生物学大实验讲义

生物学大实验（硕士研究生实验课内容）

一． 细胞培养技术与方法 1. 教学目的与要求：

1) 了解细胞培养室的设置，设备和无菌操作。 2) 掌握细胞培养用器械的清洗与消毒方法。 3) 掌握细胞培养的实验程序 。

4) 掌握细胞的复苏、细胞的计数、细胞的传代培养、细胞的冻存方法。

2. 教学内容：

（1）实验器材的清洗包装和消毒：

一）玻璃器械洗消：

（一）新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200mL：蒸馏水1000mL）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次，用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。 7.高压消毒后烘干 。

（二）旧的玻璃器皿的洗消：

1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。

二）金属器械洗消：

金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。 三）橡胶和塑料：

橡胶和塑料制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： 1.针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。

2.胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

3.胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4.胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。

5.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。

为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钴(CoCl2·6H2O)2g，30％盐酸10mL，蒸馏水88mL。 四）无菌室的灭菌：

1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射 。

3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟 。 4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

五）实验人员的无菌准备： 1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 。 3.用75％酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示：

1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面 。 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌

4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒的注意事项：

1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。

2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。

3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

（2）细胞培养的实验程序：

（3）细胞的复苏：

复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。

存取冻存管时都要佩戴防护眼镜和手套，冻存管投入存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上，以防发生意外。

离心后上清液一定要吸干净，以免因DSMO的毒性造成细胞活力下降而难以复活。

（4）细胞的计数：

细胞计数结果以细胞数/毫升表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞

常使用的浓度是1％~3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。

琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。 由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。

实验方法：

（1）蛋白样品制备：

1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取：（6孔培养板）

(1)倒掉培养液，加入1mL 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.4），洗细胞。 (2)将液体移除，每孔加细胞裂解液200～400μL作用1min。轻轻吹打（尽量不要起沫）。

(3)移入EP管内，振荡器室温下轻微振荡10min。

(4)裂解完后，于4℃下8000rpm离心10min。（提前开离心机预冷） (5)将离心后的上清分装转移至0.5mL离心管中,或40μL分装放于-20℃保存。

加药物处理的贴壁细胞由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按上述操作外还应离心（1200rpm，5min）收集培养液中的细胞，移入EP管一同裂解。 2. 组织中总蛋白的提取：

(1)将少量组织块置于1～2mL匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。（可先剪成小块，-80℃或液氮中反复冻融三次后再匀浆，每次10min） (2)加400～500 μL裂解液裂于匀浆器中进行匀浆,然后置于冰上。 (3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 (4)裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5mL离心管中，然后在4℃下8000rpm离心10min，取上清分装于0.5mL离心管中或40μL分装并置于-20℃保存。

3. 悬浮细胞（6孔板）收集离心1000rpm，5min，PBS洗一次。裂解方法同贴壁细胞。

（2）蛋白含量的测定

1. 制作标准曲线

96孔板，按下表加入，每组3个孔，5min后，OD595或600nm检测，绘制标准曲线。 浓度 1mg/mL BSA buffer 0mg/mL 0 30?L 0.2mg/mL 6?L 24?L 0.4mg/mL 0.6mg/mL 12?L 18?L 18?L 12?L 0.8mg/mL 24?L 6?L 1.0mg/mL 30?L 0?L 待测 Sample ? G250

200?L 200?L 200?L 200?L 200?L 200?L 200?L 2. 根据标准曲线计算出样品蛋白含量。 注意事项:

样品蛋白含量的OD值应在曲线范围内，即在0mg/mL~1mg/mL BSA的OD值之内。如果不在线性范围内，应适当稀释或浓缩。样品总体积为30μL。BSA一般用生理盐水或注射用水配制，buffer为生理盐水或注射用水。

（3）SDS-PAGE实验步骤:

1. 清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立即晾干。 2. 灌胶与上样

⑴玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

⑵按第二版《分子克隆手册》方法（见后面附录）配12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时可用1mL枪吸取分离胶液沿玻璃灌注，待胶面升到适合高度时即可（分离胶一般3.4mL即可）。然后加水液封(要很慢，否则胶体会被冲变型，一般需加水60?L）。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶液一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 ⑶当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

⑷按第二版《分子克隆手册》方法（见后面附录）配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。 ⑸取出测完蛋白含量的上样样品至0.5mL离心管中，加入5×SDS 上样缓冲溶液，即4?L样品加1?L上样缓冲溶液（上样总体积一般不超过30?L），上样前要将样品置于恒温金属浴100℃中加热5min使蛋白变性。（预染marker无需加热） ⑹待到浓缩胶凝固（约20min）后，将其放入电泳槽中（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且光滑的一面面向外）。加足够的电泳液后（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板），两手分别捏住

梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

⑺开始准备上样。用微量进样器或上样枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头或枪头插至加样孔中缓慢加入样品。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。 3. 电泳(BIO-RAD Basic 电泳仪)

电泳时间一般45～60 min，电压为200V较好。电泳至溴酚兰将要跑出即可终止电泳，进行转膜。

（4）转膜步骤（适用于0.75mm胶半干转）：

1. 电泳结束后将胶切成适合大小（切去一小角做为标记，如有预染Marker不用切），放入转膜缓冲液中平衡（15min～30min）。海绵滤纸剪至与胶相同大小，共四块，放入转膜缓冲液中平衡。

2. 0.22?m PVDF膜（无正反面）剪至比胶略大，先用100%甲醇浸泡30s，再放入转膜缓冲液中平衡。（15min～30min） 3. 转膜

从下而上顺序：+阳极-两层海绵滤纸、PVDF膜、凝胶、两层海绵滤纸-阴极- 每一步都要注意去除气泡，建议都在转膜液中进行。放入BIO-RAD半干转仪（注意:膜在下胶在上），安装好装置，接通BIO-RAD PowerPac HC 电泳仪电源，15v 15min或10v 30min（根据实验结果可适当延长和缩短时间，但电压不变）。

4. 转移结束后，关闭电源取出膜（记住有蛋白是哪面，可用圆珠笔画点标记），TBS洗1min（膜取出后应马上浸入TBS中）。 注意事项：

半干转仪用完后，先擦净表面的转膜液，晾干后收好

（5）免疫反应：

1. 在适合大小的容器内加入封闭液（TBS配5%脱脂奶粉），放入已洗好的膜（膜应完全浸入封闭液中，1mL/cm2），80转振荡，室温（应高于20℃）1h或4℃过夜。

2. 在一张适合大小的保鲜膜（也可用自封袋）上加一抗（用封闭液稀释至适合浓度），将膜有蛋白的一面向下扣在一抗液体上，一抗液应与膜蛋白面完全接

触，80转振荡，室温1h（时间可适当延长或4℃过夜）。 3. TBST冲洗三次，TBST洗三次×10min，150转振荡。

4. 在一张适合大小的保鲜膜（也可用自封袋）上加二抗（用封闭液稀释至适合浓度），将膜有蛋白的一面向下扣在二抗液体上，二抗液应与膜蛋白面完全接触，80转振荡，室温1h。

5. TBST冲洗三次，TBST洗三次×10min，150转振荡。

6. 加入底物显色液（OPD+H2O2）,一般2～3min后条带开始出现，30～60s后双蒸水冲洗终止显色，拍照。（ECL发光可省此步骤） 注意事项：

一抗、二抗使用浓度，时间及温度对不同的蛋白都要经过预实验确定最佳条件。

OPD有致癌性，使用时要小心; H2O2要最后加。

（6）化学发光，显影，定影

1. 将ECL发光试剂盒中A和B两种试剂先放在室温一段时间，然后等体积混合。将膜蛋白面朝上放在保鲜膜上（膜应尽量去除表面洗液，但不能使膜干）。将发光液淋在膜上（试剂盒要求0.1mL/cm2，淋在膜蛋白面上，铺满即可）。1～5min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液（但不能使膜干），包好（无气泡），放入X-光片夹中。

2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中，另准备两盘蒸馏水。在红灯下取出X－光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大一些）。打开X-光片夹，把X－光片放在膜蛋白面上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时。根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min～5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为3～10min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间。显影结束后，马上把X-光片浸入蒸馏水中清洗，再放入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止。用蒸馏水冲去残留的定影液后，室温下晾干。 （显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，镊子不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）

（7）凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。（具体方法参照凝胶成像仪说明）

（8）电泳干胶的制作过程

实验内容：

制作电泳干胶，以便长期保存实验结果，将来也可对干胶进行回收，用于质谱分析。 实验材料：

玻璃纸，玻璃板（使用配电泳胶的短板即可），夹子，甘油（丙三醇），电泳胶，玻璃试管，培养皿。 实验步骤：

1. 玻璃板洗干净，裁两张比玻璃板稍大一些的玻璃纸。 2. 配制10%甘油溶液100 mL，置于培养皿中。

3. 将脱色后的电泳胶和两张玻璃纸都浸泡在甘油溶液中，10 min。 4. 将一张玻璃纸取出，平整地铺在玻璃板上，用试管赶尽气泡。

5. 将电泳胶铺于玻璃纸上，然后将玻璃板斜靠在培养皿上，使一端浸入液体中。（在胶上多浇些液体，不容易进气泡）

6. 将另一张玻璃纸铺于胶上，先将一端靠近底下那张玻璃纸，对齐，然后再慢慢地放下上面这张玻璃纸，其间可以用试管盛些液体浇于胶上。然后用试管压平玻璃纸，防止胶与两张玻璃纸之间有气泡。

