科研界的新宠-crisprcas9

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 ...................................................................................................................................... 1

简介 ................................................................................................................................... 1

原理： ............................................................................................................................... 1

应用： ............................................................................................................................... 4

技术介绍： ....................................................................................................................... 6

技术优缺点： ................................................................................................................... 9

简介

CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA CRISPR RNAs（crRNAs）R( repeat) 与长CRISPR 簇，前导序列L( leader) cas。

Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。

原理：

此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA

复合物，此复合

物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 合蛋白及 RNA

1. CRISPR 的高度可变的间隔区的获得

首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间。

2. CRIPSR 基因座的表达()：

当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 前体，然后逐步被加工成小的成熟的3. CRISPR/Cas

crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，蛋白复合体，通过碱基互相结合，DNA 进行断裂和降解。

4.

寻找合适药但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。

2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不

同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果利用 CRISPR-Cas （肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R高效、快速的

CRISPR-Cas TALEN 等技术

DNA序列进行改造的遗

在预定的基因组位置切断DNA，

切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而

达到定点改造基因组的目的。

通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，

特异突变的引入和定点转基因。

基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾

病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。

技术介绍：

目前，来自 Streptococcus pyogenes 的 CRISPR-Cas9 系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA 两条单链。Cas9 首先与 crRNA 及 tracrRNA DNA，形成 RNA-DNA 复合结构，进而对目的DNA 使 双链断裂。由于 PAM

通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA （single guide RNA） 。融合的 RNA 具有与野生型 RNA 类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。 通过将表达 sgRNA 的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

基因敲除的实验过程

1、在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA并合成该序列。

2、将该序列以及cas9基因连入如图所示载体。

3、转化感受态，质粒小提，测序验证。

4、细胞培养与细胞转染

5、敲除效果检测。

6、建立稳定敲除的细胞株

Cas9质粒构建

虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见 addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供 CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而 CAS9 本身

分子量比较大（大于 4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。

技术优缺点：

CRISPR （）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS） Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和sgRNA。 他们将Cas9/sgRNA 与带ES细胞ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，而且可以在不同的位点同时引

由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

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