磷脂酶

火腿中肌肉磷脂酶的纯化其性质研究

国外一些研究者认为，在干腌火腿生产过程中，中性脂肪变化很小，而磷脂是脂肪水解的主要底物。我们对发酵干火腿加工过程中的脂肪水解状况进行了分析，也证实了这一观点，因此磷脂水解酶成为了研究干腌火腿脂肪水解机理的关键。

本研究利用阴、阳离子交换、亲和层析等多种纯化手段相结合获得了2种电泳纯的磷脂水解酶。由于某些脂酶也具有水解磷脂的能力，我们首先需要弄清楚本研究中以磷脂为底物获得的磷脂水解酶是属于脂酶还是磷脂酶？如果是磷脂酶，和已从其它组织中纯化出来的磷脂酶有什么关系？另外，腌制剂、加工工艺条件等对该酶活有什么影响？为此，本研究对已纯化的磷脂水解酶的基本性质进行了鉴定，旨在为发酵干火腿生产过程中与脂肪水解氧化等有关的风味化合物的产生机理及其控制提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 磷脂水解酶的分离

按汪家政等（2002）方法进行。 1.2 磷脂水解酶活性的测定

用同位素标记底物法对纯化的酶活进行测定 具体操作流程：

0.2 ml 粗酶液 + 5 μl磷脂底物

反应（37℃, 20分钟）

冰浴并向反应体系中加入2 ml甲苯、三氯甲烷和甲醇的混合物

（1:0.5:1.2，v/v/v）

使反应终止。加40 μl浓度为1mol/L的NaOH溶液，确保碱性体系

2,000×g 离心10 min

取0.2 ml上层无机相于闪烁瓶

加入4 ml 闪烁液，混匀 用液闪仪测量放射强度

1.3 磷脂水解酶的纯化制备 纯化流程如图所示：

浓缩粗酶液

DEAE-Sephacel阴离子交换层析

Blue-sepharose 6 F.F. SP-sepharose F.F.阳离子 染料亲和层析 交换层析

Heparin-sepharose CL-6B Heparin-sepharose CL-6B

亲和层析 亲和层析

纯化的磷脂水解酶１ Blue -sepharose 6 F.F.

染料亲和层析

纯化的磷脂水解酶２

（所有步骤均在4℃下操作。以大豆磷脂为底物监测每步骤的总活、比活、纯化倍数、收率。同时，利用SDS-PAGE对纯化过程中蛋白的变化进行监测）

1.4 磷脂水解酶的性质鉴定

（1）SDS-PAGE电泳法测定酶的分子量 （2）动力学测定

配制不同浓度的底物，在pH 8.5，40℃的条件下，测定磷脂水解酶的反应初速度。

（3）水解4-methylumbelliferyloleate 荧光底物活性

以4-methylumbelliferyloleate为底物检测磷脂水解酶的水解活性。具体方法如下：反应混合物包括0.2 ml酶液，0.1 ml 1mM 4-methylumbelliferyloleate和2.7 ml反应buffer（220 mM Tris-HCl,含5 mg/ml 牛血清蛋白和10 μg/ml heparin，pH为8.0）。 在37 ℃保温45分钟后添加0.5 ml的1 N盐酸溶液使反应终止。荧光的测定采用RF－5000 荧光分光光度计，激发波长/放射波长为328/470 nm，做4个重复。单位酶活U定义为在37℃释放1 nmol 4-methylumbelliferone/h, 比活表示为U/g蛋白，蛋白的浓度用Lowry法（1951）测定。

（4）气相色谱法判断A1、A2活性

采用高纯度的单一磷脂（1-棕榈酸，2-花生四烯酸卵磷脂，Sigma）为底物，40℃反应20分钟后加入2 ml氯仿－甲醇混合物（2:1, v/v）

提取未反应完的磷脂及反应生成的游离脂肪酸，然后分离游离脂肪酸，甲酯化后进气相色谱分析。 （5 ）磷脂水解酶的同源性分析

用胰蛋白酶对磷脂水解酶1和2进行胶内酶解，同时捕捉肽段，通过基质辅助激光解析飞行时间质谱法得到肽质量指纹图谱，用AutoMS-Fit软件查询NCBInr数据库，将所得的肽质量与数据库中理论肽质量相配比。