7. 将四边多露出玻璃板的玻璃纸反折至玻璃板另一侧，用夹子夹上。 8. 60℃左右烘箱中放置1.5 h后取出，放室内自然风干一晚后拆下装置即可。 附录

10×TBS pH7.6

200mL 1M Tris-HCl(24.228 g Tris,HCl调pH7.6) 80～100 g NaCl

定容至1000mL,用时10倍稀释 TBST

1×TBS 1000mL

Tween-20 1mL

Transfer buffer pH9.2

Tris 5.82g Glycine 2.93g 0.375g SDS or 3.75mL of 10%SDS Methanol 200mL

定容至1000mL，不用调pH值 5×loading buffer（还原型）

1M Tris-HCl pH6.8 0.6mL 50% glycerol 5 mL 10% SDS 2 mL β-巯基乙醇 0.5mL 1% 溴酚蓝 1 mL 超纯水 0.9mL

10％SDS

SDS 10g 蒸馏水至 100mL

加热溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺 0.1g

超纯水 0.9mL

溶解后，4℃保存，保存时间为1~2周。 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）

Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200mL

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250mL。 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）

Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200mL

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250mL。 30％Acr/Bic

丙稀酰胺（Acr） 58g

甲叉双丙稀酰胺（Bic） 2g 超纯水至 200mL

加热溶解后，4℃保存。应先分别溶解。 G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg 乙醇 50mL 磷酸 100mL 蒸馏水至 1000mL

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入水和磷酸，混匀后，用滤纸过滤

R250考马斯亮蓝溶液

考马斯亮蓝R250 625mg

甲醇 250mL 乙酸 50mL 蒸馏水至 500mL

配制时，先用甲醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入水和乙酸 脱色液（30%甲醇，10%乙酸）

甲醇 150mL 乙酸 50mL 蒸馏水至 500mL

10×电极缓冲液

Tris 30g Glycine 144g 10% SDS 100mL 蒸馏水至 1000mL

12％分离胶

（1块胶，5mL） （2块胶，10mL） （4块胶，15mL） 超纯水 1.6mL 3.3mL 4.9mL 30?r/Bic 2.0mL 4.0mL 6.0mL

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）1.3mL

2.5mL 3.8mL

10%SDS 50?L 100?L 150?L

10%AP（过硫酸胺） 50?L 100?L 150?L

TEMED 2?L 4?L 6?L

5％浓缩胶

（1块胶，2mL） （2块胶，3mL） （4块胶，5mL） 超纯水 1.4mL 2.1mL 3.4mL 30?r/Bic 0.33mL 0.5mL 0.83mL

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）0.25mL

0.38mL 0.63mL

10%SDS 20?L 30?L 50?L

10%AP（过硫酸胺） 20?L 30?L 50?L

TEMED 2?L 3?L 5?L

三．酵母菌株筛选及其发酵技术与方法 1.教学目的与要求：

1）学会一般培养基的制备原理、方法。 2）掌握酵母菌种的复苏、筛选方法。 3）掌握酵母发酵工艺流程及具体操作方法。

2.教学内容：

毕赤酵母表达系统：30年前，Koichi Ogata报道，某些酵母菌能利用甲醇作为唯一碳源和能源。这些嗜甲醇酵母立刻引起人们极大关注，因为它可作为一种单细胞蛋白推向市场，成为高蛋白动物的饲料。90年代，Philips Petroleum公司对巴氏毕赤酵母的连续培养技术进行开发，使细胞产量高达130g干细胞/升。后来，Philips Petroleum公司和Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates，

Inc.(SIBIA)合作，将巴斯德毕赤酵母开发为一种蛋白表达系统，结果大获成功。由于此表达系统结合了为生产单细胞蛋白而开发的高密度发酵技术及醇氧化酶的可控型强启动子，外源蛋白的表达水平较高。

毕赤酵母发酵产物的累积不会对自身产生毒副作用，且毕赤酵母的表达菌株很容易从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，不影响外源基因的表达水平。这注定了毕赤酵母具有可用于高密度发酵的巨大潜力。

