快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

JOURNALOFINSPECTIONANDQUARANTINE检验检疫学刊Vol.20No.22010年第2期

快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试

纸条方法的建立

王彦芳

1,2

　姜宝芹　邢福彬　杨鹏飞　张丽萍　平芮巾　咸庆杰

222221,2

　胡孔新　岳启安

21

(1.潍坊医学院　山东潍坊　261053;2.中国检验检疫科学研究院)

摘要　[目的]建立一种能快速区分、简便诊断西尼罗病毒感染的胶体金免疫层析试纸条方法。[方法]

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记西尼罗病毒NS1蛋白,采用双抗原夹心法制备胶体金免疫层析试纸条,对试纸条进行特异性和敏感性评价。[结果]15m;在敏感性上,该试纸条对阳性血清的检测较美国Focus公司商品化的ELI;89份阴性血清进行检测,试纸条检出9份阳性,ELISA试剂盒检出3.52%,特异性为89.89%。[结论],为进一步大规模应用奠

定了基础。

关键词　;;免疫层析法中图分类号.2

EstablishmentoftheRapidDetectionofWestNileViruswithGold-immunochromatography

WangYanfang

1,2

,JiangBaoqin,XingFubin,YangPengfei,ZhangLiping,PingRuijin,

XianQingjie

1,2

22222

,HuKongxin

2

(1.WeifangMedicalUniversity,Weifang,Shandong,261053;2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine)Abstract:It’stoestablisharapidandconvenientgold-immunochromatographyfordetectingofWestNileVirus.Synthesize25nmcolloidalgoldparticlesbytrisodiumcitratedisoxidationmethod.Basedonthedoubleantigensandwichtechnique,NS1proteinofWestNileViruswascoupledwithcolloidalgoldtopreparecolloidalprobewhichwasusedtodetectAnti-NS1antibodyofWestNileVirus.Thesensitivityandspecificitywereevaluated.Testingresultscanbeobtainedin15minuteswithsensitivityoftheestablishedmethodislowerthanFocusWestNileVirusIgGELISAatitre;eighty-ninebloodserumsamplesweretestedbymeansofgold-immunochromatographyandELISA,ninesampleswerepositivetestedbygold-immunochromatography,whilethreesampleswerepositivetest2edbyELISA,rateofcoincidenceis86.52%,whencomparedwiththatofELISA.Thegold-immunochromatogra2phyisasimpleandrapidassayfordetectingWestNileVirusonspotwhichcanbefurtherstudiedtobeassembledintocommercialkit.

Keywords:WestNileVirus;Colloidalgold;Immunochromatography1　前言

西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)是黄病毒科黄病毒属日本脑炎病毒血清群的成员,于1937年

在乌干达西尼罗省一名发热妇女血清中首次被分离。该病毒广泛分布于中东、西亚和非洲,由其引起的西尼罗病近年来在罗马尼亚、俄罗斯、美国等地均有过大规模爆发。WNV是虫媒病毒,主要通过库蚊传播,可感染人、马、猪、鸟等多种动物。人感染该病毒后,可出现从不能觉察的亚临床到发

[1]

热、致死性的脑炎等不同程度的临床症状,目前尚无有效的治疗方法和疫苗接种,一旦爆发流行,极易引起人们的恐慌,已构成全球公共卫生的威胁。为了解决WNV感染的诊断、流行病学调查和监测,亟需建立一种敏感、特异和快速的检测方法。

胶体金免疫层析试纸条法因其快速、简便,不需要大型装备,可以实现现场快速检测等特点,已成为目前传染病快速检测的研究热点。本研究中,笔者利用双抗原夹心法制备了检测WNV的胶体金

项目基金:国家公益性行业科研专项(200810162);国家质检总局科研项目(2007IK211,2008IK210)

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免疫层析试纸条,对阳性血清进行敏感性检测,并对健康人血清进行筛查,将检测结果与美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒比较,对试纸条特异性进行评价。2　材料与方法2.1　材料纯化的WNVNS1抗原、WNVNS1蛋白及其免疫兔血清均为本课题组制备,健康人血清来自丰台区疾病预防控制中心,氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸三钠(NaC6H5O7)购自Sigma公司,牛血清白蛋白(BSA)购自Roch公司,硝酸纤维素膜、玻璃纤维、滤纸等均购自Minipore公司,脱脂奶粉为伊利高蛋白脱脂高钙奶粉,WNVIgGELISA试剂盒购自Focus公司。2.2　方法2.2.1　抗原、将纯化的用5mmol/LPH8.0的PB4℃搅拌透析过夜。测浓度为1.8mg/ml。

将纯化的兔抗WNVNS1蛋白多克隆抗体溶液1mL用5mmol/LPH8.0的PB溶液500mL4℃搅拌透析过夜。测浓度为2.76mg/mL。2.2.2　器皿的清洁

