分子生物学原理（考点总结）

分子生物学原理（最终回） Chapter 1 Protein Structure and Function

复习题（1） 1. 名词解释

（1）Peptides 肽，由氨基酸脱水缩合形成的两性有机化合物。 （2）Simple proteins 简单蛋白，不含蛋白辅助因子的蛋白为简单蛋白。 （3）Conjugated proteins 缀合蛋白，它含有蛋白辅助因子，如辅酶、辅基等。

（4）Coenzyme 辅酶，是一种蛋白辅助因子，通过非共价键与链相连，可以用透析、超滤的方法将其除去。

（5）Prosthetic group 辅基，是一种蛋白辅助因子，通过共价键与多肽链相连，不易与多肽链分离。

（6）Configuration 构型，有机分子的空间排列，不同的排列彼此作为参照，它们之间的转化需要破坏共价键。

（7）Conformation 构象，取代基团的空间排列，它们的转化可以通过单键的旋转来完成，故不需要破坏共价键。

（8）Chiral carbin 手性碳原子，连接四个不同原子或基团的碳原子叫做手性碳原子。 （9）Enantiomers 对映异构体，如两个分子互为镜像关系，则称这两个分子为对映异构体，对映异构体具有旋光性。

（10）Optical isomers 旋光异构体，是一对对映异构体，它们除了光学特性不一样以外，其它物化特征均相同。

（11）Cis and trans isomers 正反异构体，取代基团在双键两侧的不同排列形成正反异构体。 （12）Ampholytes两性电解质，既包括碱性基团又包括酸性基团的分子，故既能和酸反应又能和酸反应，如氨基酸。

（13）Isoelectric point 等电点，氨基酸净电荷为零时所对应的pH。

（14）Peptide plane 肽平面，肽键具有一定程度的双键性，参与肽键的六个原子C、H、O、N、Cα1及Cα2不能自由转动，位于同一平面内，该平面就是肽平面。

（15）Dihedral angle 二面角，绕Cα-N及Cα-N旋转的角分别为肽平面的两个二面角，它决定了肽链的主链构象。

（16）Ramachandran diagram 拉氏构象图，Ramachandran 根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（φ、ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，那些是不允许的，并以φ为横坐标，以ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该图几位拉氏构象图。

（17）Primary structure of proteins 蛋白的初级结构，氨基酸的排列顺序即为蛋白的初级结构。 （18）Secondary structure of proteins 蛋白的二级结构，它是指多肽链的局部构象，即局部骨架的折叠方式。

（19）Tertiary structure of proteins 蛋白的三级结构，是指整条多肽链的构象，包括所有原子的空间排列。

（20）Quaternary structure of proteins 蛋白的四级结构，它是指亚基间的相互作用，包括亚基数目、种类、空间位置及相互作用。

（21）Coiled coil 卷曲螺旋，指两个或两个以上的α-helix相互缠绕形成的稳定超螺旋。 （22）β-strand, β-barrel & β-saddle β折叠链是指β折叠中的多肽链，它的矩形排列形成马鞍

形，交错排列形成圆筒形。

（23）β-turn β转角，球状蛋白质的多肽链上出现180°的回折即为β转角，由四个氨基酸组成，氢键存在于第一个CO和第四个NH之间。一般为trans，但脯氨酸有6%的cis。 （24）Disulfide bonds 二硫键，两个半胱氨酸缩合在硫醇之间形成的键为二硫键。 （25）Electronegativity of elements 电负性，为原子获得电子的能力，其数值越大，在形成化学键时对成键电子的吸引能力越强。

（26）Entropy 熵，它指的是体系的混乱程度，熵值越大，体系越稳定。

（27）Motif 模体，也叫超二级结构，指的是几个二级结构的稳定特殊排列及彼此的连接，是结构域的亚单元，表现结构域的各种功能。

（28）Domain 结构域，是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，在三维空间可以明显区分及相对独立，并具有一定的生物学功能。 2. 22种天然氨基酸的名称、符号及其主要特征（略）。 3. 为什么Gly的酸性明显强于醋酸？

由于在Gly中，α-NH2跟α-COOH竞争H，使COOH更容易解离，故其酸性较强。 4. 天然氨基酸的特征性颜色反应和光吸收特征是什么？

茚三铜反应：α氨基酸的茚三铜反应为蓝色，但脯氨酸为黄色。应用的是α-NH2生色基团的活泼性。

光吸收特征：1）含有苯环，测定时用280nm的吸光度值（Trp 278nm，Tyr 275nm，Phe 257nm）2）其它氨基酸不含苯环，测定时用220nm的吸光度值，应用的是肽键的性质。 5. Peptide bond的主要特点是什么？

①肽键中N的电子云向羰基O偏移；②C-O有~40%的单键性质C-N有~40%的双键性质，双键性质限制自由旋转；③每个残基都保留两个自由旋转的单键N-Cα和C-Cα。 6. 为什么多肽链具有方向性？

多肽链是通过氨基酸的脱水缩合形成，由于氨基酸同时含有-NH2和-COOH，这样在多肽链的末端，一端有一个游离的-NH2，另一端有游离的-COOH，因此肽链就有了方向性。 7. α-helix和β-pleated sheet的主要结构特征是什么？

1）①α-helix一般为右手螺旋，肽平面平行于螺旋的长轴；②肽链以螺旋状盘卷前进，每圈螺旋由3.6个氨基酸残基构成，螺距为0.54 nm；③螺旋结构被规则排布的氢键所稳定，氢键排布的方式是：肽键羰基O原子和C端方向的第4个残基酰胺H原子形成氢键。由于所有的氢键工体的方向相同，所以α-helix具有极性。这样构成的由一个氢键闭合的环，包含13个原子。 ④氨基酸残基侧链从螺旋形成肽链骨架向外伸出，覆盖在α-helix的外表面。

2）①每条β-折叠链片段比较短，几乎是完全伸展的。侧链交替地分布在片层的上方和下方。②在β-折叠结构中，相邻肽链主链上的C=O与N-H之间形成氢键，氢键与肽链的长轴近于垂直。③相邻肽链的走向可以是平行和反平行两种。在平行的β-折叠结构中，相邻肽链的走向相同，氢键不平行。在反平行的β-折叠结构中，相邻肽链的走向相反，但氢键近于平行。④β-折叠链上的每个肽平面基本上和相应的β折叠片层平面折叠，氨基酸残基侧链基团交替指向平面的上方和下方。

8. 哪些氨基酸残基容易造成α-helix结构的不稳定（或终结）？为什么？

Pro及Gly。

Pro的Cα原子位于侧链基团吡咯环中，导致Cα-N键不能旋转，导致α-helix在此“打结”或中断。同时，Pro的氨酰基团缺少H原子，不能形成稳定的氢键。

对于Gly，由于其Cα不是手性C，这样它就形成更多种异变的构象，不容易形成α-helix。 9. Collagen分子结构的主要特点是什么？

胶原蛋白（Collagen）由3条α链多肽组成，每条多肽链均为左手螺旋构型。三条拧成一股，形成右手超螺旋结构，使其分子结构非常稳定，每圈约为30个氨基酸残基，螺距8.6 nm。

10. 第一个完成3D结构测定的蛋白质是什么？何时、何人完成？

第一个完成3D结构测定的蛋白是抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin），它是在1957年，由英国的Max Perutz及John Kendrew共同完成的。 11. 维持蛋白质分子3D结构的力有哪些？

维持蛋白3D结构的主要有四种力，分别是氢键、离子键、范德华力及疏水作用力。 12. Hydrogen bond是如何形成的？其本质如何？

电负性较大、半径较小的原子与H原子形成分子后，共用电子对强烈偏向电负性较大原子的一边，而H原子核外只有一个电子，其电子云向电负性较大的原子偏移，使得它几乎要呈质子状态。这个半径很小、无内层电子的带部分正电荷的氢原子，使附近另一个分子中含有孤电子对并带部分负电荷的原子充分靠近它，从而产生静电吸引作用。这个静电吸引作用力就是所谓氢键。

氢键的本质就是正负电荷的相互吸引。

13. Hydrophobic interaction是如何形成的？其本质如何？

由于疏水物不是电子极化性的，它们无法形成氢键，所以水会对疏水物产生排斥，而使水本身可以互相形成氢鍵。这样就形成了疏水作用力，它的本质是熵变，即体系混乱度的增大。

14. Van der Waals interactions是如何形成的？其本质如何？

电子云中暂时的偶极产生弱的吸引力，形成了Van der Waals interactions，其本质是正负电荷的相互吸引。 复习题（2） 1. 名词解释

（1）Hierarchical folding model 逐级折叠模型，是氨基酸序列折叠成复杂结构的一种模型，由二级结构折叠成超二级结构，然后形成完整的结构域，最后是整条多肽链的折叠。 （2）”Molten globule” folding model 熔球模型，在疏水性作用下肽链舒展，然后形成熔球，它包含了大量的二级结构，许多侧链没有包含进去，最后形成天然构象。

（3）Chaperones 伴侣分子，指在细胞中帮助蛋白完成折叠的一类分子，包括分子伴侣及伴侣蛋白。

（4）Molecular chaperones 分子伴侣，是指结合未折叠的蛋白质和正在合成的多肽，防止其变性，只是间接和部分起作用。

（5）Chaperonins伴侣蛋白，是直接促进蛋白折叠的一类蛋白。

（6）Prion disease 朊病毒疾病，该病的致病因子是阮病毒蛋白质，由于其构象发生改变导致该病。

（7）Ubiquitin 泛素，它是由76个氨基酸残基组成的高度保守的多肽链，通过C末端的Gly，泛素共价地结合于底物蛋白质的Lys残基，被其标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解，这种标记作用不具有底物特异性。

（8）Ubiquitination 泛素化，泛素通过其C末端的Gly残基和靶蛋白上的Lys ε-氨基形成异

肽键，催化这一过程的主要有3个酶：泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3。 （9）Pupylation 原核中的“泛素化”，即PUP蛋白与靶蛋白Lys残基侧链的连接，介导原核蛋白的降解。

（10）protein denaturation 蛋白变性，蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，即其三级结构的改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。

（11）Renaturation 复性，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性。

（12）3D domain swapping 即三维结构结构域交换，在特定的单体之间交换特定的结构元件产生的聚合结构单元。

（13）Intrinsically unstructured proteins（IUP）内在未折叠蛋白，在中性pH条件下，一种蛋白的伸展结构，表现出高度的可变性并缺乏二级结构单元。

（14）Integral proteins 内在蛋白，膜蛋白的一种，其疏水部分与膜磷脂疏水部分共价连接，两端具极性，蛋白贯穿膜内外。

（15）Peripheral proteins 外在蛋白，膜蛋白的一种，不直接与膜疏水性双分子层相连接，通过氢键、离子键与脂分子或膜蛋白结合。

（16）Sedimentation coefficient 沉降系数，在单位离心力场中粒子移动的速度，是以时间表示，跟颗粒大小与密度有关。

（17）Differential centrifugation 差速离心，是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的，将可溶性成分与不溶性成分区分开来。 （18）Rate-zonal centrifugation 速率区带离心，不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

（19）Ion exchange chromatography 离子交换色谱，是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来分离溶液中带电离子的一种方法，凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其原理是利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。