（6）温度对磷脂水解酶2活性的影响 （7）pH对磷脂水解酶2活性的影响

（8）各种激活剂和抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响 （9） 金属离子对磷脂水解酶2活性的影响 （10）腌制剂对磷脂水解酶2活性的影响

2 结果与讨论

2.1 磷脂水解酶的纯化制备

（一 ）DEAE-Sephacel阴离子交换层析

A2802.521.510.5洗脱时间(min)0501001502002503009080701 2 3 4 6050403020100

002040收集管号电导酶活60UV80图1 DEAE-Sephacel阴离子交换层析

将粗分离获得的浓缩粗酶液用buffer A进行透析，上

酶活(units/ml)电导(ms/cm)DEAE-Sephacel阴离子交换柱，并对存在蛋白的各收集管以磷脂为底物进行磷脂水解酶活性测定，结果见图1。在低离子强度和高离子强度分别检测到1个具有磷脂水解酶活性的峰，说明在猪后腿中至少存在两种磷脂水解酶。分别收集2个活性峰进行后续的分离纯化操作。为了描述的方便，本实验中将低离子强度下洗脱下来的蛋白峰中所含的磷脂水解酶简称为磷脂水解酶1，高离子强度才可洗脱下来的简称为磷脂水解酶2。

利用SDS-PAGE电泳技术，对收集到的活性峰进行电泳分析（图2），结果发现，大部分蛋白仍然存在于低盐峰，高盐峰中蛋白种类虽多，但大多数都是小细带。

此外，由图1可知，低盐峰由3个蛋白峰所组成。事实上，这3个峰的收集液感官差别很大：峰1的收集液为白色乳浊液，可能含有大量的低盐不溶性蛋白；峰2为澄清透明的溶液；峰3为红色溶液。对后2个具有磷脂水解酶活性的低盐蛋白峰分别进行SDS-PAGE电泳，结果见图3。从电泳图可以看出，这2个峰的蛋白差异很大，考虑到这2个峰中可能存在的不是同一种磷脂酶，故分开收集。但前3个峰之间存在很大程度的重叠，所以收集到的未发生重叠的峰2和峰3组分的量非常少。

泳道 A B C A B

图2 DEAE-Sephacel阴离子交换后电泳图谱

A: 粗提液；B:峰4；C:峰2+峰3 图3 DEAE-Sephacel阴离子交换后电泳图谱

A: 峰2；B:峰3

（二） 磷脂水解酶１的进一步纯化

（1）磷脂水解酶1的SP-sepharose F. F.阳离子交换层析

将上述DEAE-Sephacel阴离子交换层析后收集到的峰2部分，浓缩后，对20 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）进行透析，透析后的样品上SP-sepharose F. F.阳离子交换层析柱，结果显示，高离子强度时洗脱下来的是活性峰（图4）。

0100洗脱时间(min)20030021.81.61.41.210.80.60.40.20020电导40收集管号酶活60UV80400706050403020100

A280

图 4磷脂水解酶1的SP-sepharose F. F.阳离子交换层析

（2）磷脂水解酶1的 Heparin-sepharose亲和层析

A280图4 磷脂水解酶 1 的sp-sepharose F.F. 阳离子交换层析 洗脱时间(min)032.521.510.505010015020025030035080705040302010005101520收集管号电导酶活253035

UV图 5 磷脂水解酶1的Heparin-sepharose亲和层析

酶活(units/ml)电导(ms/cm)60酶活(units/h)电导(ms/cm)上述SP-sepharose F. F. 阳离子交换层析中的活性峰，透析后上Heprin-sepharose亲和层析柱。结果表明（图5），当洗脱缓冲液的电导为15 ms/cms时，即NaCl浓度约为150 mmol/L时，出现1个活性峰。由于洗脱液中没有加肝素，说明该磷脂水解酶和肝素之间是非特异性结合，此时肝素亲和层析柱实质上相当于1个阳离子交换柱。

