环境工程中微生物分析方法研究进展

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环境工程中微生物分析方法研究进展

西安职业技术学院建筑工程系

马美玲

［摘要］本文阐述了环境工程中常用的微生物分析方法原理及其应用，重点介绍了目前应用较多的聚合酶链式反应（PCR）、变性

）、PCR-DGGE分子生物学分析方法原理，探讨了PCR-DGGE技术在国内外环境工程中的应用，分析了微梯度凝胶电泳（DGGE

生物分析方法的现状以及PCR-DGGE技术用于生物处理系统中微生物群落多样性和动态性研究的现状、前景和改进的策略。［关键词］细菌培养检测PCR技术DGGE技术PCR-DGGE技术

生物处理方法已经成为环境工程中废水、废气和固体废物处理的

利用微生物分析方法，研究环境工程生物处最重要的方法之一。因此，

理工艺中微生物群落种群结构和动态性对于研究生化反应的机理、污染物降解和转化途径具有非常重要的意义，并为优化工艺运行条件，提高污染物处理效率提供理论依据。目前研究环境工程中微生物的方法有传统的细菌培养和现代的分子生物技术。

1、传统细菌培养检测方法

细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术，即将其接种于培养基上生长繁殖，培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。进行细菌培养时应根据细菌种类和目的等选择培养方法、培养基，制定培养条

pH值、时间，对氧的需求与否等）。从计数原理上分，细菌培养件（温度、

的微生物检测方法大致可以分为两类：平板计数法和多管发酵法。

1.1平板计数法及其应用

平板计数法是细菌培养最常用的方法，它是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数，且操作简便、检测准确性好，因而得到广泛应用。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂）、生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。

1.2多管发酵法（MPN）及其应用

（mostprobablenumber）法，是用统计数学方法多管发酵法，即MPN

来计算水样中某中待测菌的含量的一种方法，适用于测定在一个混杂

其特的微生物群落中虽不一定占优势，但却具有特殊生理功能的类群。

点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定沉积物中微生物的特定生理群（如硝化、纤维素分

固氮、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中解、

特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量。

2、现代分子生物学方法

由于受到营养物质和培养条件的限制，自然界中只有0.1%-1%的微生物能够被作为细菌培养[1]，并且培养条件要求高，测定周期较长，操作较复杂，只适于进行特殊生理类群的测定。因此，依赖于纯培养进行

20世纪90年代引人分子微生物多样性分析时其结果往往具有局限性，

生物学技术之后，将环境微生物领域带入一个革命性的新时代。近年来，污水生物处理技术研究的一个重要特征就是分子生物学技术在处理系统中微生物种群发育研究方面的应用[2]。目前，用于环境工程中微

变性梯生物区系结构分析的分子技术主要包括：聚合酶链式反应PCR、

度凝胶电泳（DGGE/TGGE）、PCR-DGGE等。

2.1PCR技术原理及其应用

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的分子生物学检测技术，具有快速、灵敏、操作简便等优点[3-4]。它的反应过程类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。环境样品中的微生物DNA提取物必然是不同微生物的DNA混合物，被称为基因组总DNA(metagenom)。将基因组总DNA经PCR扩增，其产物是序列等长但不同源DNA片段的混合物。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。如果可以将这些序列等长但不同源DNA片段分离开，则可对样品中微生物群落的组成进行初步的分析。

PCR技术在环境检测中的广泛应用，目前PCR技术被应用到废水的生物处理过程中，以确定废水中的菌群组成、动态变化以及主要的功能菌群，为鉴别和量化环境中特定微生物的系统发育群体提供了强有力的工具。近年来PCR技术尚在不断发展之中，又相继建立了套式PCR、反向PCR及复式PCR等。可以预料，今后PCR技术在环境微生物领域中的应用将进一步扩大，特别是在检测废水及活性污泥中微生物方面发挥愈来愈大的作用。

2.2PCR-DGGE技术原理及其应用

DGGE技术，即变性凝胶梯度电泳法是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。DGGE技术检测核酸序列是利用DNA双链分子中不同碱基对在不同浓度的化学变性剂中解链程度的不同来研究微生物种群结构的分子生物学技术。DGGE技术必须与PCR技术联用，即将待检测的DNA模板先进行PCR扩增，用扩增的产物来作为DGGE的反应模板。由于每种微生物都有各自独特的DNA碱基排序方式，这些各不相同的DNA条带在变性梯度凝胶电泳（DGGE）中就会表现出不同的电泳速度。在相同电泳时间下，这些DNA片段的经变性梯度凝胶电泳（DGGE）所到达和停滞的位置也各不相同，经过染色后可以在凝胶上呈