（20）Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析，又称分子筛，主要是根据蛋白质的大小和形状及蛋白质的质量进行分离和纯化，条件温和，回收率高（大分子先出，小分子后出）。 （21）Affinity chromatography 亲和层析，利用某些分子间能特异性吸附和释放而建立的一种层析分离技术，主要用于抗原或抗体的纯化制备。 （22）Specific activity 比活性，指单位活性位上的反应速率。

（23）HPLC 高效液相色谱，其原理是被测不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质按顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质，具有分离速度快，灵敏度高，分辨率高等特点。

（24）Reverse Phase HPLC 反相高效液相色谱，这是一种固定相极性小于流动相极性的液相色谱，极性大的先流出。

（25）FPLC 快速蛋白液相色谱，专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，其原理与经典的HPLC相似，使用了惰性材料。

（26）Perfusion chromatography 灌注色谱，使用了新的HPLC树脂，使样品与固定相作用加快，并且保持了较高的灵敏度，其原理与HPLC相同。

2. 1950s，著名的C. Anfinsen实验的内容和意义是什么？

RNase A（含124个氨基酸，4个二硫键）在8M尿素及β巯基乙醇的作用下变性，不能再水解RNA，但当变性剂除去以后，RNase恢复了原有的构象，能够将RNA水解。

它为氨基酸序列决定蛋白的三级结构提供了第一个证据。 3. 举例说明Covalent modification of proteins的主要类型。

Ser、Thr及Tyr的磷酸化；Lys的甲基化；Lys的乙酰化；Cys的烷基化；Lys的泛素化；Ser及Thr的N-乙酰胺基葡萄糖化（N-acetylglucosamine） 4. 说明Ubiquitin-mediated proteolytic pathway的主要过程。

（1）泛素的活化：泛素Gly端的羧基连接到泛素活化酶E1的巯基，这个步骤需要以ATP作为能量，最终形成一个泛素和E1之间的硫酯键。

（2）E1通过交酯化过程将活化后的泛素交给泛素结合酶E2。

（3）泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白上，当蛋白上已经存在泛素的时候，结合了E2的泛素可以直接连接在其上而不通过E3。

最终，被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。 5. 实验室常用的蛋白质变性剂有哪些？其原理如何？

尿素，盐酸胍：竞争氢键； β-巯基乙醇：还原二硫键

6. 蛋白质分子的三维结构是否完全取决于它的一级结构？ 7. 蛋白质分子是否只能折叠成一种特殊的三维结构？

8. Intrinsically unstructured proteins有哪些特征（结构、功能）？

在中性环境下，表现出高度的可变性并缺乏二级结构单元。亲水性氨基酸含量上升，疏水性氨基酸含量下降，以高的等电点和低的疏水性为特征。

由于它具有高的伸展性，可以跟不同底物结合，并且具有较大的分子界面，易于进行调节。其功能跟信号转导、细胞周期调控及基因表达有关，跟DNA结合与转录、包装、修复和复制有关。

9. 何谓酶蛋白的Km值？如果改变浓度，Vmax和Km值是否改变？

即酶对底物的亲和力，Km值越大，亲和性越小，改变浓度，Km值不变，但Vmax相应改变。

10. 离心法分离纯化蛋白质的原理是什么？

离心主要是根据物质的质量或密度不同，由于蛋白的密度差别较小，主要根据其质量不同进行离心。

11. 在细胞裂解液中，沉降系数最大的组分是什么？密度最大的组分是什么？ 细胞核，RNA。 复习题（3） 1. 名词解释

（1）Free electrophoresis 自由电泳，溶质在自由溶液中的泳动为自由电泳，分辨率较低。 （2）Zone electrophores 区带电泳，带电粒子在固相介质中通过电泳而分离的一种方法，固相支持物有滤纸、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等。

（3）Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳

（4）Sodium Dodecyl Sulfate （SDS）十二烷基硫酸钠，常用于蛋白变性，是一种去垢剂。 （5）SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺为固相支持物的电

泳，其中，SDS使蛋白带有相同的表观电荷，根据蛋白分子量的不同，使蛋白分离。 （6）Isoelectric focusing electrophoresis（IEF） 等电聚焦电泳，利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处，形成一个很窄的区带。

（7）Two-dimensional electrophoresis 双向电泳，是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

（8）Capillary electrophoresis 毛细管电泳，利用毛细管中被分析的带电分子在电场作用下，因移动速率不同而达到分离不同分子的目的。具有高效，快速，微量，高压的优点。 （9）Edman degradation Edman降解法，从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的方法。N末端氨基酸残基被PITC修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。

（10）Mass Spectrometry （MS）质谱，质谱分析是一种测量离子荷质比的分析方法，其基本原理是使各组分发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。

（11）MALDI-TOF MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，适用于混合物及生物大分子的测定。

（12）ESI MS 电喷射电离质谱，对于高分子化合物的测定由于可以产生多电荷峰，与传统的质谱相比扩大了检测的分子质量范围，同时提高了仪器的灵敏度。

（13）Solid-phase peptide synthesis 固相肽合成，将氨基酸C端固定，N端经过保护、去保护，伴随新的氨基酸的添加和肽链延伸的过程，可合成大约50个氨基酸的肽。

（14）Proteome 蛋白组，细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质，包括不同环境、不同状态或不同发育阶段蛋白质水平的变化。

（15）Proteomics 蛋白组学，是研究生物各种基因组在细胞和组织中表达的全部蛋白的分子结构、功能及其相互作用的新学科，旨在发现高疗效、低副作用的新药。

（16）X-ray crystallography X射线晶体衍射，X射线射入晶体，晶体中的电子发生震动成为波源，按照晶格的周期性结构产生布拉格散射，多个电子的散射波相互叠加形成衍射。 （17）Southern blotting Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。首先分离消化的DNA片段，将其变性并在原位将单链DNA片段转移至固相支持物上，固定后用相对应的探针标记，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的位置。 （18）Northern blotting这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，用来衡量真核生物RNA的量和大小，及估测其丰度的一种方法。

2. 第一个完成一级结构分析的蛋白质是什么？是哪位科学家何时、如何完成的？

1953年，Frederick Sanger利用FDNB和纸层析完成了第一个蛋白质分子，牛胰岛素的一级结构分析。

3. 简述分析蛋白质分子一级结构的基本方法（策略）。

使用两种方法将多肽链转移性裂解，逐一测定每个纯化的小肽段的顺序，然后根据这两套肽段氨基酸顺序中的重复区确定小肽段的排列次序，从而完成整条多肽链的顺序分析。 4. 简述用ESI MS/MS进行Protein sequencing的基本过程。

1）蛋白水解后注入一级MS，切割的多肽分离，部分进入后续分析；

2）在二级MS中，肽链被He或Ar轰击，破坏肽键，由于C末端及N末端的不同，产生两种离子化的片段，然后片段的荷质比在二级MS中进行分析，最终在质量分析器中确定其质量。

5. 简述Solid-phase peptide synthesis的基本步骤。

1）通过转脂反应，将第一个氨基酸的羧基共价地连接到固相树脂，α-NH2被t-Boc保护；2）在三氟乙酸的作用下，N末端去保护；3）在DCC作用下，第n个氨基酸与第n-1个氨基酸形成肽键（第n-1个氨基酸被t-Boc保护）；4）重复以上过程，完成的肽链在HF的保护下从树脂上脱落。

6. 研究3D structure of a protein的基本方法有哪些？ X-射线晶体衍射，核磁共振光谱

7. 与X-ray crystallography法测定测定蛋白质三维结构相比，NMR spectroscopy法的两个显著特点是什么？

①可以在溶液中操作；②蛋白的分子量相对较小。 8. 简述Western blotting（immunoblotting）的基本过程。 SDS-PAGE，转膜，一抗孵育，二抗标记，显色。

Chapter 2 Catalytic Strategies

1. 名词解释

1）Transition state 过渡态，在反应过程中，反应能量最高、最不稳定的形式，该状态化学键正在断裂或形成。

2）Activation energy 活化能，过渡态能量与基态能量的差即为活化能。

3）Binding energy 结合能，酶促反应耗能，酶-底物之间通过次级键相互作用，每个次级键的形成均释放少量自由量，这种酶-底物相互作用产生的能量的总和就是结合能。 4）Induced fit 诱导契合，酶-底物结合时，酶蛋白通常表现结构柔性，即结构发生重排，构象发生改变，即为诱导契合。其原因在于功能基团获得必要的空间取向，增强特异的催化能力，形成和稳定过渡态。

5）Nucleophiles 亲核基团，通过贡献电子而与反应物成键的化学基团为亲核基团。 6）Electrophiles 亲电基团，通过得电子而与反应物成键的化学基团为亲电基团。

7）General acid-base catalysis 一般酸碱催化，通过某种反应增加反应基团的亲核性或亲电性的催化反应，最常用的方式是通过质子转移。

8）General acid，General base 一般酸，一般碱，能够释放质子的任何物质为一般酸，能够结合质子的任何物质为一般碱。

9）The catalytic triad 催化三联体，它一般是指特定蛋白酶的活性位点中Ser，Asp，His这三个氨基酸残基，它们一起作用破坏肽链中的肽键。由于酶折叠成复杂的三级结构，酶的催化位点离的较远，但这种三联体的结构使它们彼此靠近。

10）The oxyanion hole 氧负离子穴，氧原子亲核攻击肽键的羰基碳原子，羰基氧原子得负电子形成氧负离子，它与酶肽链骨架的氨酰基团之间产生氢键，形成氧负离子穴，即酶中的口袋结构。

11）Divergent evolution 趋异进化，有些生物或者某些蛋白虽然同出一源，但在进化过程中在不同选择压力的作用下变得很不相同，这种现象称为趋异进化。

12）Convergent evolution 趋同进化，不同的生物或蛋白，甚至在进化上相距甚远的生物或

差异较大的蛋白，在同样选择压的作用下，产生功能相同或十分相似的形态结构，以适应相同的条件，此种现象称为趋同进化。

13）Restriction-Modification systems 限制修饰体系，是细菌或其它原核生物用来防止噬菌体或外源DNA侵入的机制。

14）P-loop P环，是一个ATP结合位点的模体，存在于核苷酸结合蛋白中，是一个柔性环，一般由Gly-X-X-X-X-Gly-Lys组成。 2. 结合能在酶促反应中有什么重要意义？

结合能增加酶-底物相互作用的稳定性，降低活化能和稳定过渡态，并克服了4个热力学障碍：熵减；去溶剂化；底物变形；功能基团空间定位。 3. 酶催化的5种基本机制是什么？

结合能；共价催化；一般酸碱催化；金属离子催化及临近催化。 4. 金属离子在酶促反应中起什么作用？

金属离子通过三方面在酶促反应中起作用：充当亲核电子的催化剂；通过提高临近分子的酸性产生亲核基团（如碳酸酐酶）；与底物结合故此产生结合能（如NMP激酶）。 5. Ser蛋白酶的催化机制是什么？

以糜蛋白酶的催化来说明Ser的催化机制。简言之，糜蛋白酶的催化三联体由Ser195-Asp102-His57组成，是一个酰化与去酰化的过程，伴随四面体的形成和瓦解。