先用洗洁精将玻璃器皿及转子的污物洗净,用自来水、蒸馏水冲洗、干燥,随后,将其放入酸缸中浸泡24小时,分别用自来水、蒸馏水、双蒸水冲洗3

～4遍,干燥后备用。2.2.3　胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法,制备25nm的胶体金。

具体操作方法如下:取100mL双蒸水,加热至沸腾,加入1mL1%的氯金酸,搅拌下准确加入1.5mL体积分数为1%的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色,续而转成黑色,随后逐渐稳定成酒红色,20min后停止加热。冷却至室温后4℃避光保存。2.2.4　胶体金溶液的最佳值确定取,分别用0.2mol/L065、7.0、7.5、8.0、8.

g/mLWNVNS1蛋白溶液..2

,静置10min后,加入100μL质量分数为10%为NaCl溶液,静置0.5h后观察胶体金颜色。胶体金颜色没有发生改变的最低pH值为胶体金溶液的最佳pH值。2.2.5　分光光度计测定法确定最低蛋白稳定量

在标记前,应首先测定能稳定一定量胶体金所需要的最小蛋白用量。将胶体金溶液调至最佳PH值,抗原经高速离心除去大的聚集物,用5mmol/LPH8.0的PB溶液稀释至0.2mg/ml,稀释后抗原与其它有关试剂按表1逐项操作,用分光光度计OD580测定。

表1　测定稳定胶体金最小蛋白计量

试剂

抗原(μL)缓冲液(μL)胶体金(mL)

试验管

110001

290101

380201

470301

560401

650501

740601

830701

920801

1010901

对照管

100(H2O)

01

摇匀,放置2min

10%NaCl(μL)

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

2.2.6　胶体金标记WNVNS1蛋白

璃纤维,吸收垫用吸水滤纸。以浓度为1.38mg/mL的兔抗WNVNS1蛋白多克隆抗体在硝酸纤维素膜

上划线作为质控带;以浓度为0.9mg/mL的WNVNS1蛋白在硝酸纤维素膜上划线作为检测带,参数μL/mm划线,指控带与检测带间距约为7mm。0.1

划线后,将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中孵育2h。将吸收垫、样品垫及结合垫、硝酸纤维素膜叠

将胶体金调至最适PH值,加入最低蛋白稳定

量的WNVNS1蛋白。静置5min后加入过量BSA封闭,离心,用0.01mol/LTris溶液重悬,低速离心去除聚集物,上清液即为胶体金标记的抗原。2.2.7　免疫层析试纸条的制备免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品垫和结合垫用玻

加,组装成完整的层析条,然后切割层析条,宽度

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3mm/条,干燥避光保存。2.2.8　样品处理液的制备

在5mmol/LPH8.0的PB溶液中加入1%NP40、0.25%脱脂奶粉,即为样品处理液。2.2.9　检测及结果判读

μL,在制备好的层析条的样品垫上手工加样6015min后,检测带和指控带都出现红色为阳性,只有

指控带出现红色为阴性,检测带和指控带均不显色,则为试剂失效,需换新的试纸条重测。2.2.10　对试纸条灵敏度评价

将WNVNS1蛋白免疫兔血清用样品处理液从1:10开始倍比稀释,用试纸条检测1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释度的样品。

将ELISA1:10,1:100,1:1000稀释,A

图21

:1:1000。

3.3.2　将Focus公司的WNVIgGELISA试剂盒中的阳性血清以样品处理液1:10,1:100稀释后检测,结果见图3。并将该阳性血清1:10,1:100,1:1000稀释后用ELISA试剂盒检测,将两种方法检测的灵敏度结果进行比较

。

试剂盒检测。

2.2.11　用试纸条对ELISA试剂盒中的阴性血清进行检测,将检测结果与美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒比较,对试纸条特异性进行评价。3　结果

3.1　最适标记胶体金PH值的确定

结果表明胶体金颜色未改变的最低pH值为7.0,因此胶体金标记WNVNS1蛋白的最适PH

为7。

3.2　最低蛋白稳定量结果

分光光度计测定结果,以OD值为纵坐标,蛋白质用量为横坐标做一曲线,见图1

。

图3　试纸条灵敏度检测2

结果显示:该试纸条检测试剂盒中阳性血清的

检测效价为1:10,ELISA试剂盒检测该阳性血清的

图1　分光光度计测定最低蛋白稳定量曲线图取曲线与横轴接近那一点的蛋白用量即为最小蛋白质稳定量,在此基础上再加20%即为稳定胶

μg/mL的NS1抗原体金蛋白质实际用量,即选择12

加入量作为实际最小蛋白标记量较为合适。3.3　试纸条灵敏度检测

3.3.1　将WNVNS1抗原免疫兔血清以样品处理

检测效价为1:100;试纸条的检测效价比ELISA试

剂盒的检测效价低一个滴度。3.4　试纸条特异性检测

将88份健康人血清和WNVIgGELISA试剂盒中的阳性和阴性血清用样品处理液1:10稀释后,用试纸条和ELISA试剂盒分别检测,结果见表2。表2结果显示:试纸条检测89份阴性血清,有9份检出阳性,特异性为89.89%,假阳性率为10.11%;用ELISA试剂盒检测89份阴性血清,结果

