废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母

烟草科技，Ｔ０ｂｗｃｏ

Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

烟草农学／ＴｏｂａｃｃｏＡｇｒｏｎｏｍｙ

２０１３年第８期（总第３１３期）

废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母

宋静，申永防，臧晓静，王静，吴扬帆，张国帅，刘郑州大学生物工程系，郑州市科学大道１００号４５０００１

畅，朱大恒＋

摘要：为资源化利用废弃烟梗，以废弃烟梗为底物固态发酵生产假丝酵母。在单因子试验的基础上，利

用Ｐ１ａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ设计法筛选出影响假丝酵母ＨＺｌ９生物量的重要影响因子。结果表明，最适发酵条件

为温度３０℃、发酵时间３ｄ、接种量１００ｍＬ／ｋｇ、装载量１０

ｇ／２５０

ｍＬ、烟梗大小４．０－５．０ｃｍ；通过

ＰＩａｃｋｅｔｔ—ＢｕｒｌＴｌａｎ试验分析，蔗糖、酵母粉、葡萄糖对假丝酵母ＨＺｌ９生物量有显著影响，试验中最大生物量

ｔ质量为１０３．２４

ｇ／ｋｇ。

关键词：废弃烟梗；固态发酵；生物量；Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计

中图分类号：ＴＳ４９文献标识码：Ａ文章编号：１００２—０８６１（２０１３）０８—００７５—０４

ＰｒｏｄｕｃｉｎｇＣａｎｄｉｄａ．ｓｐ．ＨＺｌ９ｗｉｔｈＳＯＮＧＪｉｎｇ，ＳＨＥＮＹｏｎｇｆａｎｇ，ＺＡＮＧ

ＺＨＵＤａｈｅｎｇ’

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ｗｅｉｇｈｔ）．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｗａｓｔｅｓｔｅｍ；Ｓｏｌｉｄ

ｓｔａｔｅ

ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｂｉｏｍａｓｓ；Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎ

烟梗是卷烟工业的废弃物，约占烟叶总质量的２０％～

３０％…。烟梗中含有大量的糖和氮类物质［２。３］。目前废

ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＳＳＦ）利用废弃生物质生产单细胞蛋白引起

科研工作者的极大关注［７。１“。ＳＳＦ具有投资少、能耗低、技术较简单等优点，通过ＳＳＦ可资源化利用生物质资源，之前已进行了以废弃烟梗提取液（ＴＳＥ）液态发酵生产富含类胡萝卜素深红酵母的研究‘１…，然而在利用废弃烟梗采用ＳＳＦ生产酵母方面尚未见报道。鉴于此，以废弃烟梗为基质，从废弃烟梗中分离得到的ｌ株假丝酵

母Ｃａｎｄｉｄａ．ｓｐ．ＨＺｌ９为出发菌株，进行了ＳＳＦ生产酵母的

弃娴梗多用于提取烟碱、果胶、烟酸、茄尼醇，堆肥或制备吸附剂等ｍ１。如何资源化利用废弃烟梗一直是卷烟

工业研究的热点之一。采用固态发酵法（ｓｏｌｉｄ

ｓｔａｔｅ

基金项目：河南省烟草专卖局科技攻关项目（ＨＹＫＪ２０１０２１）、郑州大学大学生创新创业训练计划资助项目“基于代谢调控的深红酵母发酵废烟梗产类胡萝ｂ素响应面优化研究”（２０１２ｃｘｓｙｌ０７），河南省教育厅科学技术研究重点项目“烟草废弃物发酵联产单细胞蛋白和草炭技术研究”（１３８１８０３５８】。

作者简介：宋静（１９８６一），女，在读硕士研究生，研究方向：微生物工程。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｊｉｎｇｄｎｈ＠１２６．ｃｏｍ；’通讯作者：朱大恒Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｕｄａｈｅｎ９２０００＠ｙａｈｏｏ收稿日期：２０１２—１０一１０

责任编辑：董志坚Ｅ．ｍａｉｌ：ｄｚｊ＠ｔｏｂａｃｃｏｉｎｆｏ．ｔｏｍ．ｃｒｌ电话：０３７ｌ一６７６７２６５０

ｃｏｍ．Ｏｉｌ

试验，旨在为用废弃烟梗生产菌体蛋白的资源化利用

提供依据。１材料与方法

１．１

材料

１．１．１烟梗与试剂

废弃烟梗由天昌烟草国际有限公司提供，直径为

０．１５－－４３．５０

ｃｍ，长度为０．２～５．０ｃｍ。供试药品和试剂葡萄

７５

万方数据

糖、蔗糖、酵母粉、尿素、（ＮＨ。）：ＳＯ。、ＮＨ。Ｃ１、Ｋ２ＨＰＯ。、

ＭｇＳＯ。、ＮａＣＩ、ＣａＣＩ：和琼脂等均为市售分析纯。１．１．２菌株与培养基

从废弃烟梗中分离得到１株长势良好的假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ．ｓｐ．ＨＺｌ９，保存于郑州大学烟草生物工程实验室。菌种保藏和活化采用ＴＳＥ斜面培养基，琼脂含量为２％，种子液制备采用ＴＳＥ培养基“。