1）酶与底物连接，Ser 195将质子传递给His 57，其氧原子亲核攻击肽键的羰基碳原子，羰基氧原子得负电子形成氧负离子，与酶肽链骨架的酰胺基团之间产生氢键，形成氧负离子穴；

2）以敏感肽键羰基碳原子为中心形成四面体结构；

3）His 57质子化，将质子传递给肽键氮原子，使肽键断裂，形成酰基-酶共价中间体； 4）His 57从水分子吸收质子，产生的OH-立即亲核攻击连接酰基-酶中间产物的羰基碳原子形成短暂的四面体结构；

5）His 57将一个质子还给Ser 195侧链氧原子，释放底物酸性部分，酶恢复原状，准备迎接下一个底物。

6. 几种Ser蛋白酶，如糜蛋白酶、胰蛋白酶及弹性蛋白酶它们识别底物有何异同，为什么？

相同点：3个酶都存在Asp 102-His 57-Ser 195的催化三联体来完成催化，都具有氧负离子穴组成的口袋。1） 3个氨基酸顺序有40%的相同，特别是活性部位Ser 195周围的氨基酸序列相同；2）相似的构象；

不同点：3个酶与底物结合的部位不同：①糜蛋白酶的口袋由非极性氨基酸组成，较宽，结合大的疏水侧链；②胰蛋白酶口袋底部的残基是带负电的Asp 189，可结合带正电的氨基酸；③弹性蛋白的口袋具有Val 126和Thr 226，可防止大侧链的氨基酸进入，只允许小的氨基酸进入“口袋”。

7. 碳酸酐酶使用什么催化机制使CO2的水和反应如此快速进行？

通过His的质子穿梭使酶的活化态迅速再生：His 64从与Zn2+-H2O中夺取一个质子，产生亲核基团OH-和质子化的His；然后Buffer去质子，重新产生非质子化的形式。在其反应过程中，最为关键的是水分子的去质子化。

8. 比较Mg2+在NMP激酶和限制性内切酶活性中心的作用。

在NMP激酶中，Mg2+结合在NTP上，而在限制性内切酶中Mg2+结合在限制性内切酶的活性中心上；在NMP中，NTP与Mg2+结合，形成真正底物，Mg2+使NTP处于合适的构

象中，并为产生较高的结合能提供了机会。而在限制性内切酶中Mg2+帮助它活化水分子，使它利于攻击磷酸。

9. 限制性内切酶的特异性是怎样产生的？

首先，根据被切割DNA序列的回文结构，限制性内切酶进化出独特的二重旋转对称的构象；其次，限制性内切酶与同源性DNA结合后可以产生较高的结合能，为DNA的扭曲以利于水解提供能量，而与非特异性DNA则只能产生少量的结合能。 10. NMP激酶的催化过程使用那些催化机制？ 邻近催化，结合能，金属离子催化。 11. 简述碳酸苷酶的催化机制。

使H2O去质子，产生OH-→CO2结合到碳酸苷酶的活性位点与OH-反应→OH-攻击CO2，使其变成HCO3-→HCO3-释放，Zn2+结合另一个H2O

使用质子穿梭的机制使CO2的水和反应快速进行。

Chapter 3 Regulatory strategies

1. 名词解释

1）Allosteric protein 别构蛋白，一种多亚基的蛋白，它具有多配体的结合位点，一个配体给位点结合会影响到其它配体跟其它位点的结合。

2）Allosteric enzyme 别构酶，一种调节酶，它是通过特殊代谢产物在其非活性中心的非共价结合来调节酶的活性。

3）Allosteric site 别构位点，异构酶分子表面的特殊位点，它可以跟调节物或影响因子结合。 4）Concerted model 齐变模型，是别够蛋白变构性的一种模型，指别构蛋白同时处于R态或者T态的一种模型。

5）Senquential model 序变模型，是别够蛋白变构性的另一种模型，别构蛋白它可以部分地处于T态或者R态。

6）Isozyme 同工酶，这是一种在氨基酸序列不同但催化同一反应的一种酶，它们有不同的动力学特征，是对不同组织或不同发育阶段的催化微调。

7）Covalent modification 共价修饰，某些蛋白肽链上的侧链基团在酶的催化下可与某种化学基团发生共价结合或解离，从而改变蛋白的活性，这一调节方式为共价修饰。

8）Protein phosphatase 蛋白磷酸化，指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

9）Sumoylation 小泛蛋白相关修饰蛋白化， SUMO经由一系列酶介导的生化级联反应共价结合于靶蛋白的Lys残基上,稳定靶蛋白免受降解的过程称为SUMO化。

10）Proteolytic activation 蛋白酶解激活，有些蛋白酶开始仅作为无活性的前体合成，然后在一处或几处特定的位点发生肽键断裂，从而被激活，这个过程即为蛋白酶解激活。 11）Zymogen 酶原，许多蛋白酶起始无活性的前体即为酶原。

12）Protein splicing 蛋白剪接，是蛋白质内含肽介导的，一种在蛋白质水平上翻译后的加工过程，它由一系列分子内的剪切-连接反应组成。

13）Protein kinase 蛋白激酶，蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将 ATP 的 γ 磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。 2. 别构酶有哪些特征，以及这些特征有什么生理意义？

特征有三：1）别构酶是含两个或两个以上亚基的寡聚酶；2）除含有结合底物的活性中心以外，别构酶还有非共价结合别构剂的别够中心；3）别够酶的动力学特征不符合米氏方程，反应曲线为S形，而非双曲线。

生理意义：别构酶的催化速度对底物浓度的变化十分敏感，有利于别构酶在底物浓度较低时对中等速率的细胞代谢反应起调节作用。 3. ATCase怎样在T态和R态之间相互转换？

ATCase通过跟ATP及产物CTP的结合来改变其T态或者R态，只要CTP与调节亚基的R链结合，即使部分结合，也会使整个ATCase由R态变为T态；反之，只要有ATP与其调节亚基的R链结合，即使部分结合，也会使整个ATCase由T态变为R态，符合齐变模型。

4. LDH乳酸脱氢酶的同工酶调节有什么生理意义？

LDH同工酶相对含量的改变在一定程度上更敏感地反应了某脏器的功能状况，若某一组织发生病变，则会引起血清LDH同工酶谱的变化，这些变化是组织损伤的象征，可被用于临床诊断。

同工酶的存在能满足某些组织或某一发育阶段代谢转换的特殊需要，提供了对不同组织和不同发育阶段代谢转换的独特的调节方式；同工酶作为遗传标志，已广泛用于遗传分析的研究。

5. 举例说明SUMO化修饰对蛋白有什么分子意义？

其作用有三：1）影响蛋白质间的相互作用； 2）为作用蛋白提供一个结合位点；3）导致被修饰靶蛋白构象的改变。

其作用机理：1）SENP从SUMO1催化切除4个C末端的氨基酸，暴露C末端的Gly-Gly模体；2）E1-SUMO之间形成硫酯键；3）SUMO被转移催化E2的Cys；4）SUMO C末端的Gly及底物Lys之间形成异肽键，一般通过E3连接；5）SUMO化的靶蛋白作为SENP的底物，使得SUMO化变得可逆。

可以阻止染色质结构的改变，抑制启动子的活性。 6. 磷酸化（Ser、Thr、Tyr）修饰对蛋白功能的改变有何意义？

作用有五：

1）靶蛋白分子结合一个磷酸基团，带电性改变，使基团间静电作用及分子结构产生改变，导致侧链靶蛋白活性明显改变；

2）每个磷酸基团可以形成2~3个氢键，这些氢键具有高度的方向性；

3）磷酸化过程中，ATP释放出大量自由能，造成靶蛋白不同功能状态下构象平衡常数的改变；

4）磷酸化和去磷酸的过程可以较快，也可以缓慢进行，使生理过程适应于严格的时间要求；

5）磷酸化可以引起极强的级联放大效应。 7. 糜蛋白酶原的激活过程是什么？

糜蛋白酶原为245个氨基酸组成的多肽，完全没有催化活性。在胰蛋白酶的作用下，糜蛋白酶原在Arg15和Ile16残基间切割，形成具有生物活性的π-糜蛋白。π-糜蛋白发生分子间水解，产生两条多肽链，两者通过二硫键连接形成α-糜蛋白。 8. 吸烟为什么会加重肺气肿？

首先，肺气肿是由于type Z中Glu53突变为Lys，导致抑制因子的减缓，使血清中的抑

制因子只有正常的15%。这样，过量的弹性蛋白酶就开始消化肺泡细胞的弹性蛋白，导致肺气肿。

在吸烟的过程中，抗弹性蛋白酶与弹性蛋白酶的结合位点的Met 358被氧化成亚砜，弹性蛋白酶不能被有效抑制，使肺气肿加重。 9. 凝血与血凝块的溶解过程分别是什么？

凝血：①将凝血因子X激活成Xa；②激活凝血酶；③先形成血纤维蛋白单体，然后进一步合成不溶性网状血纤维蛋白凝块。

溶解：胞浆素原在TPA作用下形成纤维蛋白溶酶，将纤维蛋白切割成多肽。

Chapter 5. Membrane Transport

. 名词解释

1）Transporter protein 转运蛋白，细胞膜上可以介导溶质运输的一种蛋白，具有溶质的结合位点，大多数需要ATP，并存在构象的改变。

2）Channel protein 通道蛋白，细胞膜上可以介导被动运输的一种蛋白，不具有溶质的结合位点，运输过程中不需要能量，开启状态下具水孔。

3）Passive transport 被动运输，指物质顺顺浓度梯度转运过程，此过程不消耗能量。 4）Active transport 主动运输，指物质逆浓度运输的过程，该过程就要ATP，又需要蛋白的协助。

5）Ligand-gated channel 配体门控通道，这类通道在其细胞内或外的特定配体与膜受体结合时发生反应, 引起门通道蛋白的一种成分发生构型变化，结果使通道打开或关闭。因此这类通道被称为配体-门控通道。

6）Voltage-gated channel 电压门控通道，具有同化学门控能道类似的分子结构，控制通道开关的是通道所在膜两侧的跨膜电位的改变，即在这种通道的分子结构中，存在一些对跨膜电位的改变敏感的基团或亚单位，由后者诱发整个通道分子功能状态的改变。

7）P-type ATPase P型ATP酶，是ATP-driven pump的一种，其特点是它会形成一个关键的磷酸化得中间产物，在该结构中P结构域含有特殊的Asp位点，包括Ca2+泵Na+/K+泵等。 8）ABC transporter ABC运载体，在ATP结合位点上会有一个构象的改变及水解的过程，使约束的离子转膜。

9）Symporter共运载体，它是一种内在膜蛋白，使得两个或多个不同的分子或离子沿同一方向通过磷脂双分子层，是一种协同转运蛋白。

10）Antiporter反向运载体，它是一种内在膜蛋白，通过次级主动转运蛋白介导两个或多个不同的分子或离子沿相反方向通过磷脂双分子层。 2. 通道蛋白与载体蛋白有何异同？