（3） 磷脂水解酶１的Blue-sepharose 6 F. F.染料亲和层析

050洗脱时间(min)100150200100908070605040302010005101520收集管号电导酶活25UV3035

A2800.40.350.30.250.20.150.10.050

图 6磷脂水解酶1的 Blue染料亲和层析

收集肝素亲和柱的活性部分，进行Blue-sepharose 6 F. F. 染料亲和层析，在电导为8 ms/cm左右时得到1个活性峰（图6）。SDS-PAGE电泳结果表明（图7），这时活性峰的前几管中基本上只存在1种蛋白，即得到了电泳纯的目的蛋白－磷脂水解酶1。 对磷脂水解酶1的分离纯化过程进行总结（表1）：

酶活(units/ ml)电导(ms/cm)

表1 磷脂水解酶1的纯化表

匀浆粗提酶液 DEAE阴离子 SP阳离子 肝素亲和 Blue染料亲和

总蛋白（mg） 总活（unit） 比活（unit/mg）

3550 320 223 28 0.3

29110 13540 11400 2607 298

8.20 42.31 51.12 93.11 993.33

纯化倍数

1 5.16 6.23 11.35 121.14

收率 (%) 100 46.51 39.16 8.96 1.02

Kda

97 66 45 36 20.1 14.2

泳道 A B C D E

图 7 磷脂水解酶1不同纯化阶段的 SDS-PAGE图谱 （三） 磷脂水解酶2的进一步纯化

A: 粗提液； B：DEAE-Sephacel柱洗脱下的活性峰2； C: Sp-Sepharose F.F.后收集的活性部分

Heparin-sepharose CL-6B后收集的活性部分；E: Blue -sepharose 6 F.F.后收集的活性部分； （D1：）磷脂水解酶2的Blue-sepharose 6 F. F.染料亲和层析 F: 低分子量蛋白标准 分离胶浓度: 15%

收集DEAE阴离子交换层析中高盐活性峰的主要部分，通过Blue-sepharose6 F. F.染料亲和层析，并对各收集管进行活性测定。结果表明（图8），活性峰存在于在低盐峰的后半部分，由于这部分蛋白浓度相对比较低，因此磷脂水解酶2的比活得到了很大程度的提高。

A28001.61.41.2150洗脱时间(min)100150200908070605040302010005101520收集管号电导酶活25UV3035

0.80.60.40.20 图8 磷脂水解酶2的 Blue-sepharose亲和层析

（2 ）Heparin-sepharose CL-6B亲和层析

洗脱时间(min)

0.30501001502008070酶活(units/ml)电导(ms/cm)

A2800.250.20.150.10.056050403020100051015收集管号电导酶活20UV2530

0图 9磷脂水解酶2的Heparin-sepharose CL-6B亲和层析

为进一步纯化，收集Blue-sepharose 6 F. F. 染料亲和层析柱的活性峰，进行Heparin-sepharose亲和层析。低盐部分的第2个蛋白峰为活性峰（图9），SDS-PAGE电泳结果表明（图4-10），这时活性峰的前几管中只存在一种蛋白，即得到了电泳纯的目的蛋白－磷脂水解酶2。

酶活(units/ml)电导(ms/cm)

泳道 A B C D E F

kDa 97.0 66.0

45.0

36.0

图 10 磷脂水解酶2不同纯化阶段的 SDS-PAGE图谱

A: 粗提液； B：DEAE-Sephacel柱洗脱下的活性峰2； C: Blue -sepharose 6 F.F. 后收集的活性部分；

D-E：Heparin-sepharose CL-6B后收集的活性部分； F:低分子量蛋白标准 分离胶浓度: 9%;

