生物分离-双水相萃取实验指导

双水相萃取相图的绘制

1．实验目的

⑴掌握绘制双水相相图的方法 ⑵理解双水相形成条件和定量关系 2．实验原理

双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（VT/VB）不同。相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。

图1 双水相体系相图

3．实验材料及仪器

PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；PEG2000原液（0.4g/mL，密度1.02）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）。 4． 实验方法

准确称取2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。

1

以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。 5． 数据处理

表1 相图节点数据

序号 1 2 3 … n

PEG质量（g） …

体系中盐溶液（mL）

…

…

盐质量（g） 体系加水量

（g） 0 0.3 0.5 … 1.5

体系总质量（g） …

PEG质量分数（w/w）

…

盐质量分数（w/w）

…

双水相萃取牛血清白蛋白

1．实验目的

⑴掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法 ⑵了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数 2．实验原理

双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。与一般分离纯化技术相比，双水相萃取技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值等。 3．实验材料及仪器

PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；PEG2000原液（0.4g/mL，密度1.02）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）；牛血清白蛋白标准液（100μg/mL，pH8.0）；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂。紫外可见分光光度计。 4． 实验方法

4．1萃取牛血清白蛋白

标准曲线的绘制：按下表加入试剂。摇匀。放置2min后测定595nm吸光度值。以蛋白量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘出标准曲线。

2

管号 1（空白） 2

0.1

0.9 5 10

3 0.2 0.8 5 20

4 0.4 0.6 5 40

5 0.6 0.4 5 60

6 0.8 0.2 5 80

7 1 0 5 100

BSA标准液（mL） 0 蒸馏水（mL） 1.0 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 蛋白质量（μg）

0

萃取方法：取4 mL PEG储液和4mL硫酸铵溶液于干燥的10 mL刻度试管中，再加入1 mL牛血清白蛋白溶液，混匀，以少量蒸馏水调节体系总质量为10g，混匀，静置15min，读取上下相体积及总体积，再将其倒入分液漏斗使上下相分开，并分别测上下相蛋白浓度。 有关计算公式：分配系数m=Ct/Cb ,相比R =Vt/Vb，萃取率Y=目标相中的蛋白量/上下相中的总蛋白量。 5． 数据处理

5.1牛血清白蛋白标准曲线

5.2 不同相对分子量PEG/(NH4)2SO4体系萃取牛血清白蛋白

PEG平均分子量

1000 2000

分配系数

相比

萃取率

6.思考题

⑴如何利用双水相相图控制相比？

⑵PEG平均分子量及浓度、(NH4)2SO4浓度、pH值等因素如何影响双水相体系中被提纯物质的分配平衡？

双水相萃取AS1.398中性蛋白酶

1．实验目的

⑴掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法

⑵了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数 2．实验原理

双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。与一般分离纯化技术相比，双水相萃取技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、等。 3．实验材料及仪器

3

PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）；酪氨酸标准液（100μg/mL，pH7.5）；中性蛋白酶发酵液(培养基ABE离心上清液）。紫外可见分光光度计。 4. 实验方法

4．1萃取中性蛋白酶

标准曲线的绘制：按下表加入试剂。摇匀。放置2min后测定275nm吸光度值。以酪氨酸（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘出标准曲线。 管号

酪氨酸标准液（mL） 蒸馏水（mL） 酪氨酸（μg）

1（空白） 2 0 5 0

0.5 4.5 10

3 1.0 4.0 20

4 2.0 3.0 40

5 3.0 2.0 60

6 4.0 1.0 80

7 5.0 0 100

萃取方法：取4 mL PEG储液和5mL硫酸铵溶液于干燥的10 mL刻度试管中，再加入1 mL中性蛋白酶液，混匀，以少量蒸馏水调节体系总质量为10g，混匀，静置15min，读取上下相体积及总体积，再将其倒入分液漏斗使上下相分开，并分别测上下相酶活力。

1 mL上相或下相酶液(先于40℃水浴中预热3分钟)，加入1 mL 酪蛋白溶液（先40℃预热3分钟），摇匀，在40℃水浴中精确反应10min，立刻加入3mL 三氯醋酸，摇动，静置10min，滤纸过滤，用小试管收集滤液，放置10min。测A275。并作对照

有关计算公式：分配系数m=Ct/Cb ,相比R =Vt/Vb，萃取率Y=目标相中的蛋白量/上下相中的总蛋白量。 5.数据处理

5.1牛血清白蛋白标准曲线

5.2 不同相对分子量PEG/(NH4)2SO4体系萃取牛血清白蛋白

PEG平均分子量

1000 2000

分配系数

相比

萃取率

6.思考题

⑴如何利用双水相相图控制相比？

⑵PEG平均分子量及浓度、(NH4)2SO4浓度、pH值等因素如何影响双水相体系中被提纯物质的分配平衡？

附表1 相图的绘制实验耗材

实验耗材

PEG原液 硫酸铵原液 标签纸

每种原液每组各2mL

每组40mL

4张

实验耗材

25 mL具塞刻度试管

试管 移液管

4个/组 10个/组 1 mL 5个，2 mL2个

4

5 mL2个

附表2 萃取牛血清白蛋白实验耗材

实验耗材

PEG原液 硫酸铵原液 BSA溶液 考马斯亮蓝G-250试剂

标签纸 小烧杯

每种原液每组各4mL

每组10mL 每班100mL 每班500mL

4张 1个/组

实验耗材

10 mL具塞刻度试管 梨形分液漏斗

试管 移液管

4个/组 2个/组 10个/组

1 mL 5个，2 mL2个

5 mL2个

附表3 萃取中性蛋白酶实验耗材

实验耗材

PEG1000原液 硫酸铵原液 考马斯亮蓝G-250试剂 1%酪素（pH7.5磷酸缓冲）

三氯乙酸 标签纸

每班150mL 每班150mL 每班300mL 每班150mL 每班400mL 每班8张

实验耗材

10 mL具塞刻度试管 梨形分液漏斗

试管 烧杯 移液管

15个/组 2个/组 12个/组 1个/组

1 mL 5个，5 mL2个

5

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