（1）外界条件对酵母菌的影响：

营养：酵母菌同其它活的有机体一样需要相似的营养物质，像细菌一样，它有一套胞内和胞外酶系统，用以将大分子物质分解成细胞新陈代谢易利用的小分子物质。

水分：像细菌一样，酵母菌必须有水才能存活，但酵母需要的水分比细菌少，某些酵母能在水分极少的环境中生长，如蜂蜜和果酱，这表明它们对渗透压有相当高的耐受性。

酸度：酵母菌能在pH为3～7.5 的范围内生长，最适pH为4.5～5.0。 温度：在低于水的冰点或者高于47 ℃的温度下, 酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在20～30 ℃之间。酵母在低温0 ℃休眠。

氧气：酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和水。在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。

（2）培养基配方：

1．YPD液体培养基: 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 甘油 10mL

加入去离子水500mL，高压灭菌。 2．YPD固体培养基: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 琼脂粉 10g

加入去离子水500mL，高压灭菌。 3．BMGY培养基: 胰化蛋白胨 20g 酵母提取物 10g

加入去离子水700mL，12l℃，15min高压灭菌，而后加入无菌的10×GY，10×YNB各100mL，2mL生物素(Biotin)，即配成BMGY培养基，使用时，按所需pH值加入1/10体积的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 4．PTM1微量元素： CuSO4· 5H2O 6.0g

NaI 0.08g

MnSO4· H2O 3.0g NaMoO4· 2H2O 0.2g H3BO3 0.02g CoC12 0.5g ZnC12 20.0g FeSO4· 7H2O 65.0g H2SO4 5.0mL

加入去离子水至1L，用0.22μm的滤膜过滤除菌。 5. 改良的低浓度基础盐培养基: H3PO4(85%) 10.5mL CaSO4· 2H2O 3g K2SO4 48g MgSO4· 7H2O 39g KOH 13g Glycerol 1L

加入去离子水至20L在发酵罐121℃，30min高压灭菌。

（3）发酵罐的清洗及前期维护：

1. 清洗发酵罐，标定pH电极，并将pH电极、溶氧电极装入发酵罐，各阀门关闭，检查气密性。

2. 无菌空气：指通过除菌处理使空气的含菌量降低到零或极低，从而使污染的可能性降低到极小，不因空气污染造成损失的空气。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3 个/罐。

（4）发酵罐灭菌：

发酵罐的结构比较复杂，对于内部的边边角角不容易消毒，一般的发酵罐有自动清洗装置，清洗完之后彻底灭菌 。

1. 实消：在培养基灭菌之前，通常应先将与罐相连的分空气过滤器用蒸汽灭菌并用空气吹干。实罐灭菌时，先将输料管路内的污水放掉冲净，然后将配制好的培养基泵送至发酵罐（种子罐或料罐）内，同时开动搅拌器进行灭菌。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。

各路进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要激烈，各路排气也要畅通，但排气量不宜过大，以节约用气量。在保温阶段，凡进口在培养基液面以下的各管道及冲视镜管都应进气，凡开口在液面之上者均应排气。无论与罐连通的管路如何配制，在实消时均应遵循“不进则出”的原则。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保温结束后，依次关闭各排气、进气阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。在引入无菌空气前，应注意罐压必须低于过滤器压力，否则物料将倒流入过滤器内，后果严重。灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。

2. 空罐灭菌（空消）即发酵罐罐体的灭菌。空消时一般维持罐压0.15~0.2Mpa，罐温125~130℃，保持30~45min；要求总蒸汽压力不低于0.3~0.35Mpa，使用汽压不低于0.25~0.3MPa。

（5）接种菌体的生长：

1. 制种

①?? 复苏菌种:rLz-8毕赤酵母工程菌种由本实验室保存。将保存在密封好的冻存管内1mL左右的rLz- 8菌种从-80℃冰箱取出，室温缓慢溶解，在超净台内取出200μL加入121℃ 30min高压灭菌的1L三角烧瓶内含有200mL YPD培养基，28℃250rpm震荡培养24h。

②?? 菌种筛选:1)24h后超净台内取样，分光光度计600nm检测OD值，观察菌生长情况，在OD值在2~ 6范围内均可进行菌种筛选，分别将涂YPD固体培养基和加有G418的固体培养基铺板，取不同稀释倍数的菌液20μL进行涂菌，其中单设一组20μL纯水涂YPD固体培养基(做为空白对照组)，28℃~30℃恒温箱观察72h; 2)72h后，进行筛选。

