核酸技术问题解答

核酸技术问题解答

问题1：

我想克隆一个基因家族中的一个基因，这个基因家族的很多基因全长cDNA已经被克隆，鸡中的该基因还未克隆，我本来打算根据该基因家族的保守区设计简并引物从鸡中扩增出一段，然后利用RACE得到全长cDNA，可是作了很久的简并引物PCR都没得到什么结果，我想在GenBank中查一下有没有该基因的EST，不知道该怎么查啊？还请熟悉这方面工作的战友多加指教。 答：请你按照如下步骤：

一，登陆如下网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?

二，进入界面后你将看到有一个“search”的大空地儿，在此粘上你的基因序列（随便是全长还是片段，全长好一些，所贴的基因序列和你要克隆的物种亲缘关系越近越好），然后找到“Choose database”的可选栏，选择里面的est栏或者est others（因为你要克隆鸡子的），点击\按钮；

三，在出现的界面里点击“FORMAT!”,等待新弹出的窗口完全打开后，里面会出现N多est序列，找到鸡子的对应的序列；

四，点击对应的序列号会出现新的窗口，在这个窗口的最后面就是你要的est序列，后面的就不用我再罗索啦。 问题2：

现在手头上有两个老鼠的EST克隆，都是1kb左右，但是已知人的cDNA有6kb，老板要我拿到全长的老鼠的cDNA，对这方面的工作一点经验都没有，不知哪位大侠可以给一点意见，由EST去做或者是自己做RT？但是有6kb，RT不知道能行吗？ 答： 几条途径：

1，利用生物信息学资源进行电子克隆，进而获得全长基因； 2，利用RACE技术获得全长基因；

3，利用EST得控针筛全长cDNA库，进而获得全长基因； 问题3:

EST是由cDNA文库的随机测序获得，cDNA文库来自细胞的mRNA,那么这些mRNA是否经过剪接加工为成熟的mRNA,还是pre-mRNA？

如果是由成熟的mRNA经反转录为cDNA的话，那么EST就是没有内含子的，如果有些cDNA来自pre-mRNA,那么EST就可能有内含子？

我没有做过cDNA文库，所以有些不懂。而且我现在分析的EST是老板2年前用芯片做出来的，这样由芯片获得的EST中有内含子吗？

答：pre-mRNA到成熟的mRNA的时间过程是非常非常短暂的，几百万分之一秒的时间甚至更少，这是一个瞬间的过程，所以我们获得的EST当然是成熟的mRNA，因为你几乎不可能得到pre-mRNA。因此现在分析的EST是没有内含子的。

问题4：如何判断基因全长？

我通过EST测得了几个基因的序列，但不知是否为全长，如何确定请各位大侠指点，谢谢！ 答：

1，你可以将基因的序列到Genbank中BLAST,找出unigene,分析是不是cDNA全长。如果是新基因，可以用软件来分析看是不是cDNA全长，如DNAStar。 一般来说，全长cDNA应满足以下条件：

1. 3' 端应该含有与起始密码子atg一致读框的终止密码子。 2. 3' utr应该至少有加尾信号aataaa

3. 5' utr起始密码子atg前应该有特殊的Motif, 如Kozak 一点愚见，希望有所帮助。

2，我想如果你是做新基因的全长的话，那么就要做Northern验证是不是基因的全长了。要是你只是想看看，那么你把你的序列去NCBI的数据库nr中做一下BLAST就可以知道了。

问题5：已知cDNA序列，如何获得该基因DNA全长序列？

一个很弱的问题：已知cDNA序列，如何获得该基因DNA全长序列？

答：RACE 全名是 rapid amplification of cDNA end，即cDNA末端快速扩增技术，它是在已知某一基因cDNA的部分序列来扩增全长cDNA，可是搂主意思好像是问已知基因全长cDNA序列，想要获得全长基因，这用RACE似乎不行吧？！！

传统的办法是根据cDNA序列合成探针，筛选基因组文库，还有染色体步移等等。

基因组文库和cDNA文库的构建及筛选

(Construction and Screening of Genomic and cDNA library)

刘芝华

中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室

概念：

基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。

基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 基因文库＝基因组文库＋cDNA文库

载体的种类和特征： 受体细胞 结构 插入片段 举例 质粒 E.coli 环状 很小，<8kb pUC18/19 ,T-载体, pGEM3z λ噬菌体 E.coli 线状 9-24kb EMBL，λgt系列 丝状噬菌体及E.coli 环状 <10kb M13系列 噬菌粒 粘粒载体 E.coli 环状 35-45kb BAC E.coli 环状 约300kb PAC E.coli 环状 100-800kb PCYPAC YAC 酵母细胞 线性染色体 100-2000kb MAC 哺乳动物细胞 环状 >1000kb 病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫杆状病毒载体 穿梭载体 动物细胞和细环状 pSVK3质粒，PBV,Ti菌 质粒，