相同点：化学本质均为蛋白质、分布均在细胞的膜结构中、都有控制特定物质跨膜运输的功能。

不同点：通道蛋白没有配体的结合位点，转运不需要ATP，并具有水孔；转运蛋白具有配体的结合位点，转运大部分需要ATP，并且存在可逆构象的改变。 3. AchR有几种构象形式？及它们之间如何转换？

乙酰胆碱受体可以以三种构象存在：关闭、失活及打开。乙酰胆碱受体（关闭）→失活（与一个乙酰胆碱结合）→打开（与两个乙酰胆碱结合） 4. 举例说明电压门控通道的开关机制。

以Na+通道的开关为例。实际上就是由关闭到打开，到失活，再到关闭的过程。Na+通道由4个同源的亚单位组成，每个含有6个α螺旋，其中S6是活化门，而带正电的S4则是电压传感器。

S4上所带的正电荷拉动它向膜内移动，去极化减缓了这种拉力，S4向外运动把信息传递给活化门S6，从而使通道打开；刺激过后，S4回到静息状态的位置，通道失活片段与通道结合，使其失活；膜恢复极化状态，通道失活区段移动，围绕在门的旁边，使通道关闭。 5. Na+通道的失活机制及其生理意义。

Na+通道的失活机制是一种球链模型。1）关闭的Na+通道，初期的去极化及电压传感器S4的移动，使通道打开；2）S4回到静息状态的位置，通道失活片段与通道结合，使其失活；3）膜重新极化，通道失活区段移动，围绕在门的旁边，Na+通道关闭。

其生理意义在于避免了Na+通道一直处于活化状态，使Na+持续内流，而导致细胞调节失控。

6. K+通道的选择性是怎样产生的？

水合Na+脱水耗能高，由于其半径较小，与K+通道不易成键，这样产生的能量难以得到补偿。同时，由于K+通道在两侧形成负离子环，抑制了负离子Cl-的通过。 7. 细胞膜内外的Na+/K+离子浓度梯度是怎样产生的？

细胞膜必须消耗ATP以Na+/K+泵间歇性工作来维持膜内外离子浓度梯度，Na+/K+

泵的工作机理：1）Na+与E1-ATP结合；2）然后E1上的Asp进行磷酸化修饰；3）E1构象发生改变形成E2；4）Na+释放，E2结合K+；5）E2去磷酸化，构象发生改变形成E1；6）K+释放回到起始态。

8. 体内水分子是如何进行跨膜转运的？

通过水分子通道来运输，几个H2O与通道中保守的Asn残基和Cys的羰基基团形成氢键，从而使通道的孔径缩小，以阻止其它离子的通过。 9. 举例说明P-type ATPase和ABC transporters的异同。

相同点：它们都需要ATP，都介导主动运输。

不同点：以Ca2+泵为例，Ca2+的结合及磷酸化使结合位点翻转，去磷酸化和翻转使酶回到起始状态，伴随共价中间体的形成；而对于ABC transporter，伴随ATP跟ADP间的转化，酶的构象发生改变，不会形成共价中间体。

10. 以葡萄糖的吸收为例，说明营养物质怎样运输到需要的部位。

肠上皮细胞和吸收葡萄糖是逆浓度梯度进行，需要消耗能量，Na+/K+泵将P基团的自由能转换为Na+梯度，在Na+/glucose共运载体的作用下与Na+一起运入细胞内，故属于主动运输(继发性主动转运)；它在葡萄糖运载体介导下顺浓度梯度进入红细胞，为被动运输（易化扩散）。

简言之，需要Na+浓度驱动的同向转运蛋白（进入肠、胃），被动转运的载体蛋白介导（肝、红细胞）。

11. 毛地黄毒苷治疗心衰的机理。

毛地黄毒苷阻断了Na+/K+ ATPase E2-P的去磷酸化，胞内Na+浓度升高，而胞内Ca2+

外排主要借助的浓度梯度，所以浓度梯度的减弱将导致胞内Ca2+浓度升高，心肌收缩加强，故可治疗充血性心力衰竭。

Chapter 6 Signal transduction

复习题（一） 1. 名词解释

1）Signal transduction 信号转导，膜外信号转移到膜内反应的整个过程，以及过程中的每一步。

2）G protein G蛋白，是GTP结合蛋白的大家族，由异源三聚体组成。它的活化通常是因为激素或其它信号分子结合七螺旋的受体所致，其靶蛋白是质膜中的酶活离子通道，在细胞内信息传递过程中G蛋白起重要的中介作用。

3）Adenylate cyclase 腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶是膜整合蛋白，在膜的细胞质面有两个催化结构域，它能够将ATP转变成cAMP，引起细胞的信号应答，是G蛋白偶联系统中的效应物。

4）Guanylate cyclase 鸟苷酸环化酶，可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)是迄今所知的一氧化氮(NO)的唯一受体，它启动NO信号转导通路,是NO-cGMP通路中的关键酶，参与细胞信号调节。 5）Calmodulin 钙调蛋白，是一种钙结合蛋白，钙调蛋白高度保守，外形呈哑铃状。钙调蛋白在与Ca2+结合后具有活性，Ca2+浓度变化可以调节钙调蛋白的活性，从而对代谢过程起调控作用。

6）EF hand EF手，Ca2+结合蛋白的Ca2+结合位点成螺旋-环-螺旋结构，由EF螺旋及中间的环组成，像伸开的右手食指和拇指基部有一个小球。

7）Nuclear receptor 核受体，是活化转录因子的一个超家族，包括雌激素受体、孕酮受体等，它提供了信号分子和转录系统间的联系。 2. 信号分子的种类及特点。

信号分子有膜内信号及膜外信号两种，膜外信号直接作用于信号受体或不能到达胞内，包括肽类、类固醇、类视黄醇、脂肪酸衍生物及气体分子（如NO，CO）；细胞内信号一般为第二信使，第二信使有cAMP、cGMP、DAG、Ca2+及IP3等。 3. 信号受体的种类及特点。

信号受体包括胞内受体及细胞表面受体。胞内受体位于胞液或胞核，结合信号分子后，受体表现为反式作用因子，可结合DNA顺式作用元件，活化基因转录及表达。包括类固醇激素受体、甲状腺激素受体等。胞内受体都是单链蛋白，含4个结构区。细胞表面受体的一种或一类分子，它们能识别、结合专一的生物活性物质（配体），生成的复合物能激活和启动一系列物理化学变化，从而导致该物质的最终生物效应。 4. 举例说明快速与慢速细胞应答方式的特点。

快速反应是通过调节蛋白的活性来调节细胞应答，而慢速反应则调节涉及到gene转录调控，通过改变蛋白的合成量来调节应答。 5. 试述细胞信号转导系统的共同特征。

在信号到达时通过获得一个或几个磷酸基团被激活，在信号减弱时去除这些磷酸基团，从而失去活性。

6. 举例说明Molecular switch，并说明其如何调控信号传递过程。

细胞内信号传递作为分子开关的蛋白质可分两类：一类开关蛋白（switch protein）的活性由蛋白激酶使之磷酸化而开启，由蛋白磷酸酶使之去磷酸化而关闭，许多由可逆磷酸化控制的开关蛋白是蛋白激酶本身，在细胞内构成信号传递的磷酸化级联反应；另一类主要开关

蛋白由GTP结合蛋白组成，结合GTP而活化，结合GDP而失活（如Ras信号通路）。 7. 试述硝酸甘油治疗心绞痛的机理。

靶细胞内可溶性鸟苷酸环化酶的激活时NO发挥作用的主要机制。硝酸甘油在体内转化为NO，与鸟苷酸环化酶活性中心的Fe2+结合，改变酶的构象，导致酶活性的增强和cGMP合成的增多。cGMP作为新的信号分子介导蛋白磷酸化得过程，使肌球蛋白磷酸化水平的轻链降解，快速导致血管平滑肌的舒张，从而引起血管的扩张、血流通畅。

NO与靶细胞上的鸟苷酸环化酶（NO受体）结合→cGMP→PKG→蛋白磷酸化（肌球蛋白轻链磷酸酶）→肌球蛋白磷酸化水平的轻链降解→心肌血管舒张

8. 试述应激状态下，肾上腺素（epinephrine）启动的信号转导途径的特点和过程。

9. 举例说明信号转导通路中的interaction domains。

10. 试述G蛋白耦联受体信号通路的特点、种类和主要步骤。

11. 试述cAMP信号通路的特点、主要步骤及其介导的多种代谢效应。

12. 内体在信号转导中的重要作用。

内体在信号转导的作用有二：1）信号过程的终止；2）信号propagation。 13. 试述肌醇磷脂信号通路的特点、主要步骤及其介导的多种代谢效应。

14. 试述视觉信号通路的主要步骤及其光适应的机理。

复习题（二） 1. 名词解释

1）TGF-β superfamily 转录生长因子β超家族，成熟的β超家族为二聚体，靠二硫键相连，具有抗增殖效应，其缺失可导致肿瘤的发生。

2）TGF-β receptors 转录生长因子β受体，胞外信号分子，由异源三聚体构成，同时具有受体和激酶的特征，在脊椎和无脊椎动物的生长调节中发挥重要作用。

3）Cytokines 细胞因子，分子量相对较小的一类分泌蛋白，控制细胞生长分化及细胞的特殊类型。

4）Cytokine receptors 细胞因子受体，是单链跨膜的α螺旋，膜外结构域含保守的β折叠，JAK激酶与其胞内结构域相连，本身不具激酶活性。

5）Receptor tyrosine kinases 受体酪氨酸激酶，它的结构特点是只有一个跨膜α螺旋，胞外是配体结合结构域，胞内Tyr激酶具催化结构域， RTK与配体结合后构象变化较小，所以它主要依赖其激酶活性来传递信号。

6）RAS 大鼠肉瘤蛋白，是一类GTP结合蛋白，与异源三聚体不同，为小的单聚体，帮助信号由胞外传到胞内，具有GTPase活性。

2. 试述TGF-β受体的类型和特征及其介导的信号转导途径。

TGF-β受体有RI、RII、RIII三类。RIII是细胞表面的糖蛋白，它可以直接跟TGF-β连接，调节其与RI & RII的可接近性；RII具有激酶活性，可使RI活化；RI不直接与TGF-β

结合，它使Smad3磷酸化，暴露NLS。

其转导途径直接活化胞内Smad转录因子。

3. 试述细胞因子受体的结构特点及其介导的信号转导途径。

细胞因子受体是由单链的跨膜α螺旋组成，膜外为保守的复合β折叠片，JAK激酶与膜内部分相连。信号转导途径有四：①直接激活胞内STAT信号；②PI-3激酶途径；③IP3/DAG途径；④Ras-MAP激酶途径。

4. 试述在各种祖细胞中，细胞因子受体介导的信号转导的两种终止机制。

①短期调控：通过SHP1 Tyr磷酸酶使JAK去磷酸化失活； ②长期调控：Socs蛋白通过泛素化途径使蛋白降解以阻断信号。 5. 试述受体酪氨酸激酶介导的信号转导途径。

有三类：①Ras-MAP激酶途径；②PI-3激酶途径；③IP3/DAG途径。以Ras-MAP激酶途径为例：EGF→EGFP（RTK）→接头→GEF→Ras→Raf（S/T）→MEK（Y/T）→MAPK（S/T）→靶蛋白（TF/PK）→细胞应答 6. 试述胰岛素受体介导的信号转导途径。

