称管家基因又称持家基因。是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。

在实时荧光定量PCR中，看家基因通常作为内参基因。实时荧光定量PCR是检测低丰度mRNA的敏感方法,为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA 产量、质量和cDNA合成效率的变化。选择适当的内参

基因以减少检测标本间的差异是必须的。

四、《超净工作台与生物安全柜》习题

1.什么是超净工作台？其工作原理是什么？超净工作台能否用于生物安全二级以上的病原微生物操作？

答：答：1）在操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等实验材料时，为避免实验材料受到环境中未经过滤的空气中污染而设计的一种为实验室工作提供无菌操作环境的洁净设备。 2）原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空气（进滤空气）按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。从操作质量和对环境的影响来考虑，以垂直式较优越。由供气滤板提供的洁净空气以一个特定的速度下降通过操作区，在大约操作区的中间分开，由前端空气吸入孔和后吸气窗吸走，在操作区下部前后部吸入的空气混合在一起，并由鼓风机泵入后正压区，在机器的上部，30%的气体通过排气滤板从顶部排出，大约70%的气体通过供氧滤板重新进入操作区。为补充排气口排出的空气，同体积的空气通过操作口从房间空气中得到补充。这些空气绝对不会进入操作区，只是形成一个空气屏障。（国产的超净工作台许多只有供气滤板，过滤空气进入操作区形成一定的正压，空气从设置的排气孔和操作口排出进入环境空气中，这种空气流动方式对周围环境和操作者都没有保护作用。） 3）不能

2.什么是生物安全柜？其工作原理是什么？生物安全柜能否用于生物安全二级以上的病原微生物操作？

答：1）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的一种安全防护设备。

2）用高效粒子过滤器（HEPA）对粒子进行过滤与滞留。HEPA高效粒子过滤器对大于等于0.3微米的颗粒的有效过滤可达到99.99%

层流：我们将气体沿着一个方向且以某一固定的速度流动定义为层流。实际上安全柜由上向下流动的层流，能捕捉住安全柜工作区域内产生的全部烟尘，并将他们引导到HEPA过滤器。定向气流：定向流动也会对生物安全柜的性能起着关键的作用，空气从安全柜前面的栅格里引入安全柜。而空气导流板会阻止安全柜内的烟雾从工作区域跑到外部环境中去。 3）能，

3.超净工作台安装、使用和维护应该注意什么？

调试：（1）在调试前应为机器选定一个较好的环境。将其置于一间有空气消毒设施的无菌室是最好的，如果条件不具备，就应将机器安放于人员走动少、较清洁的房间中。调整各脚的高度，以保证稳妥和操作面的水平。超净工作台的供电应采用一条专门电路，以避免电路过载造成空气流速的改变。（2）紫外线杀菌灯和照明用日光灯是超净工作台的标准配置，鼓风机提供空气流动的动力，这些部件是否正常工作是一目了然的。最困难也是最重要的是

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