③?? 菌体放大:l)观察空白对照组无菌体生长，G418的固体培养基菌体生长适宜，多在培养皿边缘，呈单克隆生长，可以进行挑菌; 2)超净台内将带有G418的固体培养基中单克隆生长合适的菌株进行挑菌，放入121℃30min高压灭菌的50mL离心管内含有10mL BMGY培养基中，用无菌透气膜封口，28℃250rpm震荡培养24h; 3)24h后根据菌体OD值和肉眼观察菌体颜色判断菌体生长情况，分光光度计600nm检测OD值，OD值在2~6范围内超净台内取样，颜色为淡黄色最佳，过深说明菌体生长过老，过浅说明菌体生长密度不足; 4)超净台内取菌体2mL加入121℃ 30min高压灭菌1L三角烧瓶内含200mL BMGY培养基中，28℃ 250rpm震荡培养24h; 5)培养24h后，取20mL加入121℃ 30min高压灭菌5L三角烧瓶内含有2L BMGY培养基中，28℃250rpm震荡培养24h，OD600≈10，此菌液做为种子液，准备上罐接种。 2. 上罐生物量的累积

①调校设备:校准发酵罐的pH电极、溶氧电极(在28℃时进行)，并进行蠕动泵的流量校准。

②配制20L改良的低浓度基础盐培养基和10g胰化蛋白胨，加入40L发酵罐，121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管道。

③待发酵罐内培养基灭菌并冷却后，设置以下参数:温度28℃，转速为600rpm，气体通入速率1.0vvm，空气混合器的参数为3.0。用氨水调节改良的基础盐培养基的pH值至5.0。无菌操作补加0.22μm过滤膜除菌的37.5mL PTM1微量元素和40mL生物素贮备液。

④将发酵罐顶部接种口打开，用酒精棉在口周围燃烧(减少污染，起灭菌作用)，然后将上述5L三角烧瓶内含有2L BMGY种子液开口，进行口部酒精灯外燃灭菌后迅速倒入发酵罐，立即关闭接种口，熄灭盖周围燃烧的酒精棉。开始发酵罐培养，此为第一阶段即甘油培养扩增菌体。发酵罐参数设置分别为搅拌速度600rpm，罐内压力10psi，温度28℃，控制均为P-I-D，维持DO值(溶解氧)在20%以上，必要时通入纯氧。

⑤发酵开始后，罐内会产生大量气泡，进行补加消泡剂，气泡消失，立即停止补加消泡剂。

⑥此阶段每6h取样1次，测OD600和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，上罐后取样OD600为0.089，湿重为5.7g/L，肉眼和镜下观察菌液，排除杂菌污染，并留上清。

⑦约6h后，DO值逐步上升;约12h后湿重为15.3g/L，DO值在50%~60%，将搅拌速度600rpm升至800rpm;约18h后湿重为62.9g/L，发现DO在80%左右，说明培养基中甘油正处于消耗状态;约20h左右湿重为172g/L，发现DO值在20%~30%，说明培养基中甘油正处于不足状态，决定进行通低流纯氧，DO值回升至40~50%左右；约24h左右，菌体湿重达180g/L，DO值逐渐增至80~100%，说明培养基中甘油已消耗殆尽，转入补充甘油以进一步提高菌体密度阶段。 ⑧按照12mL/L PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50%甘油中，混匀后，蠕动泵以15mL·h-1·L-1流加速率补加，补加甘油过程中，DO值不能低于30%，可以通过提高搅拌转速和通纯氧保证氧供给。

⑨约30h，菌体湿重达220~240g/L，停止补加甘油，DO值迅速回升到100%，说明甘油已耗尽，继续维持30min的“甘油饥饿”状态，转入甲醇诱导表达阶段。

(6)甲醇诱导rLZ-8的表达

①甲醇诱导开始后，每隔6h取样1次，测OD600和细胞湿重及留样电泳检测蛋白含量变化。同时监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量(停补甲醇观测DO值变化，若停补甲醇后，DO值在1min内上升幅度大于10%，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，若碳源受限，则加快补甲醇的速率，若甲醇过量则应调慢补甲醇的速率，直到合适的速度。

②按照12mL/L比例的PTM1微量元素加入甲醇中，混匀后，以3~4mL·h-1·L-1初始速率加入到发酵罐中诱导表达，DO维持在20~40%之间，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。在此期间，DO值变得不稳定，波动较大，进行通低流氧气，酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境后，DO值即保持稳定，继续维持此低速率递增补加甲醇，直到速率达到10~12mL·h-1·L-1，利用通氧量和甲醇补加量的双重优化来保持DO稳定，此过程需要10h。