①胰岛素与受体结合，RTK二聚化，IRS1通过PTB结构域与P-RTK结合，RTK使IRS1磷酸化。然后PI-3K与RTK-IRS1结合，并使PI磷酸化；②PI将PKB募集到膜上，膜上的PK使PKB磷酸化而激活；③PKB释放，促使葡萄糖被GLU4转移酶运走，通过GSK3合成糖原。

7. 举例说明与蛋白水解相关的信号通路。

8. 举例说明细胞信号蛋白的激活或失活突变与肿瘤发生的关系。

Chapter 7. Antibody and T-cell Receptors

复习题 1. 名词解释

1）Hypervariable regions (CDR) 决定簇互补区，在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，这些区域成为高变区。由于高变区位于抗原与抗体结合的位置，因而被称为决定簇互补区。

2）Ig fold 免疫球蛋白折叠，即免疫球蛋白空间存在由二硫键连接的两层宽阔的反向平行β折叠片，许多疏水键被紧密的夹在两层β折叠片之间，形成类似三明治的构象，这一重复出现的结构称为免疫球蛋白折叠。

3）Recombination signal sequence重组信号序列（RSS），由一特异的7聚体，12个碱基的间隔序列及一个9聚体组成，存在于3’-V和5’-J之间，与VDJ重组酶作用后，可以完成VDJ的移位和连接。

4）P-addition P区核苷酸加入，在DJ链连接的过程中发夹结构不对称打开，在这链上加入互补的核苷酸链，形成的回文序列，称为P-addition。

5）N-addition N区核苷酸加入，在DJ链连接过程中发夹结构对称打开，末端转移酶（TdT）在H链上随机加入15个核苷酸，在模板不依赖的情况下可产生游离核苷酸。

6）B-cell receptor (BCR) B细胞受体，BCR主要包括lgM和lgD，由两条重链和两条轻链连接而成。具有抗原结合特异性，可直接识别天然抗原。

7）pre-BCR 前B细胞受体（pre-BCR）由μ链和轻链替代物结合而成，包括λ5 & V pre B。λ5 & V pre B表达关闭后，轻链重排，最终使B细胞受体形成。

8）Class switch Ig类别转换，是指一个B细胞克隆在分化过程中，V基因不变，而CH基因片段发生重排，重排后基因编码的产物V区相同，而C区不同，即识别抗原的特异性相同，而Ig的类型或亚类发生了改变。

9）Class I or class II MHC I型&II型主要组织相容性抗原，代表个体特异性的同种异型抗原为组织相容性抗原，其中能引起较强而迅速排斥反应的抗原为主要组织相容性抗原。I类、II类分子都是膜糖蛋白，属于Ig超家族成员，由两条不同的多肽链借助非共价键组成的异二聚体。MHCⅠ类分子可以与T细胞表面的CD8分子结合，Ⅱ类分子可以与T细胞的CD4分子结合。

10）CD4 &CD8 CD4主要表达于辅助T（Th）细胞，是Th细胞TCR识别抗原的供受体，与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导，同时也是HIV的受体；CD8是杀伤细胞，可与靶细胞作用使之裂解。同时，它又是TCR的共受体，可以跟MHC I特异性结合。

11）T-cell receptor (TCR) complex T细胞受体复合物，即TCR/CD3复合物，在TCR成功重排并表达后出现于细胞表面，可以介导抗原刺激信号的传递。 2. 什么是抗体的异质性（heterogeneity）？

同一抗原具有不同的抗原决定簇，这样可以跟不同的抗体结合，即不同的抗体可以跟同一抗原结合，此为抗体的异质性。 3. 决定人的抗体多样性的因素有哪些？

1）生殖系基因片段的多重性； 2）V-(D)-J连接体的组合；

3）结合的多样性：结合的柔性，P/N加入； 4）体细胞的超突变； 5）轻链和重链的组合。

4. Ig的light （或heavy）chain如何发生somatic recombination？

以Ig的heavy chain为例。

1）D及J片段在生殖系中的构型由D-J重组随机选择，通常两条同源染色体都要经过D-J重组；

2）V-DJ重组中的V片段的选择具有很大的随机性：①如果一条染色体上的重组是有效的，有功能的μ重链得以表达，并且B细胞的发育继续进行。同源染色体上不会发生重组；②如果V-DJ的重组是无效的，那么重组发生在第二条染色体上；③如果第二次V-DJ的重组有效，那么有功能的μ重链得以表达，并且B细胞的发育继续进行；④如果第二次V-DJ重组无效，那么会产生无功能的重链，并且发育的B细胞死亡。 5. 简述Ig light （或heavy）chain的基因表达过程。

H链的V区由VDJ三种基因片段重组后形成。D基因片段仅存在于H链，不存在与L链，J片段连接V和C。

H链V区发生移位时，首先D与J基因片段连接形成D-J，然后V基因片段与D-J基因片段连接。H链V区基因的移位和连接通过RSS和重组酶完成。

H链C区的基因会发生类别转化（class switch），使得Ig的类或者亚类发生了变化。 6. 简述B-cell的激活过程。

多抗原表位抗原→Ig M 的寡聚化→Lyn介导ITMA中Tyr的磷酸化→P-ITAM募集Syk，带两个SH2的STK，磷酸化和NF-κB，PLC→激活基因并刺激B细胞生长。 7. 为什么说TCR和BCR的激活过程相似？

配体与受体结合激活Src激酶→将ITAM磷酸化→磷酸化的ITAM通过H2结构域募集非Src激酶，这些激酶由Lck，Fyn，Lyn活化→活化的非Src激酶募集并使复合接头蛋白磷酸化→信号通路被激活→基因活化，刺激TCR/BCR细胞生长

Chapter 8 DNA & RNA

DNA

1. 名词解释

1）Ribonucleoside & deoxyribonucleoside 核糖核苷&脱氧核糖核苷，即碱基通过与核糖或脱氧核糖1’位碳原子上的羟基结合脱去一分子水形成糖苷键因而与核糖或脱氧核糖结合，形成核糖核苷或脱氧核糖核苷。

2）ribonucleotide & deoxyribonucleotide 核糖核苷酸&脱氧核糖核苷酸，即碱基通过糖苷键与糖相连，而糖又通过磷酸酯键与磷酸相连，这样就形成了核苷酸。

3）Base tautomers 碱基互变异构体，即在嘌呤和嘧啶杂环中，交替出现的双键具有高度的共轭性，使其在不同pH溶液中存在两种或两种以上的互变异构体。常见的互变异构体发生于酮式/烯醇式（G、U、T）或氨式亚氨式（A、C）之间。

4）Palindromic sequence 回文序列，即在双螺旋DNA分子中，一条链的碱基序列（5’→3’）和另一条链沿同一方向的序列相同，即反向重复序列，具有二重对称性。

5）H-DNA 高嘌呤-高嘧啶序列和对映重复序列通过特殊的碱基配对形成DNA三股螺旋，DNA双螺旋在此处“打结”，呈铰链状。在该结构中，DNA双链在高嘌呤-高嘧啶序列处打开，一条嘧啶链经过回折插入原来的DNA双螺旋大沟，借助Waston-Crick氢键及Hoogsteen键配对。

6）quadruplex DNA 四螺旋DNA，富含G的序列形成的一种结构，有两种主要的类型，第一种涉及重复鸟嘌呤序列的回折形成反向平行链，另一种类型由独立的平行链彼此相连而成。

7）DNA supercoil DNA超螺旋，即DNA双螺旋的两条链缠绕不足或过多，致使在双螺旋中产生新的张力，这种张力由于DNA分子为环形或者两端被固定而无法释放，从而造成DNA分子发生扭曲，形成的三级结构。

2. “DNA”和“RNA”是缩写，其英文全称是什么？

Deoxyribonucleic acid & ribonucleic acid

3. 核酸分子具有方向性和强极性骨架的原因是什么？

在核酸分子中，由于每个核苷酸单位的3’羟基和相邻核苷酸的5’磷酸基团以酯键相连接，因此必定有一个末端核苷酸残基的5’碳原子携带游离的磷酸基团（5’端），另一端核苷酸残基的3’碳原子上仍保留羟基（3’端）。

核苷酸是核酸的结构单位，它们通过3’，5’-磷酸二酯键相互连接，形成无分支的线性核酸大分子。多核苷酸骨架由核糖核磷酸集团组成，故核酸具有较强的极性。 4. 简述DNA双螺旋结构模型的建立过程。

1）1950年，美国化学家Chargaff发现DNA中嘌呤和嘧啶的含量相等；

2）1951年，英国物理学家M. Wilkins等对DNA钠盐纤维进行X衍射发现，DNA分子由两条链形成螺旋结构；

3）结晶学提供的数据表明，A-T配对及C-G配对非常合理，从其氢键形成的键长和键角来看，也是合理的；

4）在此基础上，Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构模型。 5. 简述肺炎双球菌转化实验的过程及意义。 过程： A. Griffith的实验

1）将活的R型菌注入小鼠体内，小鼠存活；2）将活的S型菌注入小鼠体内，小鼠死亡；3）将死的S型菌注入小鼠体内，小鼠存活； 4）将活的R型菌和死的S型菌同时注入小鼠体内，小鼠死亡。 B. O. Averry的实验

1）将R型菌与S菌的DNA共同培养，得到活的R型菌和活的S型菌，注入小鼠体内，小鼠死亡；2）将R型菌与S型菌的多糖或蛋白质培养，只能得到活的R型菌，注入小鼠体内，小鼠存活；3）将R型菌与S型菌的DNA和DNA水解酶共同培养，也只得到活的R型菌，注入小鼠体内，小鼠存活。

结论：完整的S型菌只有DNA才能使R型菌转化为S型菌。 意义：第一次证明了DNA是遗传物质。 6. 简述DNA双螺旋的主要特征。

1）DNA分子由两条反向平行的多聚脱氧核糖核苷酸链组成，它们围绕一个中心形成右手双螺旋，其直径约为2.0 nm，螺距为3.4 nm，两个相邻碱基对之间的轴向距离为0.34 nm，反向差36°，每周含大约10个碱基对；

2）在DNA分子中，磷酸-核糖通过3’，5’-磷酸二酯键相连形成亲水性骨架位于双螺旋外侧，疏水性碱基位于双链内侧；上下相邻的碱基平面互相平行，与中心轴垂直，核糖平面与轴平行；

3）DNA分子的两条链通过嘌呤-嘧啶配对的方式相结合，A与T形成2个氢键，C与G形成3个氢键。DNA双螺旋结构进限定碱基配对的方式，并没有限制碱基的排列顺序；

4）碱基配对的方向性及排列的不对称性，使DNA双螺旋表面形成一大一小两条螺线凹沟。

7. 简述Z-DNA的主要特征和功能。

主要特征：Z-DNA为左手螺旋，结构更细长。螺旋每周含12个碱基对，直径仅1.8 nm，螺距长达4.56 nm。在嘌呤和嘧啶交替排列的情况下出现Z-DNA。

功能：（推测）Z-DNA是转录必须的；E3L可以稳定Z-DNA，促进抗凋亡基因的表达；干扰E3L与Z-DNA的结合，可以抑制某些基因的活性。 8. 稳定DNA双螺旋结构的作用力有哪些？