基因组文库构建步骤： 剪切

染色体DNA提纯 一定大小的DNA片段 （机械、酶切）

载体（?噬菌体） -------连接-----------体外包装------转染细菌-----基因组文库----- 保存、扩增

? DNA的制备：高分子量的外源DNA 100-150kb ? 剪切：随机切割 ? 载体：

?噬菌体：48.5kb,插入型(最多可容纳9kb)、取代型(可容纳

38-51kb，最适19-20kb)， EMBL, Charon

粘性质粒(Cosmid)：4-6kb, 质粒+噬菌体的性质，可容纳大片

段的外源基因，最多可容纳46kb。

酵母人工染色体克隆体系（YAC，Yeast Artificial Chromosome

Cloning System） 插入大小200—1000kb ? 载体DNA的制备： 载体DNA酶切反应-------载体臂的纯化----------载体脱磷处理

（常用BamHI） （蔗糖密度梯度离心） （碱性磷酸酶） ? 连接和包装：外源片段与两臂之间的比例，包装蛋白

? 感染宿主菌：选择合适的宿主菌，LE392, NM538, NM539,

KW251等

? 基因组文库的保存和扩增：完整性和代表性

测滴度，要在106fu以上; 保存，氯仿4?C，7% DMSO -70?C

Ln(1-p) p: 任一片段DNA顺序在文库中出现的频率 N= N：噬菌斑数

Ln(1-f) f：插入片段/基因组总长度

Ln(1-0.99)

=----------------- =8.1X105

Ln(1- ) 人类染色体3X109，平均插入片段大小17 kb

cDNA文库的构建

? 分类： 按表达类型分：表达型、非表达型

按载体类型分：质粒cDNA文库、噬菌体cDNA文库 ? cDNA文库的构建步骤：

反转录酶 DNA Polymerase I mRNA分离---------------------------cDNA第一链的合成------------------------- （总RNA的分离， oligo dT纯化）

cDNA第二链的合成---------

-----------连接---噬菌体的包装及转染或质粒的转化 载体 ---------------

? 关键：mRNA的获得。完整、种类多、不能降解。电泳应

在0.5-8kb之间。已知探针做Northern或PCR。 ? 反转录：AMV鸟成髓细胞性白血病病毒 M-MLV 鼠白血病病毒 引物：oligo dT, Random primer 掺入同位素检测 ? cDNA第二链的合成

? 载体： ?gt10, ?gt11, ?ZAP等。 克隆入?噬菌体的效率是克隆入质粒中的30倍。

? ZAP II：(i) ?噬菌体高效；(ii) 质粒易操作；(iii) 蓝白斑；(iv) 插入大小10kb；(v) 可表达融合蛋白，可用DNA探针或抗体来筛选；(vi) 体内自我剪切 ? 从少量RNA中建cDNA文库：

一般情况下，只有10%的mRNA可变成可克隆的双链cDNA，而且体外包装和细菌转化都会再次降低效率，很多人结合PCR，但有非特异性。

---结合Solid-phase RNA Capture System, 可用5ng mRNA，这时oligo dT结合在一个磁珠上，做第二链的模板；

---用Universal Buffer，从cDNA第一、第二链的合成，到连Linker等全在一个系统内进行。

? cDNA文库的标准化：使高丰度的信息相对减少、低丰度的信息相对增多的过程。 减少反复重复，但也会丢失一些信息。 ----与基因组DNA杂交；---应用二级动力学原理在溶液中使双链DNA再退火。

理论上，在单细胞中，去除高丰度者可使低丰度者聚集3倍或更少。因为细胞中1/3mRNA在细胞中有1-10拷贝。

? 定向克隆的cDNA文库：大量EST测序时会用到。 ? 好的cDNA文库的标准： ---具有代表性，含所有带PolyA尾的RNA群体且各类型出现频率也与之一致； ---大部分含有较长或全长的cDNA插入序列； ---少有基因组、线粒体DNA、核糖体RNA的污染。 ? cDNA文库的筛选： DNA探针，抗体，标记蛋白

文库的扩增：

噬菌体文库加SM，粘粒和质粒文库LB。 文库的保存：

噬菌体文库：4℃（加氯仿）可保存几年，-70℃（7% DMSO） 长期保存；粘粒和质粒文库：15%甘油，-70℃冻存。

文库的筛选：

?选择文库

?所要筛选的克隆数：

--对基因组文库取决于克隆片段的大小和基因组的大小 N=Ln(1-P)/Ln[1-(I/G)]

其中I：克隆片段的随机大小，G：靶基因组的大小，P：分离到基因的概率。 --对cDNA文库取决于所要片段的表达丰度和基因组的大小 用核酸做探针还是用抗体做探针 ?筛选过程：（见附页）

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