③补加甲醇的速率恒定为10~12mL·h-1·L-1，DO在30~40%之间，维持20h。 ④补加甲醇的速率增加到16~18mL·h-1·L-1，DO在20~40%之间，维持20h。在此期间，补加高压过的30%饱和度的硫酸铵500mL，补充罐内的氮源，提高表达量。

⑤甲醇诱导50h后，将速率由 16~18mL·h-1·L-1逐级下降，依靠通氧量的优化维持DO在20~40%之间，当甲醇诱导60h，甲醇降至3~4mL·h-1·L-1初始速率，检测菌体湿重达320g/L。

⑥以甲醇3~4mL·h-1·L-1初始速率诱导表达至72h后，检测菌体湿重己接近400g/L，结束发酵。

（7）放罐：

放料操作：发酵结束后，进行放罐。先关搅拌，再关排气阀，调节罐底三向阀至放料位置，利用罐内压力放出料液，用容器接收料液。

（8）发酵罐的清洗与维护：

放料结束后，关闭放料阀及进气阀，打开排气阀，使罐压为0。拆卸罐上的pH、DO等电极以及流加孔上的不锈钢针，并在流加孔和电极插孔上拧上不锈钢塞。自接种孔加入70%清水，启动搅拌，转速100r/min左右，用蒸汽加热至121℃，维持30min，以此清洗发酵罐。清洗完毕，利用空气压力排出洗水，并用空气吹干发酵罐。

关闭空气压缩机及蒸汽发生器电源，通过各个排气阀排出管道内空气及蒸汽，至各压力表显示为0最后关闭所有阀及计算机。

四．蛋白质纯化技术与方法 1.教学目的与要求：

1）了解蛋白质的提取和粗分离。

2）掌握蛋白质的层析分离：离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水和反相层析、亲和层析。

3）掌握蛋白纯化中的衔接技术：蛋白质的浓缩、蛋白质的脱盐、蛋白质生物活性的保持、蛋白质纯化过程中的监测。

3. 教学内容：

分离纯化蛋白质的目的:

①将蛋白质和非蛋白质杂质分离。 ②将不同的蛋白质相互分离。

分离提纯蛋白质的要求：纯度 、活性、得率、速度。 能用作纯化依据的蛋白质性质： 1 大小 2 形状 3 电荷 4 等电点 5 电荷分布 6 疏水性 7 溶解度 8 密度 9 配体结合能力 10 金属结合能力 11 可逆性缔合 12 特异性序列或结构 13 非寻常性质 14 基因工程构建的纯化标记 （1）蛋白质的提取和粗分离：

前处理：

动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织；种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 粗分级：

当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等

电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大．既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。

（2）蛋白质的细分级分离

一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。

结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质的分离纯化方法： 一、根据分子大小不同的纯化方法 1. 透析和超滤

透析—— 只用于除盐类和小分子杂质

透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。

超滤——除盐和小分子杂质，分离、浓缩蛋白质。 2．密度梯度离心

生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。 3. 凝胶层析

又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 常用分子筛填料：

1）葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15，分离大蛋白质、小蛋白质，除盐。

2）琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质。

3）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP） 装柱步骤：（同样适用于其它填料） 1.组装柱子。

2.用蒸馏水冲洗以除去末端以及适配器中的气泡。确认在柱床支持处无气泡残留。关掉柱子流出口，保持柱床支持处被水覆盖。

3.重悬介质，单次连续地把填料悬浊液铺在柱管中。用靠在柱管上的玻璃棒引流会尽量减少气泡的引入。

4.如果使用装柱池，迅速将柱子其它空白处和装柱池充满水，将适配器或装柱池的盖子装上，然后将柱子连接到泵上，避免在适配器或入水管中残存气泡。

5.打开柱子底部出口，将泵设置为所需流速。

6.保持装柱流速至少3个柱体积，直到达到一个稳定不变的柱床高度。在柱上标记柱床高度。 7.关闭泵，关上柱子出口。

8.如果使用装柱池，解开装柱池，并把适配器装到柱子上。

9.解开适配器入口，将适配器推进柱子，直到达到标记处。用装柱溶液冲洗适配器入口，锁定适配器位置。

10.将柱子连接到泵或者层析系统上，并开始平衡。如果需要，重新调整适配器。注：在随后的层析过程中，流速不要超过装柱流速的75%。 二、利用溶解度差别的纯化方法 1.等电沉淀和pH控制

蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。

当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 2.蛋白质的盐溶和盐析

低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(salting in),盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。 3.有机溶剂分级分离

（1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀，常用的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。

