王雪娇 核酸的提取

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核糖核酸的提取分离

李玉辉 11生化制药

摘要：核糖核酸(RNA) 是一种遗传物质，因为分子由核糖核苷酸组成而得名。参与细胞蛋白质合成和免疫调节等生理活动。RNA及其降解物在药物开发、保健品和食品添加剂等领域具有良好的应用前景。本课题对啤酒废酵母的综合利用进行了研究,拟采用新工艺从啤酒废酵母中提取核糖核酸。在啤酒酵母中RNA 含量可高达6%～8%, 至今以废啤酒酵母提取RNA 作为生产RNA 的有效途径被广泛采用, 其具有工艺简单、成本低等优点, 但收率较低。采用改进的新工艺路线，及最佳工艺条件，能有效地从啤酒废酵母中提取价值较高的核糖核酸。

关键词：核糖核酸； 提取； 酵母发酵

核糖核酸(RNA) 普遍存在于动物、植物和微生物细胞内，与蛋白质生物合成有密切的关系。微生物来源的RNA 及其降解产物核苷酸在医药、食品、保健品及农业等领域均有重要的应用价值。20 世纪60 年代，日本开始研究通过培养富含RNA 的酵母来生产RNA， 经过不断改进培养方法，目前酵母发酵[1]生产RNA 的工艺已相当成熟。我国莆田糖厂利用富含RNA 的酵母工业化连续发酵生产RNA， 菌体RNA 含量可达到菌体干重的14%～15%年产量达到200 吨。我们主要综述利用富含RNA 的酵母发酵制备RNA 的研究进展及其应用。 一、核酸的概况

RNA纯品为白色粉末，有酸味，溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，具有吸收紫外光性质。RNA还是一种两性电解质，含有大量的酸基，因而它的等电点处在强酸性。

（一）RNA简介 1、RNA构成

核糖核酸由许多核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成，其主要组成核苷酸为腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸。

2、RNA的分类

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核酸是一种高分子化合物，普遍存在于生物细胞中，可分为两类，一类是脱氧核糖核酸，另一类是核糖核酸（缩写为RNA），作为多数生物细胞以及部分的病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA作为一类重要的生物大分子之一，在20世纪50年代左右才开始被人们所研究。RNA是具有重要生物学功能的另一种核酸，其含量在原核细胞中约占6%，在真核细胞中约占11%。RNA一般是单链的大分子，不构成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则，形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据RNA结构功能的不同，主要分三类，即rRNA， mRNA,tRNA.

3、RNA的功能

mRNA是依据DNA序列转录而成的蛋白质合成模板； tRNA是mRNA上遗传密码的识别者和氨基酸的转运者； rRNA是组成核糖体的部分，而核糖体是蛋白质合成的机械。

1.2 RNA 的应用

RNA是一类生命活动中极其重要的生物大分子，在生命中基因表达和蛋白质的生物合成起着不可或缺的作用，并且还能促进细胞的诸多生理功能。RNA在医药卫生、保健、农业生产、食品加工等行业的应用前景十分广阔[2]。

(1) 环保方面的应用

在环境保护方面，RNA也具有举足轻重的作用。RNA及其衍生物可以作为抗菌剂，是一种用来防治植物病毒的农药，这些农药对人体没有危害，对环境也没有污染。在环境问题日益敏感的今天，该药的开发和利用将会具有重要的社会价值和环境效益。

(2) 医药行业的应用

RNA除直接用于临床医学药物外，还是其它许多药物的前体。近年来，反义RNA的研究也引起了人们的广泛关注，大量研究表明：反义RNA能够准确高效地应用于靶细胞，有效的控制癌细胞的复制，应用前景广泛。

(3)卫生保健行业的应用

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随着人们年龄的不断增加，合成RNA的能力也会逐渐随之减弱。因此，人体内RNA以及组织结构成分的不足，就会使人产生各种衰老症状，身体容易疲劳，皮肤松弛，精神容易劳累等一系列现象，进而会引起机体免疫力下降，严重时会造成不可想象的后果[3]。

(4)食品工业的应用

RNA在食品行业也有广泛的应用，能够增强人的体质，延长寿命。鸟苷酸能赋予食品鲜味, 主要与肌苷酸和谷氨酸一起用作增强食品风味的食品添加剂。

二 酵母发酵法制备RNA

2.1 啤酒废酵母提取RNA 的研究现状

2005 年许宁等在常温下采用淡盐提取核糖核酸，与常规的低温浓盐法相比，在保证较高回收率的前提下，缩短了生产周期，降低能耗，回收的核糖核酸产品纯度大于90%，浊度小于20%，用该方法提取核糖核酸，并同时回收脱核酵母后，酿造工序废水的BOD 和COD 均有较大幅度的降低。2008 年李珊，吴振强采用盐法提取啤酒废酵母RNA 进行研究，用方差分析处理，实验结果表明：酵母浓度8%，抽提温度95 度，抽提时间6 小时是提取啤酒废酵母RNA 的适宜条件，并将其用于啤酒厂废酵母泥的RNA 提取试验，得率为3.23%。得出盐法优化工艺提取啤酒废酵母干粉中的RNA，得率达1.64%左右，与常规盐法提取相当。

