20170328修订-生物化学实验指导书(2017)(1)

《生物化学》实验指导书

2017年03月28日修订

目 录

实验一 生物化学实验常用仪器设备及使用 实验二 甲醛滴定法

实验三 糖的定量：3，5－二硝基水杨酸比色法 实验四 粗脂肪提取和含量测定 实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 实验六 动物组织中脱氧核糖核酸的制备及测定

实验一 生物化学实验常用仪器设备及使用

一、生物化学实验须知

1．实验室规则

(1) 实验课必须提前5 分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。

(2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。

(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。

(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。

(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给教师。

(6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。 (7)每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。 2．实验记录

实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。

实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。

3．实验报告的书写

实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。 （1） 标题

标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。 （2） 实验目的 （3） 实验原理

1

应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。 （4）操作步骤

操作步骤(或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。 （5） 实验结果

将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示实验结果， 这样可以使实验结果清楚明了。 （6） 讨论

包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见 等。

4．生物化学实验课评分标准 ", 实验预习情况（10%） ", 实验操作情况（20%） ", 实验报告情况（30%） ", 实验考试成绩（40%）

二、生物化学实验仪器简介及实验室参观

仪器设备名称 型号、规格 国别、厂家 出厂日期 冷冻离心机 3K30 德国SIGMA公司 2004-11-01 基因扩增仪 PCT-220 美国MJ公司 2004-11-01 荧光扫描仪 Per Sonal4100A 美国Axon公司 2004-11-01 凝胶成像仪 B10-BAD CELOOCEQ* 无 2005-05-01 石英晶体分析仪 QCM922 美国A.M.T公司 2004-07-01 纳米粒度及Zeta电位分析仪 ZEN 3601 英国公司 2005-11-01 接触角测定仪 OCA20 法国DIG公司 2005-11-01 生物安全柜 LB2-4A1 新加坡公司 2005-11-01 喷射式生物芯片制备仪 Nano Plotter.NP1.2 法国Gesim公司 2005-11-01 DNA合成仪 ASM-800 俄罗斯Biosset公司 2005-11-01 荧光倒置显微镜 TE2000-U 日本尼康公司《中国》 2005-11-01 全自动比表面孔径测量分析仪 NOVA 2000e 美国康塔公司 2005-11-01 X射线衍射仪 D8 Advance 法国布鲁克公司 2005-11-01 光度计 TD 20/20n 美国普洛麦格公司 2005-11-01 超临界流体萃取设备 HA221-50-06 海安华安石油科研仪器有限公司 2006-10-01 电化学工作站 CHI660B* 上海辰华仪器公司 2005-03-01 无氧无水手套箱 Universal1220/1000/900 上海米开罗那机电公司 2005-11-01 生物发哮智能控制系统 GBIL-10LC* 镇江东方生物工程技术公司 2005-11-01 双光束紫外可见分光光度计 TU-1901* 北京普析通用仪器公司 2005-03-01 扫描电子显微镜 S-3000N SEM 日本日立公司 2006-12-11 自动核酸蛋白测定仪 U-0080D* 日本日立公司 2008-05-28 实时定量PCR仪 Option 2 BIO-RAD 美国ABI公司 2010-06-28 梯度PCR扩增仪 Veriti 美国ABI公司 2014-06-06 傅立叶变换红外光谱仪 Frontier 美国PE公司 2014-06-06