稳定DNA双螺旋结构的作用力主要为氢键（横向力）和碱基堆积力，包括范德华力和疏水性相互作用（纵向力）。

9. 比较DNA topoisomers （松弛型cccDNA，线性，高度超螺旋）的电泳行为。 电泳速率：松弛型cccDNA<线性<高度超螺旋。 10. 简述topoisomerases的类型、功能及作用机制。

DNA拓扑异构酶可以分两类：叫拓扑异构酶I和叫拓扑异构酶II。

拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。

拓扑异构酶II能同时断裂并连接双链DNA。它们通常需要能量辅因子ATP。在拓扑异构酶II中又可以分为两个亚类：一个亚类是DNA旋转酶，其主要功能为引入负超螺旋（迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶）；另一个亚类是转变超螺旋DNA（包括正超螺旋和负超螺旋）成为没有超螺旋的松弛形式。这一类酶在原核生物和真核生物中都有发现。

RNA

1. 名词解释

1）non-Waston-crick base pair 非Waston-Crick碱基配对，即不满足Waston-Crick的A-T、G-C配对方式，如RNA中的G-U配对，它可以增强RNA自身的互补能力。

2）Hammerhead ribozyme 锤头状核酶，它是一种序列特异性的核糖核酸酶，从一种RNA病毒中得到，其依赖自我剪切得以复制。病毒复制时，连续的RNA链上产生多个拷贝，单个类病毒由剪切产生，这种剪切由结合处周围的RNA序列催化。这样的自我剪切序列由于其二级结构类似锤头而被称为锤头结构，每个锤头结构又三个配对的柄组成，包围着起催化作用的不互补的核苷酸中心，其三级结构接近于Y字型。

3）Nonsense suppression 无义校正，即通过抑制tRNA识别无义突变位点，将某种氨基酸插入该位点，似的多肽链继续延伸而不中途停止，称为无义校正。

4）Cistron 顺反子，即编码一条多肽链的核苷酸序列，对应于一条多肽链的DNA片段加上起始信号、终止信号称也称顺反子，既可以是DNA，也可以用于mRNA。

5）SD sequence SD序列，即在原核mRNA起始密码AUG上游存在的一段富含嘌呤的序列，它可以跟16 S rRNA 3’端序列互补，是核糖体的结合位点，帮助从起始AUG处开始翻译。 6）Kozak sequence真核生物mRNA上功能类似SD序列的保守区段称为Kozak sequence。它位于起始密码子AUG（通常后面又是一个G）上游3个碱基的位置，与起始密码子一起形成(gcc)gccRccAUGG的一段保守序列（R是嘌呤，A或者G）。

7）RNAi RNA干扰，是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。 2. 简述tRNA分子的一、二、三级结构的主要特征。

一级结构：

1）分子较小，一般为70~90 nt；

2）分子中大约有20个核苷酸比较保守，其中10多个保守，余者为半保守；

3）成熟tRNA的5’端多为pG（或pC），3’端为-CCA，活化氨基酸连接于3’端A的3’-OH； 4）大部分修饰（或稀有）碱基存在于tRNA，在所有核酸分子中tRNA的修饰水平最高。

二级结构：三叶草结构

1）特征性三叶草结构有4个茎和4个环组成：①氨基酸接受茎，含3’-CCA；②D茎和D环（含2个双氢尿嘧啶）；③反密码子茎和反密码子环（其中3个碱基和mRNA的密码子互补）；④TΨC环，与核糖体5S rRNA某些保守碱基互补；⑤可变环；

2）几乎所有的保守和半保守的碱基都存在于环，尤其是D环，反密码环和TΨC环；

3）四个茎形成右手螺旋结构，参数类似于A-DNA，常有G-U配对。3’端的-CAA为单链区，成单链右手螺旋；

4）不同tRNA分子长度的差别，主要取决于D环河可变环的碱基数。 三级结构：倒“L”型

1）三维构象为倒L型，两个相互垂直的双螺旋区囊括了tRNA分子的大部分碱基； 2）倒L构象两端分别是tRNA的两个主要功能区，一端连接特异氨基酸的tRNA 3’端-CCA，另一端是与mRNA密码子互补的反密码子环，在空间间隔达到最大限度；

3）维持三级结构的作用力是三级氢键。

3. 简述aminoacyl-tRNA synthetase （ARS）的类型及其功能。

氨酰tRNA合成酶（ARS）功能：催化特定氨基酸或其前体与对应tRNA发生酯化反应而形成氨酰tRNA（连接反应的第一步是在合成酶作用下，ATP分子和对应的氨基酸（或其前体）结合形成氨酰-AMP（腺苷酸），并释放出无机焦磷酸（PPi）。然后，酶与氨酰-AMP复合物再与正确的tRNA分子结合，催化氨基酸从氨酰-AMP转移到tRNA的3'端-CCA的3'-羟基上。）

类型：根据序列和活性位点的结构的不同，氨酰tRNA合成酶可以被分为两大类。 类型I含有两个高度保守的序列基序，这类酶所催化的氨酰化发生在tRNA上A的2'-OH上，然后转移到3’-OH，并且酶分子通常的活性形式主要为单体。

类型II含有三个高度保守的序列基序，这类酶所催化的氨酰化发生在tRNA上同一个腺苷的3'-羟基上，并且酶分子通常的活性形式主要为二聚体。

4. 2009年Nobel Prize in Chemistry授予的三位科学家的主要贡献是什么？

“For studies of the structure and function of the ribosome”

5. 在Peptide bond formation的过程中，peptidyl-tRNA的2-OH of final “A”的作用是什么？ 起到质子穿梭（proton shuttle）的作用。 6. 如何确保Aminoacyl-tRNA的生成“very accurate”？

tRNA与氨基酸结合的特异性、tRNA反密码子与mRNA密码子结合的特异性及tRNA的校正功能。

7. 5S rRNA在核糖体中的作用是什么？

在核糖体中至少有9个功能中心，5S rRNA并不直接把P或者A位点与tRNA连接，也没有其它酶的作用，但它独特的空间位置把整个功能中心连接起来，来协调核糖体的作用中心。

8. 5.8S rRNA在进化中的来源是什么？

来源于原核生物的23 S rRNA。

Chapter 9 DNA biosynthesis & DNA

damage repair

1. 名词解释

1）Meselson-Stahl experiment Matthew Meselson 与Franklin Stahl 在1958年所做的实验，证明了DNA复制的半保留性质。（实验大体过程：首先将大肠杆菌在含有

15

N的培养基中培

3）DNase I footprinting DNA酶I足迹，一种确定DNA结合蛋白在DNA分子上的结合位点的方法。（其原理是：将含有特定顺式元件的双链DNA片段进行单链单末端标记，与初步纯化的DNA结合蛋白在体外行结合作用，然后加入DNase I对DNA一蛋白质复合物进行随机切割，产生一系列不同长度的DNA片段，其相邻片段只相差一个核苷酸。DNA结合蛋白与其特异序列结合后，由于空间位阻等多种效应，DNase I不能对其进行切割，通过PAGE电泳可以进行甄别。）

4）Rho-dependent terminator依赖ρ的终止子，即需要特异的ρ因子和RNA聚合酶相互作用，才能使转录终止，该终止子的特点是在转录产物实际终止位点上游有一个富含C的50~90的碱基序列。

5）Rho-independent terminator不依赖ρ因子的终止子，即RNA聚合酶终止转录并不需要辅助因子，而依靠转录产物形成特殊的发夹式二级结构，其特征是具有反向重复序列和3’末端具有4~6个U。

6）Antitermination 抗终止作用，是指抗终止因子结合于RNA聚合酶，使其顺利通过终止子，连续转录下游基因的过程，是细菌和噬菌体基因转录调控的一种方式。

7）Promoter 启动子，RNA聚合酶与模板链结合并完成转录起始所必须的DNA序列，它决定了哪一段DNA被转录。

2. 如何用DNA的一条链表示碱基序列？

用DNA的非模板链（或正义链）来表示碱基序列。 3. E. coli RNAP的全酶是如何组成的？核心酶是如何组成的？

E. coli RNAP的全酶由2个α亚基、1个β亚基、1个β’亚基、1个ω亚基和一个δ（最常见的是δ70）亚基组成；其核心酶由2个α亚基、1个β亚基、1个β’亚基组成（注：课上讲的是这四种亚基，Waston的书上包含ω亚基）。 4. 简述所有RNAP核心酶的结构特征。

RNAP的形状像一个蟹夹，蟹夹的两个钳子由各个酶的两个最大亚基组成，酶的活性位点由这两个亚基的区域共同组成，钳子的基部被称为“活性中心裂缝”，活性位点的工作原理根据双金属离子催化添加核苷酸的机制。

5. 为什么说RNAP的活性位点跟DNAP的相似？两者是否有共同起源？

这两种酶活性位点的工作原理类似，都是根据双金属离子催化添加磷酸的机制：第一个Mg2+起到去质子的作用，利于亲核攻击；第二个起到固定底物的作用（在RNAP中，Mg2+不在酶上，而是与底物连在一起，作用与DNAP聚合酶类似）。

X晶体衍射发现，除了在活性位点上的Mg2+，它们在结构上没有关联。模板依赖的酶可能经历了两次独立的进化，一支形成今天的DNAP、RT及单亚基的RNAP，另一支形成了现在多亚基的RNAP。

6. 简述现代细胞RNAP的进化假说。

RNAP远古结构域：双Psi 桶状结构域→二聚化→获得Lys残基（定位模板）→获得Asp残基（螯合Mg2+）→获得环状结构域→最大的亚基形成其活性位点。 7. 简述转录循环周期。

简言之，转录周期有起始、延伸和终止三个过程组成。

1）起始：RNA聚合酶识别并结合于启动子，将启动子DNA双螺旋局部解成单链，使模板链的碱基能够和底物核苷酸的碱基配对。RNA聚合酶停留在启动子，合转录产物的前大约10个核苷酸的磷酸二酯键。

2）延伸：RNA聚合酶沿DNA运动，转录泡随之前进。RNA聚合酶解开前方的DNA及延长的RNA与DNA的配对，并且执行校正功能。

3）终止：RNA聚合酶转录了整个基因，停下来释放RNA产物，需要终止子的帮助。 8. 简述真核RNAP的类型及其功能。

真核RNAP总共有三类：RNAP I，转录大核糖体RNA前体基因；RNAP II，转录几乎所有编码的蛋白质；RNAP III，转录tRNA基因、小的核RNA基因和5S rRNA基因。 9. 简述细菌δ70启动子的特征。

两段6个核苷酸长的保守序列，被长为17~19个核苷酸的非特异序列所分割。这两段保守区域分别位于RNA合成起始位点的-10区（共有序列为TATAAT）及-30区（共有序列为TTGACA）。

另一类的δ70启动子缺乏-35区，但有延长的-10区元件。 10. 简述δ70因子的结构特征和主要功能。

δ70因子可以分成4个区域，称为1~δ区域4。δ区域的2和4（形成HTH，一个螺旋与-35接触，另一个与DNA骨架接触）分别识别-10和-35区，区域1识别鉴别子（discriminator），区域3识别“延长的”-10。其中，对DNA解旋的部分存在于δ区域2.3。 11. 简述起始转录的机制。

