血红蛋白的分离纯化与理化性质研究 - 图文

生物科学大实验

华中科技大学生命科学与技术学院 生科大实验报告

题目：血红蛋白的分离纯化与理化性质研究 专业班级：某某班 姓名：某某某

指导教师：某某某

实验时间：2015年9月28日至 2015年10月20 日 提交报告时间： 2015年11月22日

摘要

血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。在 Hb 与氧结合及释放过

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程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。

Abstract

Hemoglobin（Hb）is one of poly-subunit proteins composed of four units in the animal blood. It has the important physiological function that is the oxygen transport carrier. In the process of Hb combining with oxygen and releasing, it embodies positive cooperative effect of the interactions between the various subunits in the allosteric protein. It has a strong representative and is a good material for studying the characteristics of allosteric proteins.

Besides,its

monomer’s

structure

is

similar

to

a

major

meat

chromoprotein—Myoglobin(Mb).They are all heme protein that have a heme active center.

Mb has only one subunit, but Hb has four subunits. Hb is about four times that of Mb. Hb and Mb have three kinds of natural induced body configuration, type the oxygenation (foxy - Hb; foxy - Mb), reduced (Red - Hb; Red - Mb) and oxidation type (Met - Hb; Met - Mb). The same configuration of two proteins has the same color and similar spectroscopy characteristics.

目录

摘要--------------------------------------------------------------------------2

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目录---------------------------------------------------------------------------------------------------3 一、 选题背景

1.1血红蛋白简介---------------------------------------------5 1.2血红蛋白的生理意义及分离提纯的作用-----------------------5 二、方案论证

2.1实验材料及试剂-------------------------------------------6 2.2分析方法-------------------------------------------------6 2.2.1蛋白质浓度的测定------------------------------------6 2.2.2血红蛋白的测定--------------------------------------7 2.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳----------------------------------8 2.3血红蛋白的提取分离---------------------------------------9 2.3.1动物血液的收集与处理--------------------------------9 2.3.2红细胞的破碎和血红蛋白原液的制备--------------------9 2.3.3盐析沉淀--------------------------------------------9 2.3.4Sephadex G-75色谱纯化-------------------------------10 2.4血红蛋白的纯度鉴定---------------------------------------10 2.4.1制胶------------------------------------------------10 2.4.2架好胶板，检漏--------------------------------------11 2.4.3灌胶并水封------------------------------------------11

2.4.4制孔------------------------------------------------11 2.4.5加样------------------------------------------------11 2.4.6电泳------------------------------------------------11 2.5.7染色------------------------------------------------11 2.5.8脱色------------------------------------------------11

三、结果与讨论

3.1 蛋白质标准曲线-----------------------------------------12 3.1.1酚试剂甲液的准备-----------------------------------12 3.1.2酚试剂乙液的准备-----------------------------------12 3.1.3蛋白质标准溶液的准备-------------------------------12 3.1.4操作过程-------------------------------------------12 3.2 血红蛋白盐析曲线---------------------------------------13 3.3 Sephadex G-75 柱层析图谱-----------------------------14 3.4 各步提纯结果-------------------------------------------15 3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱---------------------------------15

四、实验总结与分析-----------------------------------------16

五、实验体会与心得-----------------------------------------16 六、参考文献-------------------------------------------------17

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一、选题背景

1.1血红蛋白简介

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血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。

为此 ,也有人用 Hb 作为成本昂贵的 Mb 的代用品来研究食用肉色调变化的规律性。而目前市售的Hb多采用冷冻干燥法制备 ,多为Met-Hb 构型,其纯度较低 ,氧合活性较差 ,且该产品不能进行诱导体构型转化的调制 ,因而不能满足人们对食用肉色调变化进行研究的要求。

用丰富而廉价动物血液为原料，通过简便生产工艺制备Hb结晶（该结晶属氧化型）可进行多种诱导体形态的调制 ,调制出的各种诱导体具有类似于天然 Hb 的氧合功能特性 ,保持了别构蛋白与底物结合的正协同效应特点 ,同时 ,具有与天然诱导体形态相同的色调变化规律和光谱学特征。因此 ,可以满足人们进行别构蛋白及食肉色调研究的需求。此结晶具有稳定的理化性质 ,可长期保存。

1.2血红蛋白的生理意义及分离提纯的作用

血红蛋白的四级结构对其运氧功能有重要意义。它能从肺携带氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。现知它的这种功能与其亚基结构的两种状态有关，在缺氧的地方（如静脉血中）亚基处于钳制状态，使氧不能与血红素结合，所以在需氧组织里可以快速地脱下氧；在含氧丰富的肺里，亚基结构呈松弛状态，使氧极易与血红素结合，从而迅速地将氧运载走。亚基结构的转换使呼吸功能高效进行。

血红蛋白分离提纯后可用于生化研究，培养流行性感冒病毒、淋球菌、兔热病杆菌、链球菌、肺炎球菌等，色素。

二、方案论证

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