（2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 （3）有分级分离现象。

（4）要求对有机溶剂低温预冷。 4.温度对蛋白质溶解度的影响

在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低。在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0 ℃或更低的温度下进行。

三、根据电荷不同的纯化方法 1.电泳

2.离子交换层析

离子交换层析的原理是，被分离物质借所带的电荷可与离子交换剂的反电荷结合，在用逐渐增加离子强度的洗脱液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同的物质所带的电荷不同，它们与离子交换剂的结合能力也不同，故被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而可被分离开来。 层析过程：

1）平衡阶段:离子交换剂与反离子结合。 2）吸附阶段：样品与反离子进行交换。

3）解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质。

4）再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用 离子交换的分类：

离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架组成，这类不溶性骨架包括树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。它们在交换过程中不发生任何反应。在网状结构的骨架上有许多共价结合的带电基团，如侧链带正电的基团，可与带负电的离子相结合，称为阴离子交换剂(anion exchange)（含碱性基团）。如侧链带负电的基团，可与带正电荷的离子相结合，称为阳离子交换剂(cation exchange)（含酸性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴。

（1）强酸性阳离子交换剂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；

（2）弱酸性阳离子交换剂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基团；

（3）强碱性阴离子交换剂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-?-羟基乙基胺基；

（4）弱碱性阴离子交换剂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱。

强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽，而弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小。

常用的阳离子交换填料：CM Sepharose Fast Flow，SP Sepharose Fast Flow，SP SepharoseTM XL，Capto MMC等。

常用的阴离子交换填料：DEAE Sepharose Fast Flow，Q Sepharose Fast Flow，Q SepharoseTM XL等。

离子交换剂的选择：对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。

缓冲液的选择：

1. 阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液：可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、

甘氨酸盐等。

2. 阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液：可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、

乙二胺、咪唑等。

3. 起始缓冲液的浓度应尽可能低：可低于10mmol/L甚至更低，这样可以

使层析柱上更多地吸附分离物质。

4. 缓冲液应不含会影响被分离物质活性和溶解度的成分。 5. 洗脱时应尽量不采用pH梯度洗脱。

洗脱：上样后应先用足够量的起始缓冲液洗去未吸附组分，然后再开始洗脱。洗脱方法一般为梯度洗脱，即采用连续地增加缓冲液离子强度的方式进行洗脱，是一种连续的洗脱。可通过梯度混合器来进行。梯度洗脱的优点是在一定的pH条件下能观察到样品中所有蛋白质的大致分离情况。 四、利用选择性吸附的纯化方法

疏水作用层析：疏水作用层析就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。市售的疏水吸附剂有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。为使吸

附达到最大，可将蛋白质样品的pH调至等电点附近。一旦蛋白质吸附于固定相，则可利用多种方式进行选择洗脱，包括使用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液（增加蛋白质的亲水性），或使用对固定相的亲和力比对蛋白质更强的置换剂进行置换洗脱。

操作注意事项：

（1） 使用高浓度的盐以促进蛋白对疏水配基的结合。

使用疏水层析的前提是待分离蛋白必须可溶于高浓度的盐溶液中。常采用的盐溶液有：(NH4)2SO4(1.7mol/L)、NaCl(4mol/L)和KCl(4mol/L)。 （2） 温度：在常温下进行。

（3） 洗脱方式：可采用以下两种：1 用负盐梯度洗脱，这是最常用的洗脱

方式；2 用提高pH和降低温度的方式洗脱。

常用的疏水填料：Phenyl sepharose 6 Fast Flow(苯基)、Octyl Sepharose 4 Fast Flow(正辛烷基)、Butyl Sepharose 4 Fast flow(正辛烷基)。

五、利用配体的特异性亲和力的纯化方法

亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。

亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。

（3）蛋白纯化中的衔接技术

1. 蛋白质的浓缩： （1）离子交换层析 （2）亲和层系

（3）沉淀法：在提取液中加入适量的中性盐（如硫酸铵等）、有机溶剂，使有效成分变为沉淀，经离心或过滤，收集沉淀，再加入少量的缓冲溶液溶解沉淀。 （4）吸收浓缩法：通过加入吸收剂从溶液中吸收水或溶剂而使溶液达到浓缩的方法。常用的吸收剂有各种凝胶、聚乙二醇、葡聚糖等。 （5）超滤法：

