废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母
更新时间:2023-05-10 11:09:01 阅读量: 实用文档 文档下载
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烟草科技,T0bwco
Science&Technology
烟草农学/TobaccoAgronomy
2013年第8期(总第313期)
废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母
宋静,申永防,臧晓静,王静,吴扬帆,张国帅,刘郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号450001
畅,朱大恒+
摘要:为资源化利用废弃烟梗,以废弃烟梗为底物固态发酵生产假丝酵母。在单因子试验的基础上,利
用P1ackett.Burman设计法筛选出影响假丝酵母HZl9生物量的重要影响因子。结果表明,最适发酵条件
为温度30℃、发酵时间3d、接种量100mL/kg、装载量10
g/250
mL、烟梗大小4.0-5.0cm;通过
PIackett—BurlTlan试验分析,蔗糖、酵母粉、葡萄糖对假丝酵母HZl9生物量有显著影响,试验中最大生物量
t质量为103.24
g/kg。
关键词:废弃烟梗;固态发酵;生物量;Plackett—Burman设计
中图分类号:TS49文献标识码:A文章编号:1002—0861(2013)08—0075—04
ProducingCandida.sp.HZl9withSONGJing,SHENYongfang,ZANG
ZHUDaheng’
WasteTobaccoStemsbySolidStateFermentation
Yangfan,ZHANGGuoshuai,LIUChang,and
Xiaojing,WANGJing,wU
DepartmentofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,ChinaAbstract:Totobaccofurtheroptimaland
betterutilize
state
wastetobacco
stems,a
keybased
strainfactors
on
of
Candida.sp.HZ19
thebiomass
wasproduced
withwaste
stemsbysolid
screened
fermentation.The
affecting
ofCandida.sp.HZl9were
results
showedthatthe
rate
withPlackett-Burmandesign
conditionswere30
ClYI
themonofactorialtest.The
fermentation
size4-5
cc
for3
days,inoculationrate
and
glucose
100mL/kg,loadingimparted
significant
10g/250mL
on
stemin
length.Sucrose,yeastpowder
effectsHZ19
biomass.Under
Plackett—Burmandesignconditions,themaximumyieldofbiomassreached103.24g/kg(dry
weight).
Keywords:Wastestem;Solid
state
fermentation;Biomass;Plackett Burmandesign
烟梗是卷烟工业的废弃物,约占烟叶总质量的20%~
30%…。烟梗中含有大量的糖和氮类物质[2。3]。目前废
fermentation,SSF)利用废弃生物质生产单细胞蛋白引起
科研工作者的极大关注[7。1“。SSF具有投资少、能耗低、技术较简单等优点,通过SSF可资源化利用生物质资源,之前已进行了以废弃烟梗提取液(TSE)液态发酵生产富含类胡萝卜素深红酵母的研究‘1…,然而在利用废弃烟梗采用SSF生产酵母方面尚未见报道。鉴于此,以废弃烟梗为基质,从废弃烟梗中分离得到的l株假丝酵
母Candida.sp.HZl9为出发菌株,进行了SSF生产酵母的
弃娴梗多用于提取烟碱、果胶、烟酸、茄尼醇,堆肥或制备吸附剂等m1。如何资源化利用废弃烟梗一直是卷烟