对磷脂水解酶2的分离纯化过程进行总结（表2）：

表2 磷脂水解酶2的纯化表

匀浆粗提酶液 DEAE阴离子 Blue亲和 肝素亲和

总蛋白（mg） 总活（unit） 比活（nit/mg）

3550 410 30 1.2

29110 16605 10836 2223.84

8.2 40.5 361.2 1853.2

纯化倍数

1 4.94 44.05 226.00

收率（%）

100 57.04 37.22 7.64

这部分内容直接列出了最终的纯化方案。事实上，确定最终方案之前经过了大量的条件筛选实验，包括层析填料的种类、洗脱液的种类、pH、离子强度以及层析顺序等。本文不进行一一赘述，但简单说明层析填料的选择：1) 凝胶过滤又称分子筛是一种利用分子量的差异分离纯化蛋白质的重要方法之一，Audley等人只通过Sephadex

G-50一步柱层析就从鱼肌肉中获得了分子量为14kD的纯的磷脂酶A，在蛇毒（张维文等, 2000）磷脂酶A2的分离纯化工作中，分子筛也起到了至关重要的作用。但分子筛Sephacryl S100 在本实验中表现出较差的分离效果，整个洗脱过程都能检测到磷脂水解酶活性的存在；SDS-PAGE电泳结果也显示，最先流出的洗脱液和最后流出的洗脱液中蛋白质条带的差别很小，这说明目的蛋白之间以及目的蛋白和杂蛋白之间的分子量差异不足够大，因此不适合采用分子筛法从猪骨骼肌中分离纯化磷脂水解酶。2) 本研究中比较了2种阴离子交换层析填料（DEAE Sephacel和DEAE-Sephadex A50）的分离效果。结果显示，DEAE Sephacel对低盐峰的分离效果较好，而DEAE Sephadex A50对分子量为66kDa的磷脂水解酶的富集效果更佳，但DEAE Sephadex A50在高盐洗脱时性质不稳定，所以综合考虑选用DEAE Sephacel。3) Hazen等（1990）从犬心肌胞液中纯化磷脂酶A2时采用羟基磷灰石作为填料获得了良好的分离效果，本研究也进行了尝试，但纯化效果不是很理想且该填料柱流速极低，因此没有采用。4)过Con A Sepharose层析柱时，目标蛋白没有被吸附，说明目标蛋白不具有糖侧链。

3.2 磷脂水解酶纯度和分子量的鉴定

kDa 94.0 66.2 45.0 36.0 29.0 20.1 泳道 A B C D E 图11 纯化的磷脂水解酶ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳

A:低分子量蛋白标品; B: 经还原处理后的纯化磷脂水解酶1; C: 非还原处理的纯化磷脂水

解酶1；D：非还原处理的纯化磷脂水解酶2；E：经还原处理后的纯化磷脂水解酶2

SDS-PAGE结果见图11。经染色后,样品在还原和非还原条件下均为1条带,说明样品较纯。以低分子量蛋白标品做标准曲线，根据样品在还原条件下电泳条带的相对迁移率,通过标准曲线计算出磷脂水解酶1的分子量为37.2 kDa，磷脂水解酶2的分子量为65.8 kDa。磷脂水解酶2在非还原条件下泳动速度较慢,电泳条带位置也相应比较靠后,Tsai等（1995)也曾报道蛇毒磷脂酶A2在非还原条件下会发生聚集或泳动较慢的现象。 3.3 磷脂水解酶的动力学测定