液1:10、1:100、1:1000稀释后检测,结果见图2

。 12

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有3份检出阳性,假阳性率为3.37%。两者符合率为86.52%。

表2　两种检测方法检测结果

ELISA

片,采用间接免疫荧光法检测健康人血清,结果假

阳性率为3.2%(11/347),以上实验说明人群对WNV有一定的免疫水平,用ELISA、间接免疫荧光

合计

胶体金

阳性阴性合计

134

阳性

97786

阴性

108090

法等血清学检测法检测WNV抗体,可能会出现一定的假阳性率。本实验选用Focus公司的WestNileVirusIgGELISA试剂盒做为对照,比较自行研制的胶体金试纸条的灵敏度和特异性。结果显示,对试剂盒中阳性血清的检测实验中,胶体金试纸条的检测效价比ELISA低一个滴度,特异性实验中,在检测89份阴性血清中,用试纸条检测的假阳性率为10.11%,略高于ELISA。

,但由

4　讨论　

本研究是以纯化的WNVNS1抗原为基础,将免疫层析方法的快速简便性与双抗原夹心方法不受检测抗体种类和第二抗体种属限制的通用性结合,建立的用于现场快速检测WNV感染的检测方法。该方法检测抗体血清不受血清种属来源的限制,与间接法比较不需要制备第二抗体,模动物宿主血清学调查;IgMWNV感染的。

随着人们对黄病毒科病毒的不断认识,黄病毒科病毒的NS1蛋白做为一种重要的非结构蛋白日

[2]

益受到关注,Schlesinger首先证明,用NS1蛋白免疫小鼠、恒河猴等动物,然后用致死量的病毒皮下攻击,被免疫的动物可以幸存,而未被免疫的动物全部死亡。已有研究表明,NS1蛋白具有多种T、B细胞抗原表位,能够诱发机体细胞免疫和体液免疫应答,并且发现在黄病毒科病毒感染的病人血清中存在高水平循环的NS1抗原和NS1特异抗体,这些研究结果为基于NS1的抗原抗体诊断奠定了基础。

目前国内外学者对WNV抗体的检测主要采用ELISA法,包括用IgM捕获ELISA法检测IgM和间接ELISA法检测IgG,目前Focus公司和PANBIO公司的商品化ELISA试剂盒已经上市,其中,Focus公司是使用重组的WNV蛋白做为包被抗原,而PANBIO公司是使用黄病毒(1,2,3,4型登革病毒)抗原包被,用以检测所有黄病毒属病毒的IgG抗[3][4][5]

体。因此,Malan和Tilley分别对这两种试剂盒进行了敏感性和特异性比较,结果PANBIO公司的试剂盒更灵敏,而Focus公司的产品更特异。研究者曾用Focus公司的该试剂盒检测过476份非黄病毒感染的血清,结果有46份出现阳性,假阳性率

[6]

为9.7%,张久松等用WNV感染细胞,制成抗原

,获得WNV阳,尽管我们研制的试纸条与纸条可以检出WNV阳性血清,并具有较一致的特异性,但更科学的试纸条评价结果还有待于更大的阳性样本的数据补充。总体而言,由于胶体金免疫层析法具有快速简便,不需要大型仪器的优点,本实验建立的WNV抗体检测胶体金免疫层析条为进一步用于口岸现场等需要快速诊断WNV感染提供了研究基础。

参考文献　

[1]　单爱兰.WNV病流行现状及控制[J].口岸卫生控制,2003,8

(3):37～40.

[2]　SchlesingerJJ,BrandrissMW,WalshEE.Protectionagainst

17Dyellowfeverencephalitisinmicebypassivetransferofmono2clonalantibodiestothenonstructuralglycoproteingp48andbyac2tiveimmunizationwithgp48[J].JImmunol,1985,135(4):2805

～2809.

[3]　何竞,张贺秋.WNV的生物学特性及实验室检测[J]　军事医

学科学院院刊,2007,31(1):78～82.

[4]　MalanAK,MartinsTB,HillHR,etal.Evaluationsofcommer2

cialWestNilevirusimmunoglobulinG(IgG)andIgMenzymeim2munoassaysshowthevalueofcontinuousvalidation[J].JClinMi2crobiol,2004,42(2):727～733.

[5]　TilleyPA,WalleR,ChowA,etal.Clinicalutilityofcommercial

enzymeimmunoassaysduringtheinauguralseasonofWestNilevi2rusactivity,Alberta,Canada[J].JClinMicrobiol,2005,43(9):4691～4695.

[6]　张久松,张泮河,詹琳,等.间接免疫荧光试验在WNV抗体检

测中的初步应用[J].中国人兽共患病杂志,2005,21(6),476～478.

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/xnn1.html