工业研究的热点之一。采用固态发酵法(solid
state
基金项目:河南省烟草专卖局科技攻关项目(HYKJ201021)、郑州大学大学生创新创业训练计划资助项目“基于代谢调控的深红酵母发酵废烟梗产类胡萝b素响应面优化研究”(2012cxsyl07),河南省教育厅科学技术研究重点项目“烟草废弃物发酵联产单细胞蛋白和草炭技术研究”(138180358】。
作者简介:宋静(1986一),女,在读硕士研究生,研究方向:微生物工程。E—mail:jingjingdnh@126.com;’通讯作者:朱大恒E-mail:zhudahen92000@yahoo收稿日期:2012—10一10
责任编辑:董志坚E.mail:dzj@tobaccoinfo.tom.crl电话:037l一67672650
com.Oil
试验,旨在为用废弃烟梗生产菌体蛋白的资源化利用
提供依据。1材料与方法
1.1
材料
1.1.1烟梗与试剂
废弃烟梗由天昌烟草国际有限公司提供,直径为
0.15--43.50
cm,长度为0.2~5.0cm。供试药品和试剂葡萄
75
万方数据
糖、蔗糖、酵母粉、尿素、(NH。):SO。、NH。C1、K2HPO。、
MgSO。、NaCI、CaCI:和琼脂等均为市售分析纯。1.1.2菌株与培养基
从废弃烟梗中分离得到1株长势良好的假丝酵母Candida.sp.HZl9,保存于郑州大学烟草生物工程实验室。菌种保藏和活化采用TSE斜面培养基,琼脂含量为2%,种子液制备采用TSE培养基“。
1.2
方法
1.2.1废弃烟梗预处理及成分分析
废弃烟梗于60℃烘干至恒重,过16目标准筛除尘备用,采用自动连续流动分析仪(AA3,德国)分析其主要成分。
1.2.2种子液及废弃炯梗培养基制备
将菌种从斜面培养基中接入到含有80mL的TSE
液体培养基的250mL三角瓶中,28
oC,180
r/min培养
24
h作为种子液。
废弃烟梗与自来水按质量比l:4.5混合,常温浸泡
12
h,121℃灭菌20min作为废弃烟梗培养基。
1.2.3固态发酵试验
1.2.3.1
单因子试验设计
以自然长度(0.2~5.0cm)废弃烟梗为原料,装载量为10
g/250
mL,培养温度28℃,培养时间3d,接种量
100
mL/kg为基础,对温度(25,28,30,35℃),培养时间
(2,3,4,5d),接种量(50,100,150,200mL/kg),烟梗长度(4.0—5.0,2.0—3.0及0.5~1.0cm),装载量(5,10,15∥
250
mL)进行单因子SSF试验。以单因子试验最佳条件
进行添加物实验,其中碳源添加量为20g/kg,氮源添加
量为5g/kg,无机盐添加量为2g/kg,以不添加物质为对
照(CK)。均设置3个平行试验,结果取平均值。
1.2.3.2
Plackett—Burman(PB)试验设计
PB设计法可以从很多变量中有效筛选出主要影响
因子,本试验用于筛选显著影响酵母生物量的主要变
量h7。…。本研究构建12次试验用于筛选11个变量,其
中墨,‰,x‰x。。为4个虚拟变量。每个变量设置高(+1)低(一1)两个水平。试验设计中的变量及其添加量、代码、编码水平见表1,响应值为酵母生物量。根据1.2.3.1节试验结果,以葡萄糖、蔗糖、酵母粉、尿素、(NH。):SO。、K2HPO。、CaCI:为考查对象,并设定11个变量的高低两
个水平值。
1.2.4生物量测定
固体发酵结束后,加适量生理盐水,180r/min振荡
5
min,双层纱布过滤出洗脱菌液并记录其体积,取洗脱
菌液30mL,4000
r/rain离心10rain,弃上清液,用蒸馏
水洗涤3次后收集菌体,60℃烘干至恒重,称重,计算生物量,以g/kg计,取3次平行测定结果的平均值。
76
万方数据
表1
Plackett—Burman实验因子水平及编码
注:g/kg表示每千克废弃烟梗中添加物质的克数。1.2.5数据处理
采用Design—Expert8.0.6统计分析软件进行数据分废弃烟梗主要成分分析
废弃烟梗中含有大量的有机物质,主要包括可溶性g/kg、g/kg、钾2.53g/kg、烟碱0.84g/kg、氯2.03
g/l(g。
培养温度对酵母生物量的影响
温度对酵母生物量的影响如图1所示。图1结果表g/kg,高于或
踮∞西奄)≥\=酉删加
砸
■I
■■■■■
■■●■■■
■■■■
25
28
30
35
培养温度,℃
图1烟梗长度对酵母生物量的影响
不同培养时间对酵母生物量的影响结果见图2。
葡¥h
血11
雾
划
培养温度/d