从图12和图13可以看出，磷脂水解酶1和磷脂水解酶2的动力学曲线非常相似，在底物浓度低于2 mmol/L时，酶活缓慢增加；而当底物浓度大于2 mmol/L时，酶活剧增；但超过4 mmol/L时，酶活不再增加即底物浓度达到饱和。磷脂水解酶不符合标准的动力学曲线，1/V和1/S不呈直线关系，无法用双倒数法求得Km值和Vmax值。这可能是脂酶和磷脂酶所特有的形式，因为他们的反应速度不仅取决于底物浓度，底物的构造/排列方向对酶活性的发挥也有着及其重要的影响（Verger,1980）。当磷脂溶液的浓度达到最小胶束浓度（critical micellar concentration, CMC）时，磷脂分子将定向排列形成胶束，这种定向排列有助于酶和底物的相互接触，相当于提高了底物的有效浓度从而使酶活得到大幅度的提高（Verger, 1980）；另一个原因是当磷脂酶A与单层或分散的底物结合时，其构象几乎没有变化，酶活性很低，但与聚集的分子结合时其三维构象发生变化，形成易变螺旋，酶活性很高(Gurr & Harwood, 1991)。曾经证明，使用胶束状态的底物时胰脂酶和磷脂酶A2的水解活性比单体底物时高103-104倍（Volwerk et al., 1982）。

70反应速度（nmol/h）605040302010002底物浓度（mM)46

图12 磷脂水解酶1的动力学曲线 40反应速度（nmol/h)3020100-100123底物浓度（mM)456

图13 磷脂水解酶2的动力学曲线

3.4 水解4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性

一般情况下测定脂酶活性时采用4-methylumbelliferyloleate为底物，但该底物专一性不是很强，磷脂酶也能水解。测定这个性质可帮助判断本研究中纯化所得的磷脂水解酶是脂酶还是磷脂酶，因为虽然具有4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性不一定是脂酶，但若不具有该底物活性则一定不是脂酶。测定结果表明，磷脂水解酶1不能水解4-methylumbelliferyloleate荧光底物，磷脂水解酶2水解该荧光底物的比活为32 U/g蛋白质。这个结果意味着磷脂水解酶1肯定不是脂酶，而磷脂磷脂水解酶2既可能是脂酶也可能是磷脂酶。

3.5 气相色谱法测定磷脂水解酶的磷脂酶A1、A2活性

采用高纯度的单一卵磷脂（1-棕榈酸，2-花生四烯酸卵磷脂，Sigma）为底物，用气相色谱分析反应生成的游离脂肪酸的种类和数

量，从而判断A1、A2活性。磷脂水解酶1和2的测定结果见3，由表中可知，本研究中纯化所得的2种磷脂水解酶都同时具有磷脂酶A1和A2的活性，且A1活性要大于A2活性（A1活性分别约为A2活性的5倍和23倍）。磷脂水解酶1的A1活性略低于磷脂水解酶2，但A2活性约为磷脂水解酶2的3倍。

表3 气相色谱法测定磷脂水解酶的A1、A2活性

磷脂水解酶1

磷脂水解酶2

A1活性

（nmol棕榈酸/h）

585 752

A2活性

（nmol花生四烯酸/h）

105 33

3.6 磷脂水解酶同源性分析

采用肽质量指纹图谱技术（peptide mass fingerprint，PMF），分析目标酶和NCBInr数据库中其它来源的磷脂酶或脂酶的同源性。结果显示，磷脂水解酶1和天竺鼠中脂蛋白脂酶的匹配度约为22%；在数据库中没有找到和磷脂水解酶2相匹配的蛋白。这种情况出现的可能原因之一是在微量分析水平下目的蛋白质的片段覆盖率不够高，在MALDI条件下目的肽片段响应值太低。实验已证实在MALDI条件下C端为Lys的肽(Lys-肽)在质谱分析中的离子信号强度明显低于C端为Arg的肽(Arg-肽)，若胰蛋白酶消化片段中Lys-肽占主导，则会造成质谱信号的信噪比降低，从而减弱蛋白质的片段覆盖率；另外，蛋白质的共迁移使得在一个蛋白质点中可能存在两种或多种蛋白质，因而产生复杂的酶解片段， 使得其解析变得困难；除此之外，当所鉴定的蛋白质发生了翻译后修饰，而该信息并未包含在数据库中，或者是所分析的样品蛋白质本身就是一个新型的蛋白质， 所以在数据库中搜寻不到相匹配的目的蛋白质。资料检索显示，目前还没有研究者从哺乳动物骨骼肌中获得纯化的磷脂酶，NCBInr数据库中不存在骨骼肌磷脂酶的序列，而不同组织来源磷脂酶的同源性很低（杨建东等，2002），因此磷脂水解酶2很可能为一种新的磷脂酶；而磷脂水解酶1由于和天竺鼠中脂蛋白脂酶的匹配度约为22%但和猪中脂蛋白

