禽流感病毒中和实验教学大全整理

禽流感病毒中和实验及其他方法

（一）实验材料 1、中和反应实验材料 (1)病毒：

一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50）的滴定。 (2)血清样品

包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。－20℃储存，避免多次反复冻融。

(3)MDCK细胞和细胞培养试剂 1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞）

2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌 500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基）

5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素） 5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔） 25.5毫升 56℃、30分钟加热灭活的牛血清 3)胰酶 / EDTA (4)其它

1)平底96孔微量培养板

2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM

66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA） 5毫升 100×抗生素

3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升） 4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃保存 400毫升 丙酮 100毫升 PBS，PH 7.2 2、ELISA实验材料

(1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体 (2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20 4升 PBS，PH 7.2 2毫升 TWEEN－20

(4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20 867毫升PBS，PH 7.2 132毫升牛血清白蛋白 1毫升TWEEN－20

(5)底物和底物溶液：

常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD） 底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M） 底物和底物溶液：10毫克OPD

20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水） 即配即用 磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.0 58.8克柠檬酸三钠 1升蒸馏水

用盐酸调节PH为5.0

加0.015%双氧水，（临用前加入）

* 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制

(6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水） 3、其他

细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义）

备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma

公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。

B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。 （二）质量控制

病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。

1、血清对照

血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，－20℃保存，并避免反复冻融使用。

(1)阴性血清对照

1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。 2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病毒。

3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。 (2)阳性血清对照

1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。 2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。

* 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。 2、病毒和细胞对照

每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。

(1)阳性和阴性细胞对照

一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量

（100TCID50）的病毒进行混合培养。同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病毒稀释液进行混合培养。

阳性细胞对照：50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。 阴性细胞对照：100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞 (2)病毒工作液滴度检查

一般第1孔加入含有200TCID50的100微升病毒液，然后进行2倍稀释，再与MDCK细胞进行混合培养。

病毒滴度检查：50微升2倍系列稀释病毒液（第1孔为100TCID50）

+50微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞（1.5×104细胞/孔） （三）实验步骤

1、病毒滴度测定（组织培养半数感染量－TCID50滴定） (1)流感病毒制备

利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝实验测定病毒的存在，分装后－70℃冻存。

(2)病毒的稀释

1)取1管冻存病毒尿囊液，1:100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液） 2)第1排孔加入146微升1:100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、10

-2.5

、10、10

-3-3.5

……10。每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔，详细操

-7

作参见图1。

* 人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2微克/毫升的TPCK－胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在的条件下即可感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀释液，以获得最佳结果。

(3)MDCK细胞的准备

1)使用前2天将MDCK细胞1:100传代，使之70~90%成片，处于对数生长期的细胞对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代）将使细胞对病毒的敏感性降低。

2)弃去细胞培养液，用5毫升胰酶 / EDTA洗细胞一次，然后弃去。

3)加4到5毫升胰酶 / EDTA覆盖细胞（162cm2的细胞培养瓶）37℃ 5%CO2温箱中消化10~20分钟。

4)待细胞开始脱落时，加5~10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细胞转入离心管中，用PBS洗2次，以去除牛血清。

5)将细胞悬浮于病毒稀释液中，用1毫升吸管充分吹打分散细胞，在细胞计数板上计数细胞数量。

6)用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升。

7)加100微升细胞（1.5×104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。 8)在37℃ 5%CO2温箱中培养18－22小时。

(4)测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）

1)弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。 2)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。 3)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。 4)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。 5)用ELISA检测细胞感染（参见ELISA部分）

6)利用ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数细胞阴性对照孔的平均OD值。

7)若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。

8)根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID50/100微升（参见附录和表2）。

9)在进行中和实验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID50流感病毒。

2、病毒微量中和实验 (1)待检血清的准备和稀释

1)检测对一种病毒的中和抗体需要10微升血清，每份血清需要进行至少1次重复测定（共需至少20微升血清/每种病毒），每块板可检测11份样品。 2)人血清需56℃加热灭活30分钟。 3)实验设计请参照图2。

4)每孔中加入50微升病毒稀释液。

5)第1排中（A1－A11）再加入40微升病毒稀释液，使之成为90微升/孔。 6)加入10微升待检血清于第1排A1－A11。

7)将待检血清作系列倍比稀释（A－H）使之成为1:10、1:20、1:40……1:1280。

(2)病毒的准备

1)稀释病毒至100TCID50/50微升。根据病毒特性选择是否在病毒稀释液中加入TPCK胰酶（大约5毫升/每板）。

2)除细胞阴性对照孔（4孔）外，每孔加入50微升病毒工作液。 3)加50微升病毒稀释液于细胞阴性对照孔。

4)选择1列孔做病毒工作液滴度核实。第1孔加入200TCID50/100微升病毒工作液，做系列倍比稀释，使之成100TCID50，50，25，12，6……0.7。然后每孔加入50微

升病毒稀释液，使体积至100微升/孔。

5)摇匀病毒－血清混合物，放37℃温箱作用2小时。

(3)MDCK细胞的准备。（参见病毒滴定测定部分）

加100微升细胞液（1.5×104细胞/孔）于含有病毒－血清混合物以及倍比稀释病毒工作液的微量板中，37℃温箱孵育18－22小时。

* 当测定大量样品时，每叠培养板一般不超过4－5块，各叠板之间要保持一定距离，以确保混合物受热均匀，从而达到良好的中和效果。

(4)细胞的固定

1)弃去微量培养板中的细胞液。 2)250微升PBS洗细胞一次。

3)弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。 4)覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。 5)弃去固定液，让微量培养板室温干燥。