经过变性梯度凝胶电泳（DGGE）现为分散的条带。这样不同环境样品，

就可以分离出数目不等的电泳条带，且各个条带的信号强度和迁移位置不同。每个独立分离的DNA片段原理上可以代表一个微生物种属。电泳条带越多说明生物多样性越丰富；条带信号越强，表示该种属的数量越多，从而确定不同环境工程处理单元中所含有的微生物的种类和数量关系，得出其中微生物多样性的信息。

目前国内外PCR-DGGE技术的主要应用集中在：确定总的细菌群落或独特种群的遗传多样性[5]；可以检测出非常微量的微生物种类，分

[6]

析群落多样性，研究群落动态；监测细菌的富集和分离等。

PCR-DGGE技术以其快速、灵敏的优点，在环境、医学、卫生、制药等许多领域得到广泛的应用。

3、分析与总结

3.1细菌培养方法优势与不足

细菌培养作为最为传统的微生物鉴定方法，经过近百年的补充和改进，细菌培养的技术方法已经非常成熟，仍然在医药、卫生、环境等各个领域广泛应用。但由于受到微生物可培养性的限制，目前只有极少部分微生物能够被分离和纯化，同时采用分离培养的方法进行检测，不仅费时（一般需几天到数周），而且无法检测一些难以人工培养的病原菌，因此在应用中受到一定的限制。但因为细菌培养方法价格低廉、操作简单，目前在环境工程中还作为细菌的初步鉴定方法在使用。

3.2分子生物技术方法优势与不足

分子生物技术方法有效地弥补了传统的微生物研究方法—显微镜观察和分离培养，无法对群落结构进行动态跟踪研究的缺陷。它从微生物种群结构动态变化的角度，揭示污染物负荷与污水处理系统的相互关系，逐步改变污水处理系统的黑箱操作状态，已成为环境微生物分子生态学中一个具有重要理论价值和应用前景的研究方向，并且利用分子生物学技术可以进行菌群动态跟踪和功能群种鉴定，揭示菌群结构与功能的关系，从而更好地控制生物处理过程。

但同时该技术也有局限性，只能分离较小的片段(达500bp)，较长的片段分离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量，由于某些种类16SrDNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致细菌数量的过多。估计在有些情况下，不同类型的细

一条DGGE条带是由不同细菌菌种群16SrDNA有着相同的迁移行为，

种群序列组成，这可能会低估环境微生物的种群多样性。

4、结束语

分子生物技术检测微生物，快速、灵敏、准确，可同时检测多个样品，并且具有可重复性，特别适合分析优势种类和调查种群的时空变化，对生物处理系统微生物群落结构演替规律的研究有重要意义，已经为越来越多的水处理专家所认可。PCR-DGGE技术作为一种指纹分析技术，克服了传统培养技术的局限性，直接利用微生物的16SrDNA(真

在遗传水平上研究生物处理系统菌18SrDNA)或一些特殊的功能基因，

中微生物的多样性和种群动态变化，是目前研究微生物遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术。可以预测，今后PCR-DGGE技术在环境微生物领域中的应用将进一步扩大，特别是在确定废水中的菌群组成、动态变化以及主要的功能菌群、检测水体、土壤中的病原菌

尽管如此，这种方法仍有许多缺陷需要不等方面发挥愈来愈大的作用。

断改进革新，比如，该技术对操作条件和操作技巧的要求比较高，检测成本也明显高于传统细菌培养方法。

参考文献［1］WardDM,BatesonMM,WelerR,etal.RibosomalRNAanalysisofmicroorganismsastheyoccurinnature.AdvMicrobEcol.1992.12:219-286

［2］BoyerSI,FlechtenVR,JohansenJR.Isthe16S-23srRNAinter-naltrancribedspacerregionagoodtoolforuseinmolecularsystematicsandpopulationgeneticsAcasestudyinCyanobacteria.MolBoilEvol.2001.18:1057-1069

［3］OgunjimiAA,ChoudaryPV.Adsorptionofendogenouspolyphe-nolsrelievestheinhibitionbyfruitjuicesandfreshproduceofim-muno-PCRdetectionofEscherichiacoliO157:H7.FEMSImmunolMedMicrobiol，1999.23(3):213-20

［4］HoorfarJ,AhrensP,RadstromP.Automated50NucleasePCRAssayforIdentificationofSalmonellaenterica.JClinMicrobiol.2000.38(9):34，29-35

［5］刘新春，吴成强，张昱等.PCR-DGGE活性污泥中微生物群落结构变化的解析.生态学报，2005.25:842-847

［6］杨佐毅，李理，杨晓泉等.PCR-DGGE指纹图谱技术在食品微生物检测中的应用.食品工业科技，2006.2:201-203

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