没有同源性，无法做出判断。 3.7 温度对磷脂水解酶2活性的影响

35酶活（units)3025201510010203040温度（℃）50607080

图14磷脂水解酶2的最适反应温度

由最适反应温度图14可知，磷脂水解酶2的最适反应温度在40℃左右，与目前报道的猪骨骼肌磷脂酶的最适反应温度值42℃非常接近（郇延军等，2005），Audley（1978）从鱼肌肉中纯化的磷脂酶A的最适反应温度范围也为37-42℃。在干腌火腿的腌制阶段，温度较低（约4℃），但磷脂水解酶2的活性仍然高达最适反应温度时的56％，说明低温并不能很好的起到抑制磷脂水解酶2活性的作用，这或许是干腌火腿加工前期磷脂剧烈水解的原因之一。 3.8 pH对磷脂水解酶2活性的影响

300250酶活（units)200150100505678pH91011图15磷脂水解酶2的最适反应pH

在pH为5.5-10.5的范围内测定磷脂水解酶2的活性，由图15

可知，磷脂水解酶2在这个pH范围内均有活性，最适反应pH为8.5。在碱性范围pH 7.5-9.5酶活很高，分别为最大活性的86％和91％，而在pH为5.5时，仅为最大活性的30％左右。在对兔骨骼肌(Alasnier et al., 2000)、鱼骨骼肌(Audley et al., 1978)以及各种动物的心肌 (Wolf & Gross, 1985; Nalbone & Hostetler, 1985; Cao et al., 1978; Hazen, Ford & Gross, 1991) 的研究中都得到了类似的结果。一些研究者在心肌溶酶体中也发现了酸性磷脂酶（AGrynberg et al., 1988; Franson, Waite & Weglicki, 1972），但活性要比碱性磷脂酶A低得多。目前我们无法确定猪腿肌肉中是否存在酸性磷脂水解酶，因为酸性磷脂水解酶和碱性磷脂水解酶的活性pH范围存在重叠区，除非将溶酶体部分单独提取出来进行磷脂酶活性测定，以证实酸性磷脂酶的存在。

3.9 激活剂、抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响

为了帮助判断磷脂水解酶2的类别，本实验考察了一些典型的磷脂酶A或脂酶的激活剂或抑制剂对磷脂水解酶2活性的影响。

NaF为脂酶的抑制剂。向反应体系中添加100 mmol/L NaF时，肌肉粗提液中磷脂水解酶的活性降低40％左右，且随着NaF浓度的增加，逐渐降低（图16）。这说明了两种可能性：第一，猪骨骼肌中脂酶参与了磷脂的水解；第二，高浓度NaF对猪骨骼肌中磷脂酶活性也具有一定的抑制作用。由图16可知，NaF对电泳纯的磷脂水解酶2也表现出了抑制作用，和肌肉粗提液不同的是100 mmol/L NaF对磷脂水解酶2的活性没有抑制作用。这个结果很难解释，如果因为NaF对磷脂水解酶2具有抑制作用，将其判断为脂酶，那我们将无法解释100 mmol/L NaF不对脂酶表现出抑制作用。所以很有可能上面提到的假设2正确，磷脂水解酶2是一种磷脂酶而不是脂酶。 120100 相对酶活(%)8060402000100200300400NaF浓度（mmol/l)纯磷脂水解酶2500600肌肉粗提液