图2培养时间对酵母生物量的影响
析,比较各变量因子的F值和贡献率。2结果与分析
2.1
多糖、烟碱和酚类氮等,其主要成分含量为总糖20.35
总氮1.73因此,废弃烟梗培养基的营养条件适合酵母菌的生长。2.2不同因子对酵母生物量的影响
2.2.1
明在30℃时酵母生物量最高,达到81.90低于30℃,酵母生物量均明显降低。这与酵母菌的生长温度特征相吻合。
2.2.2培养时间对酵母生物量的影响
从图2可以看出,当培养3d时,酵母生物量达到最大值
80.93
g/l(g。因此,培养时间以3d为宜。
2.2.3接种量对酵母生物量的影响
不同接种量对酵母生物量的影响结果见图3。接
种量为150mL/kg时酵母生物量达到最大值85.74
g/l(g。
8583
Q
81
型79
划77
75
■._
50
100
150
200
接种量/(mL/kg1
图3接种量对酵母生物量的影晌
2.2.4烟梗长度对酵母生物量的影响
3种长度范围的废弃烟梗酵母发酵试验结果见图4。3种长度范围烟梗发酵生产酵母生物量的大小排序为:4.o ̄5.0cm>2.0,--3.0cm>0.5~1.0cm,酵母生物量最
大值达到78.4g/kg。
蓁兰~
4.U~5.0
2.0-3.0
0.5-1.0
烟梗长度/cm
图4烟梗长度对酵母生物量的影响
2.2.5装载量对酵母生物量的影响
装载量对酵母生物量影响如图5。当装载量分别为5和10
g/250
mL时,酵母生物量分别为77.82和77.07
g/kg;
超过10g/250mL时,酵母生物量急剧下降。综合成本
考虑,10
g/250
mL为最佳装载量。
奄¥b
蛔霎士H
装载量@/250mL)
图5装载量对酵母生物量的影响
2.2.6不同碳氮源种类对酵母生物量的影响
以蔗糖、葡萄糖为碳源,蛋白胨、酵母粉、尿素、(NH。):SO。和NH。C1为氮源研究不同添加物对酵母生物量的影响结果见图6。除蛋白胨和NH。C1之外,其他添加物对菌体生长均有促进作用,其中以蔗糖为碳源、酵母粉
为氮源时,酵母生物量最高,分别为84.48和85.45
g/kg。
万方数据
奄
一
3
捌
器
刊
_.I
.-
CK
K,HP04
MgS04
NaCI
CaCl2
图7不同无机盐对酵母生物量的影响
2.2.8影响酵母生物量主要因素的筛选
Plackett.Burman实验设计和结果见表2。
对表2实验结果进行方差分析,结果见表3。JP值
的大小表示模型及各个因素的显著水平[2j。贡献率指百分比。其值大小表明对响应值影响的大小㈠“。蜀~x,7
表2
Plackett—Burman实验设计及结果
注:①+标注的变量是虚拟变量。
模型中某因素的平方和与模型中各因素平方和总和的个变量因子的贡献率分别为10.28%,41.98%,10.37%,
表3Plackett-Burman设计试验结果的方差分析
因子
平方和
自由度
均方
F值P值¥
注:①P值小于o.05表明模型或参数有显著影响;P值小于0.01表示影响极显著。
0.021%,0.09%,1.29%,4.63%,其中x,,墨,墨3个因子达到显著水平。由表3可以看出,模型P值小于O.05,表明模型显著。可见,葡萄糖、蔗糖和酵母粉是影响酵母生物量的显著因素。
3小结
(1)在对2种碳源、5种氮源和4种无机盐进行单因
素试验的基础上,初步筛选出葡萄糖、蔗糖、酵母粉、尿素、(Nil。)。SO。、K2HPO。和CaCl:是对酵母生物量有促进作用的营养物质。
(2)通过Plackett—Burman实验迸一步从上述7种营
养物质中筛选出葡萄糖、蔗糖、酵母粉和CaCl:是影响酵
母生物量的显著因素,最大生物量干质量为103.24酢g,
高于单因子实验结果。对筛选出的关键营养物质进行最陡爬坡实验和响应面优化还能进一步提高生物量。
(3)利用废弃烟梗采用SSF法生产酵母具有产量和纯度高、易收集等优点,发酵后的烟梗较易分解,可用于生物堆肥等。因此利用废弃烟梗进行同体发酵生产
酵母为废弃烟梗的规模利用开辟了新途径。
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引用本文格式:宋静.申永防.臧晓静.王静.吴扬帆.张国帅.刘畅.朱大恒 废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母[期刊论文]-烟草科技2013(8)
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