超滤杯 0.5mL超滤离心管 15mL超滤离心管

超滤是加膜分离技术之一，其原理和一般过滤一样，主要依赖于被分离物质

分子量的大小、形状和性质的不同，在一定的压力差（外源氮气或真空泵、离心）下使小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，大于孔径截留分子量的蛋白质不能透过膜，小于孔径截留分子量的蛋白质和杂质能透过膜，以此达到分离的目的。 （6）干燥法：干燥是将潮湿的固体浓缩液和液体中的水分或溶剂除去的过程。干燥的目的是提高产品的稳定性使其符合规定的标准，以便于对产品进行分析、应用和保存。

冷冻干燥：是先将溶液冷冻为固态，而后再在低温和高真空度的情况下使冰升华，从而使溶液中的溶质变为固态。 2. 蛋白质的脱盐：

脱盐是蛋白质纯化过程中的一个重要环节，可以把小分子与蛋白分子分离开来。通常脱盐效果的好坏对下一步层析纯化的实验结果有决定性的影响。常用的方法有透析、凝胶过滤层析、超微滤膜过滤。

（1） 透析：在分离蛋白质时，透析是除去蛋白质溶液中的小分子物质和盐的最

常用方法。透析法的特点是透析袋内外都是液相，透析袋内液是蛋白质样品，透析袋外液是水或缓冲液。透析袋内液的大分子蛋白质不能透过透析膜被截留于袋内，能透过透析膜的小分子物质经扩散不断透出膜外，直到透析袋内外两液相浓度达到平衡。

（2） 凝胶过滤层析：使用凝胶过滤介质Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小

分子，效率高，处理量可达柱床体积30%。只需在进样后收集首1/3~1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。

（3） 超微滤膜过滤：见蛋白质浓缩。 3. 蛋白质生物活性的保持：

蛋白质纯化的最终目的是得到有生物活性的蛋白纯品。因此在纯化过程中，为保证目的蛋白的活性，要从以下各方面注意： （1） 蛋白酶抑制剂：

破碎细胞提取蛋白质的同时，会释放出多种蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速被抑制才能保持蛋白质不被降解，最重要的是加入蛋白酶抑制剂。常用的蛋白酶抑制剂是细菌或者真菌合成的，它们的作用可以是可逆的也可以是不可逆的。 （2） 还原剂：

细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎，由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活性。如有一些含巯基的蛋白质，这些巯基可能是蛋白活性所必须的基团，在提取这种蛋白质时要注意尽量不要带入金属离子和氧化剂，还可以通过往提取液中加入金属螯合剂如EDTA等，加入还原剂如抗坏血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等。另外某些蛋白质还可能带一些非共价键结合的配基，提取时要注意保护，不要使羧基丢失。 （3） 污染物的去除：

去除内毒素：内毒素又称热原，含脂肪A、糖类和蛋白质，是带负电的复合大分子。内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。

去除蛋白质中的核酸：样品中大量核酸的存在会增加样品黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带负电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINE SP，SP或CM Sepharose FF，SP Sepharose XL结合目标蛋白，可去除大量核酸。另外，核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。 4. 蛋白质纯化过程中的纯度检测

高效液相色谱法：反相高效液相色谱法和凝胶高效液相色谱法，因分析速度快而常用于蛋白纯化过程中纯度和复性程度的分析。反相高效液相色谱法是利用

不同构型蛋白的疏水性不同，在反相色谱柱上会有不同的保留时间而鉴定蛋白质；凝胶高效液相色谱法是根据不同构型的蛋白的水化半径不同，在凝胶色谱柱上会有不同的保留时间来鉴定蛋白质。检测样品时，如果样品是纯的，且复性状态一致，应显示出单一的洗脱峰。

电泳法：SDS-PAGE简便易行，是蛋白质纯化过程中最常用的纯度监测方法。 免疫化学法：很多蛋白质都具有抗原性，如果给适当的动物注射特定的蛋白质时，可以刺激特异性抗体的产生。若只注射均一性的蛋白，则只产生一种抗体；如注射的蛋白是不均一的，则可产生几种抗体。只要杂质是抗原物质，这种检测方法是非常有效的。但如杂质无抗原性，此法便不适用了。

蛋白质化学结构分析法：蛋白质的氨基酸末端测定方法可用来测定蛋白质的纯度。对于一个纯蛋白质而言，通过N-末端的定量分析可以发现，每克分子蛋白质应该有整数克分子的N-末端氨基酸，如有少量其它末端的存在，常表示存在着杂质。如果只是定性测定N-末端，则此法只适用于仅有一条肽链的蛋白质。

五．流式细胞仪应用技术与方法 1.教学目的与要求：

1) 流式细胞仪的结构与原理 2) 流式细胞仪的操作规程 3) 流式细胞术的数据获取与分析 4) 流式细胞术的样本制备

2.教学内容：

流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一

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