图16 NaF对磷脂水解酶2活性的影响

250200相对酶活（％）15010050

00102030405060ATP浓度（mmol/l)肌肉粗提液纯磷脂水解酶2图17 ATP对磷脂水解酶2活性的影响

ATP是胞液磷脂酶A2（cPLA2）的激活剂。用ATP处理活化cPLA2

时，能促进丝氨酸残基的磷酸化，从而使cPLA2的活性增加约2倍。从图17可知，向反应液中加入10 mM ATP时，肌肉粗提液中磷脂水解酶活性增加为原来的176％，ATP浓度大于10 mM时，随着ATP浓度的增加，磷脂水解酶活性呈缓慢上升趋势。对于电泳纯的磷脂水解酶2来说，5 mM 的ATP对酶活没有作用，10 mM 的ATP能使酶活增加50％左右，但50 mM 的ATP对酶活有轻微的抑制作用。这种现象说明磷脂水解酶2的催化机制可能类似于cPLA2。

钙离子是磷脂酶A2分类的重要依据，Ⅰ-Ⅲ 型磷脂酶A2功能的发挥需要mM级的钙离子，Ⅳ型磷脂酶A2功能的发挥（转位于膜时）需要μM级的钙离子，另外一类为钙不依赖性。加入不同浓度的钙离子，肌肉粗提液中磷脂水解酶的活性不仅没有提高反而受到不同程度的抑制，说明猪骨骼肌中不存在Ⅰ-Ⅳ 型磷脂酶A2，或存在但不起主要作用。磷脂水解酶2的活性也没有因为钙离子的加入而表现出显著性提高，因此，磷脂水解酶2为钙不依赖性。

130110相对酶活(%)907050046CaCl2浓度（mmol/l)肌肉粗提液纯磷脂水解酶228200

相对酶活（％）

150100a b b 50001DTT浓度（mmol/l)5图18 DTT对磷脂水解酶2活性的影响

DTT为巯基激活剂。由图18，1 mmol/L DTT对磷脂水解酶2没有作用，但5 mmol/L DTT对磷脂水解酶2具有明显激活效果，使酶活性增加50％左右。资料显示，DTT对Ⅰ型和Ⅱ型磷脂酶A2具有明显的抑制作用，而cPLA2对DTT不敏感（杨在清等，1996），因此，再次证明了磷脂水解酶2不是Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型磷脂酶A2。 3.10 金属离子对磷脂水解酶2活性的影响

200

相对酶活（%)150100500EDTANa2Cu2+Mg2+Fe2+Fe3+ 1mM5mM 图19属离子对磷脂水解酶2活性的影响 Fe2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+和Zn2+ 以及Na2EDTA都对磷脂水解酶2的活性具有激活作用，使活性增加约50%，且1 mM和5 mM的浓度之间无显著性差异（图19本实验结果与范礼斌等人（1996）的研究结果差异较大，他们研究了金属离子对蛇毒磷脂酶A2的影响，认为K+ 增加磷脂酶A2的酶活性，而其它二价金属离子不同程度的抑制酶的活性，特别是Cu2+使酶的活性几乎完全丧失。这可能是不同来源的磷脂酶A同源性很低，性质差异较大的原因。 3.11 腌制剂对磷脂水解酶活性的影响

干腌火腿的腌制剂主要由食盐、硝酸盐和亚硝酸盐等组成，某些成分可能会对酶活产生一定的作用。本研究分析了不同浓度氯化钠、硝酸钠和亚硝酸钠对磷脂水解酶2活性的影响，添加量参考干腌火腿加工时的实际添加量并适当外延。

由图20可知，NaCl对磷脂水解酶2有显著的抑制作用（P<0.05），4%的盐浓度可将酶活性降至76%，随着盐浓度的增加抑制作用缓慢增强。Motilva & Toldra（1993）研究了NaCl对猪肌肉和脂肪组织中脂肪水解酶活性的影响，研究发现NaCl对各种脂酶的作用各不相同：对肌肉酸性脂酶有强烈的激活效果，当NaCl浓度为6-8％时，酸性脂酶的活性增加到原来的3倍左右；而对肌肉中性脂酶则表现出强烈的抑制作用，6%的NaCl甚至可以完全抑制肌肉中性脂酶的活性；肌