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荧光基因检测仪 Nano 瑞士Roche公司 2014-06-06 基因扩增仪 9700 美国ABI公司 2014-06-06 二氧化碳培养箱 Galaxy 170S 英国NBS公司 2014-06-06 超纯水机 PURELAB-flex 英国ELGA公司 2014-06-06 超低温冰箱 DW-86L490 青岛海尔特种电器公司 2014-12-23 振动样品磁强计 HH-15 南京南大仪器厂 2014-10-30 全自动多功能酶标仪 MK3 美国热电公司 2015-04-28 电化学工作站 CHI660E 上海辰华 2015-06-08 发酵设备 6010T 上海汇和堂 2015-06-10 微电泳分析系统 Qsep 100 台湾Bioptic公司 2015-06-30 梯度PCR MC nexus 德国EPPendorf公司 2015-06-30 荧光定量PCR Lightcycler 96 瑞士Roche公司 2015-06-30 低温热性能测试系统 DSCQ20-TGAQ50 美国TA公司 2015-06-30 凝胶成相系统 FX5 法国vilber公司 2015-06-30 快速核酸/蛋白分析仪 D30 德国EPPendorf公司 2015-06-30 高速离心机 5424 德国EPPendorf公司 2015-06-30 生物化学实验课所用仪器 高速组织匀浆机 FSH-2 索氏提取器 SXT-6 分光光度计 T6 全温培养摇床 HNY-200D 干热灭菌器 GR-30 冰箱 KK25V61TI 台式离心机 5417C 循环水泵 SHZ-3A 电子天平 AUY220 DNA扩增仪 S630 紫外可见分光光度计 T6新世纪 琼脂糖水平电泳槽 DYCP-31D 双稳定时电泳仪 DYY-6C 3

实验二 甲醛滴定法

一. 目的

了解并掌握甲醛滴定法的原理和方法。 二. 原理

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：

水溶液中的氨基酸为两性离子，不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，形成—NH—CH2OH，—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，NH3+上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨基酸，从而计算氨基酸的含量。

如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解液），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。

此外，脯氨酸与甲醛作用后，生产不稳定化合物，致使滴定结果偏低；酪氨酸的酚基结构，又可使滴定结果偏高。

甲醛滴定发常用以测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加，滴定值也增加，滴定值不再增加、保持恒定时，表明水解作用已完全。 三. 仪器、试剂、材料

1. 仪器

100ml锥形瓶（×3）；碱式滴定管25ml（×1）；吸管2.0ml（×2）、5.0ml（×2）、10ml（×1）。 2. 试剂

(1) 0.5%酚酞乙醇溶液：称0.5g酚酞溶于100ml 60%乙醇。

(2) 0.05%溴麝香草酚蓝溶液：0.05g溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液。 (3) 1%甘氨酸溶液：1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。

(4) 标准0.100mol/L氢氧化钠溶液：可用0.100mol/L标准盐酸溶液标定。

(5) 中性甲醛溶液：甲醛溶液500ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/L NaOH溶液，使溶

液呈微粉红色，临用前中和。

四. 操作方法

4

将3只100ml锥形瓶标以1、2、3号。于1、2号瓶内各加甘氨酸（或样品）2.0ml及蒸馏水5ml；于3号瓶内加蒸馏水7.0ml。向3只锥形瓶中各加中性甲醛溶液5.0ml，0.05%溴麝香草酚蓝溶液2滴及0.5%酚酞乙醇溶液4滴。然后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH 8.7~9.0）。溶液颜色由黄→绿→紫，紫色为滴定终点。

五. 结果处理

m =

（V1－V0）×1.4008

2

式中 m：1 ml 氨基酸溶液中含氨基酸氮的质量（mg）； V1：滴定样品消耗NaOH溶液的体积（ml）； V2：滴定空白消耗NaOH溶液的体积（ml）；

1.4008：每毫升0.1 mol/L氢氧化钠溶液相当的氮质量（mg/ml） 六. 注意事项

1. 临近终点时应仔细滴定，切忌滴过量。

2. 甲醛有毒，若不慎接触皮肤，应立即用水冲洗。实验过程应保持良好的通风。

3. 标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢

氧化钠。

4. 中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。

5. 本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要

求进行。

6. 脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。

七. 思考题

1． 甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？

2． 为什么NaOH溶液滴定氨基酸—NH3+上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？

3． 测氨基酸的含量时，甲醛溶液为何事先要加入酚酞并用NaOH滴定至微粉红色？

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