１．２

方法

１．２．１废弃烟梗预处理及成分分析

废弃烟梗于６０℃烘干至恒重，过１６目标准筛除尘备用，采用自动连续流动分析仪（ＡＡ３，德国）分析其主要成分。

１．２．２种子液及废弃炯梗培养基制备

将菌种从斜面培养基中接入到含有８０ｍＬ的ＴＳＥ

液体培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，２８

ｏＣ，１８０

ｒ／ｍｉｎ培养

２４

ｈ作为种子液。

废弃烟梗与自来水按质量比ｌ：４．５混合，常温浸泡

１２

ｈ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ作为废弃烟梗培养基。

１．２．３固态发酵试验

１．２．３．１

单因子试验设计

以自然长度（０．２～５．０ｃｍ）废弃烟梗为原料，装载量为１０

ｇ／２５０

ｍＬ，培养温度２８℃，培养时间３ｄ，接种量

１００

ｍＬ／ｋｇ为基础，对温度（２５，２８，３０，３５℃），培养时间

（２，３，４，５ｄ），接种量（５０，１００，１５０，２００ｍＬ／ｋｇ），烟梗长度（４．０—５．０，２．０—３．０及０．５～１．０ｃｍ），装载量（５，１０，１５∥

２５０

ｍＬ）进行单因子ＳＳＦ试验。以单因子试验最佳条件

进行添加物实验，其中碳源添加量为２０ｇ／ｋｇ，氮源添加

量为５ｇ／ｋｇ，无机盐添加量为２ｇ／ｋｇ，以不添加物质为对

照（ＣＫ）。均设置３个平行试验，结果取平均值。

１．２．３．２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ（ＰＢ）试验设计

ＰＢ设计法可以从很多变量中有效筛选出主要影响

因子，本试验用于筛选显著影响酵母生物量的主要变

量ｈ７。…。本研究构建１２次试验用于筛选１１个变量，其

中墨，‰，ｘ‰ｘ。。为４个虚拟变量。每个变量设置高（＋１）低（一１）两个水平。试验设计中的变量及其添加量、代码、编码水平见表１，响应值为酵母生物量。根据１．２．３．１节试验结果，以葡萄糖、蔗糖、酵母粉、尿素、（ＮＨ。）：ＳＯ。、Ｋ２ＨＰＯ。、ＣａＣＩ：为考查对象，并设定１１个变量的高低两