机制有三：1）瞬间漂移：RNA聚合酶正向反相的瞬时迁移循环。聚合酶离开启动子沿着DNA模板移动一小段，合成一小段转录物，然后流产，释放转录物，再回到其启动子的原始位置；2）尺蠖移动：聚合酶有一个具伸缩的原件，使得聚合酶前方含有活性位点的部件往下移动，合成一小段转录物，然后流产，再收缩回到其仍在启动子上的酶主体；3）蜷缩：位于固定位置的、与启动子结合的、聚合酶下游的DNA被拉进来，目前认为该模型反应了真实情况。

简言之：1）瞬间漂移：聚合酶沿DNA移动；2）尺蠖移动：酶的前半部分沿DNA移动，由于酶具有伸缩性的区域，酶的后半部分可以固定在启动子上；3）蜷缩：酶保持固定，把DNA拉过来。

12. E. coli的强启动子有哪些特征？

1）启动子的-35区和-10区与共有序列高度一致；2）启动子有UP-element。这两个特点保证了与RNA聚合酶的易被募集。 13. 简述RNAP的校正功能。

简言之，RNAP校正功能有二：焦磷酸解编辑及水解编辑。

焦磷酸化编辑：在此状态下，聚合酶利用它的活性位点，在一个简单的逆向反应中，通过重新加入PPi，催化错误插入的核糖核苷酸去除，然后聚合酶将正确的RNA加入相应位置；水解编辑：在此状态下，聚合酶倒退一个或更多的核苷酸并切开RNA产物，去掉错误的序列。

复习题（2） 1. 名词解释

（1）cis-acting elements 顺式作用元件，是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列，一般为调控DNA序列。按功能特性，真核基因顺式作用元件包括启动子、增强子及沉默子等。

（2）trans-acting factors 反式作用因子，是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元

件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质，包括DNA结合域及转录激活域。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。这种调节蛋白称反式作用因子。

（3）Core promoter of RNAP II RNA聚合酶II核心启动子，是指在体外检测时，DNAP II机器精确的起始转录所需要的最少的一组序列元件，大约有40 nt，包括BRE、TATA box、Inr、DPE及DCE。

（4）PSE 启动子邻近序列元件，是指在核心启动子上游100~200nt的范围内所存在的转录调控区，其功能是提高转录效率和特异性，当核心启动子缺乏时，它可以决定转录起点，包括GC/CAAT box。

（5）Transcription factors 转录因子，在真核基因转录起始阶段，识别结合启动子的特异蛋白为转录因子。

（6）EMSA 电泳迁移率变动分析，其原理是如果转录因子结合于顺式作用元件，后者的电泳迁移率将减慢，故可用来鉴定转录调节因子的存在。

（7）Transcription of viral RNA RNA病毒的转录，指RNA病毒为翻译蛋白而合成的亚基因的mRNA。

（8）Replication of viral RNA RNA病毒的复制，指RNA病毒为包装到病毒体而合成全长的基因组RNA的过程。

2. 真核生物promoter的转录如何受到activators和repressor的调控（略）？ 3. 简述Transcription initiation by RNAP II的过程。

前起始复合物在TATA box处形成。首先，TFIID识别TATA box（TBP结合TATA box，TAF识别启动子其它核心元件）。TBP与DNA结合使其变形，募集其它转录因子及转录酶。这些蛋白在启动子处按以下顺序组装：TFIIA、TFIIB、TFIIF与聚合酶，然后是TFIIE和TFIIH，形成前起始复合物。在ATP的作用下，TFIIH使RNAP II的CTD磷酸化，并使的启动子解旋，RNAP II从启动子移动，在延伸过程中保留了TBP。

4. Eukaryotic DNA-bound activators的结构特征是什么？其DNA binding domain和Activation domains 有哪些主要类型？

真核DNA结合活化蛋白由三个结构域构成：DNA结合结构域、活化结构域及柔性蛋白结构域。其中，DNA结合结构域只有一个，但活化结构域数目不定，位置也不固定。

DNA结合结构域主要有四种：同源结构域、锌指结构、亮氨酸拉链结构及螺旋-环-螺旋；活化结构域主要有三：酸性结构、富含Gln结构及富含Pro结构。 5. 如何证明“An activator has independent domains”？

An activator具有活化结构域及DNA结合结构域两个独立的元件，可以用以下实验证明：酵母的Gal4是一个activator，而LexA是一种Repressor，构建半乳糖苷酶的真核表达载体，当正常的Gal4与跟其启动子金结合后，Lac Z基因启动，表达半乳糖苷酶，可以与X-gal反应呈蓝色。构建Gal4活化结构域-LexA DNA结合结构域的嵌合蛋白，结合位点不变，则没有蓝色反应，说明基因未启动。然后将结合位点突变成LexA，则出现蓝色反应，基因被启动。三个实验证明activator具有独立的结构域。

6. Eukaryotic pre-initiation complex是如何组装的？简述各主要组分的功能。

TFIID识别TATA box。TBP与DNA结合使其变形，募集其它转录因子及转录酶。这些蛋白在启动子处按以下顺序组装：TFIIA、TFIIB、TFIIF与聚合酶，然后是TFIIE和TFIIH，形成前起始复合物。

TBP结合TATA box，决定起始转录位点，TAF识别启动子其它核心元件，起辅助作用，TFIIA、TFIIB可能是聚合酶与TBP-TATA box的桥梁，TFIIF稳定DNA-TBP-TFIIB，是TFIIE和TFIIH被募集的前提，TFIIE募集TFIIH及调控，TFIIH具有ATP酶、激酶及解旋酶的活性。

7. 简述Transcription initiation by RNAPⅠ& RNAP Ⅲ的过程（略）。 8. 为什么说TBP是真核生物基因转录起始最重要的通用转录因子？

TBP是三种真核RNAP的通用转录因子，它能够和不同的因子及RNAP相互作用，以便识别不同类型的启动子。对于RNAP II，即使缺乏TATA box，TBP也是必不可少的，因为它可以募集RNAP II。同时，TBP是唯一的与特异DNA序列接触的通用转录因子。

养数代，等这些细菌的DNA只含有氮15N之后，再放入含有14N的培养基中培养，培养1代后，抽取样本提取DNA，再采用氯化铯密度梯度离心法分析。结果发现提取的DNA样本分子密度位于重密度和轻密度之间，如果复制为全保留，那么将只有重密度及轻密度两种DNA的存在。接着，它们提取了第2代DNA，发现一半为中间密度，一半为轻密度，排除了散布式DNA复制的可能。最终实验结果证明了半保守复制模型的正确性。）

2）Leading strands 前导链，即在DNA复制过程中，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制，这条先合成的链即为前导链。

3）Lagging strands 后随链，即在DNA复制过程中，另一条链的合成方向和复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干小片段分别合成，然后连接起来，这条后合成的链即为前导链。

4）Replication fork 复制叉，双螺旋DNA复制时，在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。

5）Semidiscontinuous replication 半不连续复制，即DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上DNA的合成是不连续的，故称为半不连续复制。

6）Klenow fragment Klenow片段，E. coli DNA聚合酶I经过枯草芽孢杆菌蛋白酶酶切后去除了的5’到3’外切酶活性，保留3’到5’的外切酶活性和5’到3’的聚合功能的大片段即为Klenow片段，而可用于DNA双链末端3’突出端切平和5’突出端补平反应。

7）Nick translation 切口平移，当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E. coli DNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3’-OH末端。同时该酶具有从5’→3’的核酸外切酶活性，能从切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3’端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动。

8）Sliding DNA clamps 滑动DNA架子，是一种促持续合成能力的因子，它是DNA聚合酶III全酶的组成成分。在DNA复制过程中，它可以在模板上滑动，并跟DNA聚合酶结合防止其从模板上脱落，因此叫做滑动DNA夹子。

9）Replisome 复制体，即复制叉下所有功能蛋白的联合体。

10）Replicon 复制子，是DNA复制时从一个DNA复制起点开始最终由这个起点起始的复制叉完成的片段，由复制基因和起始因子完成起始。

11）Initiator 起始因子，是一种特异性地识别复制基因中一个DNA序列并激活复制起始的蛋白质。

12）t-loop t-环，由端粒3’单链DNA末端向端粒的双链DNA区域插入产生的环状结构，由于端粒酶不能识别环状端粒，所以t-loop可以控制端粒的长度。

13）Transition/transversion mutatins 转换/颠换，嘌呤与嘌呤或嘧啶与嘧啶之间的突变为转换，嘌呤与嘧啶之间的突变为颠换。

14）AP site AP位点， DNA双螺旋中因丢失碱基而上形成的去嘌呤或去嘧啶的位点统称为AP位点。

15）Photoreactivation 光修复，光裂合酶将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解的过程为光修复，是一种直接修复。

16）Base excision repair （BER）碱基切除修复，DNA糖苷水解酶切除DNA分子中受损碱基而产生AP位点，AP核酸内切酶在5’端切断DNA骨架的磷酸二酯键，并由磷酸二酯酶切除脱氧核苷酸残基，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链，这一过程即为碱基切除修复。

17）Nucleotide excision repair（NER）核苷酸切除修复，这种方式可以修复DNA中几乎所有类型的损伤，DNA出现损伤时，多酶复合物识别变形的损伤部位，复合物在其两侧切断DNA，解旋酶将包括损伤在内的DNA片段除去，最后由DNA聚合酶和连接酶完成修复的过程为核苷酸切除修复。

18）Fail-safe glycosylase 自动防故障装置，是一种受损碱基在DNA复制之前没有通过碱基切除的补救机制。由于G的氧化而产生的oxoG:A配对，会有专门的糖基化酶识别并除去未受损的A。同样，在T:G配对中，糖基化酶会认为T是5-甲基胞嘧啶脱氨基产生的而除去T，使其被C取代。

19）Nonhomologous end joining（NEHJ）非同源末端连接，是主要发生在真核生物中的一种修复，其机制是通过断裂末端突出的单链之间错排配对，断裂DNA的两个末端直接相连，由于断裂末端信息丢失，NEHJ的修复具有致变性。

20）SOS response SOS应答，是一种复制后DNA修复系统，它允许DNA的复制可以跨过DNA中的损伤或错误，修复中要使用RecA。

21）Translesion DNA synthesis 跨损伤DNA合成，正在复制的DNA聚合酶遇到没有被修复的损伤，复制机器跨过损伤来完成复制，这种机制就叫跨损伤合成。它由一类特化的DNA聚合酶催化，可以越过损伤部位直接合成DNA。

22）Provirus 前病毒，一种细胞内病毒DNA，它可以整合到宿主细胞基因组，或已整合在宿主细胞基因组中，可随细胞的传代而垂直传播。

2. 简述在DNA复制过程中DNAP的主要底物与合成DNA的机制。

底物：dNTP、引物-模板的接头；

机制：DNA的合成被称为DNA聚合酶的酶所催化，此酶利用单一活性位点来添加4种dNTP前体。

3. 在DNA复制过程中的引物有哪些？

主要有三种：一种是原核生物种由引发酶或DNAP α产生的RNA引物，一种是DNA引物，存在于噬菌体的滚环复制中，还有一种是核苷酸引物，存在于腺病毒中。 4. 如何证明Bidirectional replication？