核糖核酸和它的降解物核苷酸、核苷[4]及其衍生物都是生物化学和医学研究中的宝贵试剂。目前，从微生物中提取核酸的方法主要有盐法、稀碱法、机械法、氨法、自溶法、酶法等。

2.2核糖核酸的提取

稀盐法提取核糖核酸的原理： 稀盐法[5]提取核糖核酸是基于改变酵母细胞的渗透压，加热使细胞自身破裂而释放出核糖核酸。当菌体外盐浓度高，细胞内盐浓度低时，细胞内的水分就向细胞外渗透，细胞内物质浓度不断上升，渗透压不断升高，当达到一定值时，细胞就会自身破裂，而释放出核酸。利用核酸溶于水和在等电点溶解度最小的性质，调节PH 值，使其从溶液中沉淀下来，洗涤离心收集，得核糖核酸。盐法操作方法简单，且易控制，提取后的废水中不会产生二次污染，可以循环使用或用于生产酵母。

（1）提取核酸的工艺流程图

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（2）核酸提取工艺流程

首先酵母用2—3℃冰水，水洗3—4 次，沉淀1—2 天，倾去上层水，取少量烘干，测含干酵母量，一般约含16% ，用500 毫升烧杯装入温酵母50克，按事先计算的定容体积加入6%的食盐和90℃以上的温水，定容成6%浓度的酵母乳液，调PH6.5，放入水浴锅内，迅速升温，避免在20—70℃之间停留长时间，以防止磷二脂酶的降解，而影响收得率，搅拌30 分钟，90℃保温2.5 小时（90℃保温一段时间能使上述分解核酸的酶类破坏，有利于提取较多的大分子核酸；另外，加热的另一个作用是使蛋白质变性，同酵母

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残渣一起沉淀除去）。取出加水25 毫升，冷却离心，上清液于20℃左右加氯化钙1%，用盐酸调PH1.5（核酸在等电点沉淀）沉淀离心即得核糖核酸泥，为了进一步提高核酸纯度，除去上清液中与核酸结合的蛋白质及其

他混浊成份，采用甲壳素絮凝剂核酸泥用2—3 倍乙醇洗涤二次，烘干（60-70℃烘干，不宜高于80℃ ，若超过80℃ 干燥产品的颜色发红，而且不易溶解）。粉碎得成品，经紫外吸收分光光度法在260 纳米波长处测定核酸含量。

第三章 RNA的发展前景

RNA 不仅在基因表达和蛋白质的生物合成中起着不可或缺的作用，而且还能促进细胞的诸多生理功能。随着社会老年化的发展趋势, 具有抗衰老作用的核酸类保健品会更加引人注目，社会的发展以及生命科学的快速研究，使得人们对 RNA 的结构与功能的认识越来越清楚。但由于目前RNA 产品的质量和价格因素, 限制了它的使用。采用现有的酵母发酵提取RNA 的工艺, 可得到较高的RNA 产量, 是生产RNA 及相应核苷酸的有效途径[6]。各个方面的研究不断深入，RNA 在医药、卫生保健品、环境保护以及农业等各个方面都具有十分广泛的应用。因此，研究RNA 均有重要的现实意义。

结论：

利用培养富含RNA 的酵母来生产RNA 的工艺, 具有如下优点: ①酵母菌体中RNA 含量普遍高于其他微生物, 且大大高于DNA 含量②酵母菌体较易收集, 且RNA 提取容易; ③能够得到大量纯度高、浊度低的优质RNA[18];④酵母可以连续培养; ⑤酵母培养容易, 对培养基的要求极低;⑥提取RNA 后的脱核酵母可作为优质的蛋白饲料。目前，从微生物中提取核酸的方法主要有盐法、稀碱法、机械法、氨法、自溶法、酶法等，盐法以其提取条件温和成本低的优点，应用比较广泛。

参考文献：

[1] 张光颖,梁世中，高孔荣.固定化酵母连续发酵生产香蕉酒的研究[J].食品与发酵工业,1992（4）：32-35.

[2] 朱才庆, 应汉杰,欧阳平凯, 等. 核糖核酸的应用与制备[J]. 南京化工大学学报, 2001,23(4):97- 100.

[3] 刘润芝,印大中. 我国核酸和核酸保健品抗衰保健研究进展[J]. 激光生物学报, 2003,12(4):315- 317.

[4]朱俊东,黄国荣,糜漫天,等.啤酒酵母中提取核糖核酸的研究[ J].食品科学,

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2006, 27 (2): 160 -162.

[5]张帅.从啤酒酵母中提取RNA的研究[ J].酿酒, 2005, (3): 66-6

[6]曹凯鸣,李碧羽,彭泽国,等.核酸化学导论[M].上海:复旦大学出版社, 1991.

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