3、酶联免疫吸附实验（ELISA）

ELISA的基本原理是：酶结合物与相应抗体或抗原特异性结合，再遇酶底物时，在酶的强烈催化下使原来无色的底物产生化学反应，即形成有色的产物，便可用肉眼或分光光度计定量检测其含量。该方法具有特异性、敏感性、快速性和简易性等优点。在流感病毒微量中和实验中，酶结合物（HRP标记的羊抗鼠IgG抗体）与存在于MDCK细胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物结合，HRP酶催化OPD，使无色底物形成橙黄色化合物，再由ELISA检测仪测定吸光度值，从而获得中和抗体滴度。

(1)实验操作

1)用250微升PBS洗涤微量培养板3次，以去除残余的丙酮。

2)用封闭液1：4000（或最佳稀释度）稀释抗体1（抗流感病毒核蛋白-NP单克隆抗体）

3)每孔加入稀释后的100微升抗体1，室温作用1小时。 4)用250微升洗涤液洗板4次以除去抗体1。

5)用封闭液1:2000（或最佳稀释度）稀释抗体2（HRP标记的羊抗鼠IgG）。 6)每孔加入稀释后的100微升抗体2，室温作用1小时。 7)用250微升洗涤液洗涤板6次以除区抗体2。

8)每孔加OPD底物100微升（10毫升OPD+20毫升柠檬酸缓冲液+10微升30%双氧水，即用即配）。

9)室温放10分钟左右显色，直至细胞阳性对照孔变橙黄色，而细胞阴性对照孔尚未变色时，每孔加1M硫酸100微升终止反应。 10)在ELISA测定仪上（490纳米）读出每孔OD值。

(2)结果判定

下列公式用于判定中和反应结果

（细胞阳性对照平均OD值—细胞阴性对照平均OD值）／2+细胞阴性对照平均OD值=X

X=细胞半数感染阈值，每孔OD值低于X值时，判定为中和反应阳性，中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的和抗体滴度。

* 在特殊情况下可用目测法判定结果，即加底物后，肉眼下出现橙黄色反应的为阴性。

无色为阳性。待检系列稀释血清中无色孔的最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。

* 流感病毒中和实验的质量控制

a.阴性血清对照孔的OD值应该与阳性细胞对照孔的OD值无明显差别。 b.病毒工作液滴度检测孔，上数3－5孔呈阳性反应，显示正常病毒量。 孔序 TCID50 OD值 1 100 + 2 50 + 3 25 + 4 12 + 5 6 + 6 3 － 7 1.5 － 若超过5孔阳性，则为病毒过量，若少于3孔阳性，则为病毒量不足。 c.阴性细胞对照孔的OD值一般小于0.2，阳性细胞对照孔的OD值一般在1左右。 d.每次测定中，阳性血清对照的中和抗体滴度应该在2倍之内波动。

4、操作注意事项

(1)待检人血清需56℃30分钟灭活，动物血清需RDE处理。 (2)待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。

(3)每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照OD值过低，须对病毒进行重新滴定。

(4)MDCK细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化（代数过高）。因此，必须在10代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。

(5)牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。

(6)病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时，该实验采用37℃作用2小时，但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。

(7)在ELISA过程中，每步都要洗涤，以保证结果可靠。

(8)选择合适的抗体稀释浓度，一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗体进行ELISA测定，以获得最佳稀释度。

(9)正确控制显色时间，以降低背景染色。

(10)大量测定时，为稳定培养液的PH值，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少PH变化对细胞的不利影响。

(11)在缺少病毒特异性抗体的情况下，可用细胞病变观察或测量培养板中每孔血凝活性来替代ELISA方法，但细胞培养时间须从18－22小时增至2－4天。

4、病毒TCID50 滴度的计算

组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用Reed－Muench方法计算。

(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2） (2)计算阳性和阴性孔的累积数。

阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4） (3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100

(4)计算距离比例

距离比例=（大于50%的阳性百分比－50）/（大于50%的阳性百分比－小于50%

的阳性百分比）=（75－50）/（75－0）=0.3

TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数

的对数=5+0.3×0.5=5.15

TCID50=10-5.15/100微升 100TCID50/50微升＝10-2.8 100TCID50/50微升=1:631稀释 (5)稀释系数的对数

1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7。

五、流感实验室检测中应注意的若干问题

1、禁止在同一实验室，更不应在同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。

2、禁止在同一实验室，同一时间处理，接种采自不同动物的标本；动物标本（如禽、猪等）必须与人的标本分别保存。

3、接种后剩余原始标本，尤其分离出病毒的标本需暂时冻存，有条件的应置-70℃或以下保存，以便需要时可进行复查，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。分离阴性的标本应随时弃之。

4、严禁实验室交叉污染：在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。

5、向国家流感中心送毒株时，量至少需5 ml，同时需自己保存一些，以便寄送过程发生意外时可继续补送。

6、流感病毒在-20℃～-40℃ 时不稳定，故不宜在此温度下长期保存。 7、鸡胚中分离出的流感病毒，应尽量别在MDCK细胞上传代。因当今国内所用的MDCK细胞属肿瘤细胞系，一旦病毒通过它传代就无法用于疫苗制备。

8、寄送毒株时一定需附上送检表。寄送毒株需及时，尤其鉴定不出的，异常的毒株应尽快向国家流感中心寄送。寄送时用快速直送国家流感中心。

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