正在复制的SV40 DNA经过EcoR I酶切后，在电镜下可以发现若干大小不等的复制泡，其中心到两端的距离恒定，提示复制的双向性。 5. 简述E. coli DNA replication initiation的过程。

1）DnaA-ATP与9核苷酸的重复序列结合，产生卷曲DNA复合物； 2）13核苷酸的重复序列变性，形成开放的复合物； 3）在加载蛋白DnaC的帮助下，解旋酶DnaB打开双链。 6. 简述DNA 解旋酶的主要结构特征和功能。

DNA解旋酶为六聚体，含有ATP的结合位点及水解位点，具有极性。它的每个亚基都经历与ATP结合、与ADP结合及没有核酸相连的状态，然后是三个过程的重复，利用ATP水解释放出的能量移动DNA，使其双链打开。 7. 简述Final step in lagging strand synthesis。

DNA聚合酶I切除RNA引物（5’→3’外切），并填补两个冈崎片段的缺口（聚合酶活性），DNA连接酶将3’-OH和5’-磷酸基团连接起来。 8. 简述DNAP III 全酶主要结构特征和各主要组分功能。

DNA聚合酶III主要由四部分组成：1）核心酶，用来合成前导链和后随链；2）τ亚基

二聚体，稳定模板与核心酶的结合； 3）γ复合物，把β亚基装载到后随链的冈崎片段上；4）β亚基二聚体，是DNA的滑动夹子，防止DNA聚合酶从DNA链上脱落。 9. 简述DNAP的三维结构主要结构特征和各主要组分功能。

DNA聚合酶的三维结构像一只半张开的右手，有拇指、手指和手掌组成。

1）手指：①跟引入的dNTP结合，一旦形成正确的碱基配对，手指包住dNTP；②与模板结合，使其磷酸二酯键骨架在活性部位产生约90°的回折，引物后第一个模板碱基暴露，避免了碱基选择的混淆；2）手掌：①校正功能；②监督是否在引物-模板结合处形成正确的碱基对。3）拇指：与催化没有直接关系，它可以在活性位点维持引物-模板的正确位置，并降低解离速率。

10. 为什么DNAP能够选择正确配对的碱基对？

只有在正确配对的情况下，引物3’-OH和在最佳催化位置上的引入核苷三磷酸的α-磷酸才能发生催化反应，不正确的碱基配对使底物处于不利于催化的排列，使得核苷酸的添加效率显著降低。

11. 细胞内rNTP的浓度比dNTP高很多，DNAP却选择后者，为什么？

在DNA聚合酶中，核苷酸结合口袋非常小，不能容纳引入核苷酸上的2’-OH，因此rNTP被排斥在聚合酶活性位点之外。

12. 简述两种金属离子在DNA复制过程中的作用。

一种金属离子主要通过与3’-OH作用，去质子产生亲核攻击的O负离子；另一种与引入的dNTP的三磷酸相互作用，中和它的电荷，起到固定底物的作用。 13. 简述复制工厂假说。

有两种结束时DNA和复制机器相对运动的观点。一种认为复制机器沿着DNA以类似火车沿着轨道的方式运动，触及DNA的两条链得到复制，即两个解旋酶独立工作；另一种观点认为，复制机器是静止的，而DNA在运动，两个DNA解旋酶相互连接，一个DNA聚合酶III全酶只用Waston链为模板，另一个只用Crick链做模板。 14. 简述复制起始甲基化和SeqA蛋白的作用。

只有起始位点完全甲基化才能开始复制，Dam甲基化酶是半甲基化变为完全甲基化。SeqA的作用是阻止全甲基化，并且抑制Dna A与OriC的结合。 15. 简述E. coli、SV40和S. cerevisiea的Replicator主要特征。 其主要特征就是在其复制基因中含共有序列。

16. 真核细胞如何确保每条染色体在每个细胞周期中均复制一次，并且只复制一次？ 通过以下两个机制完成：1）有充足的复制起点，以满足每个S期每条染色体都复制；2）已经复制的复制起点不被再次启动，以保证只复制一次。 17. 比较细菌与真核生物复制引物的主要区别。

细菌的引物由引发酶合成，真核生物的引物由DNAP的α亚基合成。 18. 简述真核细胞复制过程中DNAP 转换。

引发酶合成RNA引物后，产生的RNA引物-模板街头立即与DNA聚合酶的α结合以启动DNA的合成。因为DNA Pol α/引发酶的延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代，DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代DNA Pol α/引发酶的过程就是聚合酶的转换。

19. 简述真核细胞复制过程中去除RNA引物的机制。

主要有两种：一种先由RNase HI进行5’→3’外切，剩下最后一个碱基时，由FEN1切

除；另一种由Dna2解旋，然后由FEN1切除引物。 20. 何谓真核细胞过程中“末端复制问题”？应该如何解决？

当后随链复制机器到达染色体末端时，引物酶没有足够的空间去合成新的RNA引物，将导致后随链DNA产物上3’端形成一小段单链DNA，进行下一轮复制时，两个产物中的一个将变短，上一轮没有被复制的区域将丢失，此为末端复制问题。

真核生物通过端粒解决了该问题。首先，端粒酶用其RNA成分与端粒单链DNA的3’端结合，随后利用其反转录活性合成DNA至RNA模板末端，然后端粒酶将RNA从DNA产物上移去并重新结合到端粒的末端，重复上面的过程。只要后随链模板的3’端延伸到足够长，后随链的最后一个冈崎片段就可以完全合成，从而产生完整的子染色单体。 21. 2009年诺贝尔生理或医学奖获得者的主要贡献是什么？ 发现了端粒如何保护染色体，并且发现了端粒酶。 22. 高保真DNA复制主要和哪些因素（步骤）有关？

1）碱基正确的Waston-Crick配对，正好跟DNAP的活性中心相吻合，错误的配对将被排除出活性位点；

2）所有的DNAP都具有相同的三维结构：半张开的右手。它具有校正功能并使正确的碱基对的形成；

3）由于构象不同产生的错配，可以由DNAP在复制过程中得到校正； 4）DNA复制过程中以可以消除的RNA做引物； 5）DNA聚合酶的复制方向为5’→3’；

6）DNA本身包含了可以被校正的遗传信息，比如以T而不用U做碱基。 23. DNA复制为什么必须有引物？为什么没有3’→5’方向的DNA聚合酶？

DNA聚合酶I具有先校正后合成的功能，如果没有引物的存在其校正的功能不能进行，其合成受阻。如果进行3’→5’合成，长链的5’端带有活性的三磷酸基团，这样如果发生复制错误，使核苷酸切除，产生的5’端将丢失两个磷酸基团，正确的核苷酸无法再次加入导致复制终止。

24. 简述Topoisomerases在复制中的作用。

简言之，拓扑异构酶除去DNA解螺旋在复制叉上产生的超螺旋。它通过断裂一条或者两条DNA链但不让其脱落，并且让等数目的DNA链通过缺口来完成。 25. 遗传信息的突变来源主要有哪些？

1）DNA复制产生误差；2）DNA遭受物理或化学损伤；3）转座子的转座作用。 26. 简述E. coli和人DNA复制中如何进行错配修复？

E. coli：首先，MutS扫描DNA链，识别变形的突变位点，然后募集MutL，MutL激活MutH，MutH在错配位点附近产生切口，切的链为非甲基化的链，最后通过DNAP III完成修复。

人的修复过程与其类似，其MSH与MutS同源，MLH与MutL同源，但没有MutH的同源物。由于其没有甲基化标记，可能通过PCNA-MSH的相互作用，将MSH等修复蛋白募集到前导/后随链的合成位点。

27. 有哪些因素可能造成体内DNA损伤？

1）碱基类似物：烷化物，羟化物，去氨基物质；2）可插入碱基的物质（如EB）；3）离子射线，紫外线；4）转座元件，包括逆转录病毒。 28. 体内有哪些NDA损伤修复系统？

直接修复（错配修复、光激活），碱基切除修复，核苷酸切除修复，DSB（真核NHEJ），跨损伤DNA合成。

29. 举例说明DNA损伤导致的突变及其修复机制。

由于紫外线的照射产生嘧啶二聚体，可通过直接修复的方式来完成，即光解酶在可见光的作用下，打开嘧啶二聚体。

30. 真核生物经常发生G:T错配，为什么？如何修复？

由于C脱氨基形成U，这样就形成了G:T错配，可以通过碱基切除修复来完成。DNA糖苷水解酶切除DNA分子中的T而产生AP位点，AP核酸内切酶在5’端切断DNA骨架的磷酸二酯键，并由磷酸二酯酶切除脱氧核苷酸残基，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链（同BER）。

31. 简述E. coli NER途径，并与真核生物NER进行比较。

E. coli NER：1）UvrA和UvrB扫描DNA，寻找扭曲；2）UvrA离开复合体，UvrB在扭曲附近将DNA解螺旋；3）UvrC与UvrB形成复合体，UvrC在损伤的5’及3’端产生缺口；4）UvrD将单链片段释放出来，DNA聚合酶I和连接酶对缺口进行修复和填补。

真核生物的NER与原核类似，XPC检测变形，与UvrA类似；XPA & XPD解螺旋，与UvrB类似；ERCCI-XPF切割5’端，XPG切尔3’端，两者与UvrD类似。 32. 何谓“转录偶联的DNA修复”？

NER不仅可以修复损伤，而且在转录过程中也可以帮助RNAP免于模板损伤的困境，在转录偶联的修复中，NER相关蛋白募集到RNAP。 33. DSB损伤是如何形成的？其修复机制有哪些？

1）模板链有缺口，导致复制叉停止前进，最后启动重组的双链断裂；2）模板链有DNA损伤，导致复制叉停止，使复制叉复返，最后启动重组的双链断裂。 34. 简述E. coli修复DSB损伤过程，与人类修复DSB方式比较（略）。

双链破坏→带有3’端单链的间断DNA→3’端得侵入→第二条链的入侵和DNA有3’端开始的修复合成→分支移位和两个Holliday中间体的形成→Holliay连接体的拆分 35. Baltimore和Temin为何荣获1975年Nobel生理学或医学奖？ Temin发现了逆转录现象，Baltimore和Temin分别找到了逆转录酶。 36. 逆转录酶有哪些活性？能自我复制能力的逆转录病毒有哪些基因？

逆转录酶的活性有三：RNA指导的DNA聚合酶；DNA指导的聚合酶；RNase H活性（5’→3’ & 3’→5’）。

基因有三：gap（编码病毒四种核心蛋白，即衣壳）；pol（编码逆转录酶、蛋白酶及整合酶）；env（编码磷脂双分子层的糖蛋白）。

Chapter 10 RNA Biosynthesis

复习题（1） 1. 名词解释

1）Gene expression 基因表达，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质的过程。

2）C-terminal domain （CTD）C-末端结构域，存在于真核生物RNAP II的最大亚基的C末端，具有7个核苷酸的重复序列，磷酸化的CTD是转录延伸起始所必须，并且可以对mRNA进行修饰。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/xiqv.html