Zn2+对照肉中碱性脂酶的活性几乎不受盐含量的影响。脂肪组织中脂酶的情况和肌肉中正好相反，碱性脂酶受到NaCl的抑制而中性脂酶不受影响。本研究结果和郇延军等（2005）的结果存在较大差异，他们研究了NaCl对猪骨骼肌中磷脂酶的作用，发现NaCl能提高磷脂酶的活性，在NaCl含量为9.6%时，酶活达到最大值。分析其原因，可能是因为他们研究的是酸性磷脂酶，而酸性磷脂酶的性质可能和酸性脂酶相似。

10090相对活性（％）807060504030对照4681012NaCl含量(%)图20 Cl含量对磷脂水解酶活性的影响 140120 相对酶活（％）1008060402000306090120150亚硝酸钠含量（mg?kg-1）

图21 硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响 图22 亚硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响 本实验范围内的亚硝酸钠浓度对磷脂水解酶2的活性无显著性影响（图21），含量超过100 mg〃kg-1的硝酸钠对磷脂水解酶2的活

性有轻微的激活作用（图23）。在干腌火腿中亚硝酸钠的最大残留量不足10 mg〃kg-1，硝酸钠的最大残留量也低于50 mg〃kg-1（郇延军等，2005），如此低量的情况下，硝酸钠和亚硝酸钠对磷脂水解酶2的作用都可忽略不计。

15014013012011010090800100200300400500600硝酸钠浓度（mg?kg-1)相对酶活（％）

图21 亚硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响

3 结论

1) 磷脂水解酶1和2表观分子量分别为65.8 kDa和37.2 kDa。 2) 磷脂水解酶1肯定不属于脂酶类，是一种磷脂酶，因为其不具有4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性。磷脂水解酶2的4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性为32 U/g蛋白。磷脂水解酶1和2都同时具有磷脂酶A1活性和A2活性，且A1活性大于A2活性。

3) 磷脂水解酶1和2的底物浓度和反应初速度之间的关系复杂，1/V和1/S之间不成线性关系。

4) 磷脂水解酶2的最适温度为40℃，最适pH为8.5。

5) 通过特异性激活剂和抑制剂判断，磷脂水解酶2不是Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型磷脂酶A2。

6) 氯化钠对磷脂酶2活性具有抑制作用，亚硝酸钠对其活性没有影响，100 ppm以上的硝酸钠对磷脂水解酶2的活性有轻微的激活作用，但干腌火腿中的残留量不足以激活磷脂水解酶2的活性。

性有轻微的激活作用（图23）。在干腌火腿中亚硝酸钠的最大残留量不足10 mg〃kg-1，硝酸钠的最大残留量也低于50 mg〃kg-1（郇延军等，2005），如此低量的情况下，硝酸钠和亚硝酸钠对磷脂水解酶2的作用都可忽略不计。

15014013012011010090800100200300400500600硝酸钠浓度（mg?kg-1)相对酶活（％）

图21 亚硝酸钠含量对磷脂水解酶活性的影响

3 结论

1) 磷脂水解酶1和2表观分子量分别为65.8 kDa和37.2 kDa。 2) 磷脂水解酶1肯定不属于脂酶类，是一种磷脂酶，因为其不具有4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性。磷脂水解酶2的4-methylumbelliferyloleate荧光底物活性为32 U/g蛋白。磷脂水解酶1和2都同时具有磷脂酶A1活性和A2活性，且A1活性大于A2活性。

3) 磷脂水解酶1和2的底物浓度和反应初速度之间的关系复杂，1/V和1/S之间不成线性关系。

4) 磷脂水解酶2的最适温度为40℃，最适pH为8.5。

5) 通过特异性激活剂和抑制剂判断，磷脂水解酶2不是Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型磷脂酶A2。

6) 氯化钠对磷脂酶2活性具有抑制作用，亚硝酸钠对其活性没有影响，100 ppm以上的硝酸钠对磷脂水解酶2的活性有轻微的激活作用，但干腌火腿中的残留量不足以激活磷脂水解酶2的活性。

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