个水平值。

１．２．４生物量测定

固体发酵结束后，加适量生理盐水，１８０ｒ／ｍｉｎ振荡

５

ｍｉｎ，双层纱布过滤出洗脱菌液并记录其体积，取洗脱

菌液３０ｍＬ，４０００

ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｒａｉｎ，弃上清液，用蒸馏

水洗涤３次后收集菌体，６０℃烘干至恒重，称重，计算生物量，以ｇ／ｋｇ计，取３次平行测定结果的平均值。

７６

万方数据

表１

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验因子水平及编码

注：ｇ／ｋｇ表示每千克废弃烟梗中添加物质的克数。１．２．５数据处理

采用Ｄｅｓｉｇｎ—Ｅｘｐｅｒｔ８．０．６统计分析软件进行数据分废弃烟梗主要成分分析

废弃烟梗中含有大量的有机物质，主要包括可溶性ｇ／ｋｇ、ｇ／ｋｇ、钾２．５３ｇ／ｋｇ、烟碱０．８４ｇ／ｋｇ、氯２．０３

ｇ／ｌ（ｇ。

培养温度对酵母生物量的影响

温度对酵母生物量的影响如图１所示。图１结果表ｇ／ｋｇ，高于或

踮∞西奄）≥＼＝酉删加

砸

■Ｉ

■■■■■

■■●■■■

■■■■

２５

２８

３０

３５

培养温度，℃

图１烟梗长度对酵母生物量的影响

不同培养时间对酵母生物量的影响结果见图２。

葡￥ｈ

血１１

雾

划

培养温度／ｄ

图２培养时间对酵母生物量的影响

析，比较各变量因子的Ｆ值和贡献率。２结果与分析

２．１

多糖、烟碱和酚类氮等，其主要成分含量为总糖２０．３５

总氮１．７３因此，废弃烟梗培养基的营养条件适合酵母菌的生长。２．２不同因子对酵母生物量的影响

２．２．１

明在３０℃时酵母生物量最高，达到８１．９０低于３０℃，酵母生物量均明显降低。这与酵母菌的生长温度特征相吻合。

２．２．２培养时间对酵母生物量的影响

从图２可以看出，当培养３ｄ时，酵母生物量达到最大值

８０．９３

ｇ／ｌ（ｇ。因此，培养时间以３ｄ为宜。

２．２．３接种量对酵母生物量的影响

不同接种量对酵母生物量的影响结果见图３。接

种量为１５０ｍＬ／ｋｇ时酵母生物量达到最大值８５．７４

ｇ／ｌ（ｇ。

８５８３

Ｑ

８１

型７９

划７７

７５

■．＿

５０

１００

１５０

２００

接种量／（ｍＬ／ｋｇ１

图３接种量对酵母生物量的影晌

２．２．４烟梗长度对酵母生物量的影响

３种长度范围的废弃烟梗酵母发酵试验结果见图４。３种长度范围烟梗发酵生产酵母生物量的大小排序为：４．ｏ￣５．０ｃｍ＞２．０，－－３．０ｃｍ＞０．５～１．０ｃｍ，酵母生物量最

大值达到７８．４ｇ／ｋｇ。

蓁兰～

４．Ｕ～５．０

２．０－３．０

０．５－１．０

烟梗长度／ｃｍ

图４烟梗长度对酵母生物量的影响

２．２．５装载量对酵母生物量的影响

装载量对酵母生物量影响如图５。当装载量分别为５和１０

ｇ／２５０

ｍＬ时，酵母生物量分别为７７．８２和７７．０７

ｇ／ｋｇ；

超过１０ｇ／２５０ｍＬ时，酵母生物量急剧下降。综合成本

考虑，１０

ｇ／２５０

ｍＬ为最佳装载量。

奄￥ｂ

蛔霎士Ｈ

装载量＠／２５０ｍＬ）

图５装载量对酵母生物量的影响

２．２．６不同碳氮源种类对酵母生物量的影响

以蔗糖、葡萄糖为碳源，蛋白胨、酵母粉、尿素、（ＮＨ。）：ＳＯ。和ＮＨ。Ｃ１为氮源研究不同添加物对酵母生物量的影响结果见图６。除蛋白胨和ＮＨ。Ｃ１之外，其他添加物对菌体生长均有促进作用，其中以蔗糖为碳源、酵母粉

为氮源时，酵母生物量最高，分别为８４．４８和８５．４５

ｇ／ｋｇ。

万方数据

奄

一

３

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＿．Ｉ

．－

ＣＫ

Ｋ，ＨＰ０４

ＭｇＳ０４

ＮａＣＩ

ＣａＣｌ２

图７不同无机盐对酵母生物量的影响

２．２．８影响酵母生物量主要因素的筛选

Ｐｌａｃｋｅｔｔ．Ｂｕｒｍａｎ实验设计和结果见表２。

对表２实验结果进行方差分析，结果见表３。ＪＰ值

的大小表示模型及各个因素的显著水平［２ｊ。贡献率指百分比。其值大小表明对响应值影响的大小㈠“。蜀～ｘ，７

表２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计及结果

注：①＋标注的变量是虚拟变量。

模型中某因素的平方和与模型中各因素平方和总和的个变量因子的贡献率分别为１０．２８％，４１．９８％，１０．３７％，

表３Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计试验结果的方差分析

因子

平方和

自由度

均方

Ｆ值Ｐ值￥

注：①Ｐ值小于ｏ．０５表明模型或参数有显著影响；Ｐ值小于０．０１表示影响极显著。

０．０２１％，０．０９％，１．２９％，４．６３％，其中ｘ，，墨，墨３个因子达到显著水平。由表３可以看出，模型Ｐ值小于Ｏ．０５，表明模型显著。可见，葡萄糖、蔗糖和酵母粉是影响酵母生物量的显著因素。

３小结

（１）在对２种碳源、５种氮源和４种无机盐进行单因

素试验的基础上，初步筛选出葡萄糖、蔗糖、酵母粉、尿素、（Ｎｉｌ。）。ＳＯ。、Ｋ２ＨＰＯ。和ＣａＣｌ：是对酵母生物量有促进作用的营养物质。

（２）通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验迸一步从上述７种营

养物质中筛选出葡萄糖、蔗糖、酵母粉和ＣａＣｌ：是影响酵

母生物量的显著因素，最大生物量干质量为１０３．２４酢ｇ，

高于单因子实验结果。对筛选出的关键营养物质进行最陡爬坡实验和响应面优化还能进一步提高生物量。

（３）利用废弃烟梗采用ＳＳＦ法生产酵母具有产量和纯度高、易收集等优点，发酵后的烟梗较易分解，可用于生物堆肥等。因此利用废弃烟梗进行同体发酵生产

酵母为废弃烟梗的规模利用开辟了新途径。

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废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

宋静， 申永防， 臧晓静， 王静， 吴扬帆， 张国帅， 刘畅， 朱大恒郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号,450001烟草科技

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引用本文格式：宋静.申永防.臧晓静.王静.吴扬帆.张国帅.刘畅.朱大恒 废弃烟梗固态发酵生产假丝酵母[期刊论文]-烟草科技2013(8)

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