同源重组是禽流感病毒进化的一种重要动力 挑战杯 - 图文

序号： 编码：

第十一届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛

作品申报书

作品名称：同源重组是禽流感病毒进化的一种重要动力

学校全称： 山东师范大学

申报者姓名

（集体名称）： 韩管助 刘喜平 谢云鹤 张 聪

类别：

■自然科学类学术论文

□哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技发明制作A类 □科技发明制作B类

报送方式：

■省级报送作品 □高校直送作品

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说 明

1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。 2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。

3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。

4．序号、编码由第十一届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛全国组委会填写。

5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。

6．发起高校的三件直送作品和各省（区、市）通过初评的作品（数量参照“作品数额分配方案”）各一式四份分别按全国组委会规定的时间用特快专递寄至全国竞赛组委会办公室。

7．作品申报书须按要求由各省或各校竞赛组织协调机构统一寄送。

8．其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。

9．寄送地址：北京航空航天大学团委第十一届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛组委会办公室

联 系 人： 联系电话： 传 真： 邮政编码：

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A2．申报者情况（集体项目）

说明：1.必须由申报者本人按要求填写；

2.申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列； 3.本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。 申报者代表情况 姓名 学校 学历 韩管助 大学本科 性别 学制 男 出生年月 1986.10 4 入学时间 2005.10 山东师范大学 系别、专业、年级 生命科学学院生物技术05级 同源重组是禽流感病毒进化的一种重要动力 新城疫病毒同源重组研究 山东师范大学生命科学学院 邮政编码 250014 250014 办公电话 053186182565 作品名称 毕业论文题目 通讯地址 常住地 通讯地址 姓 名 刘喜平 谢云鹤 张 聪 山东省济南市历下区文化东路88号邮政编码 性别 女 男 女 年龄 21 20 20 学历 本科 本科 本科 所在单位 山东师范大学生命科学学院团总支 住宅电话 053186182567 山东师范大学生命科学学院 山东师范大学生命科学学院 山东师范大学生命科学学院 其他作者情况 以上作者是否为2009年7月1日前正式注册在校的全日学校学籍管理资格认定 院、系负责人 或导师意见 ■是□否 制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。 ■是□否 （部门签章） 部门意见 年 月 日 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果。 负责人签名： 年 月 日 3

B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）

说明：1．必须由申报者本人填写；

2．本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认； 3．作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写； 4．硕士研究生、博士研究生作品不在此列。

作品全称 作 同源重组是禽流感病毒进化的一种重要动力 （D）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等） 高致病性H5N1 亚型禽流感目前已经丛亚洲传播扩散到欧洲和非洲。为了阻止禽流感疫情的进一步爆发，避免家禽养殖业的严重经济损失，各国相继采取了大规模的家禽扑杀。青海湖是我国西部迁徙鸟类主要的繁殖场所，2005年4月，高致病性H5N1 亚型禽流感疫情在青海湖一个野鸟聚集地爆发。而且禽流感H5N1 亚型病毒可以直接跨越宿主界限，感染人的呼吸系统，导致死亡。其他亚型的A型禽流感也能直接感染人。例如，1999年,两个儿童流感疑似患者被确认感染H9N2 亚型低致病性A型禽流感病毒；2003年，荷兰出现了89 人感染H7N7 亚型禽流品 分 类 作品撰写的感病毒。到目前为止，高致病性禽流感已经导致了至少270例死亡并且引起了广目的和基本泛的社会关注。深入理解禽流感毒力以及宿主趋向性改变的分子基础对防止禽流思路 感新的较大的流行非常重要。 重配和基因突变是流感病毒进化的关键动力并且得到了详细的研究。重配是两个或多个流感病毒株共感染同一细胞时交换基因片段从而产生新的流感病毒的过程。但是相同基因片段之间的同源重组还存在着很大的争议。Gibbs等认为人源和猪源流感病毒的HA基因之间发生过同源重组，而这次重组事件可能触发了导致四千万人死亡的1918年西班牙流感大流行。但是重组因为缺少系统发育支持而被质疑。最近又有报道认为人源流感病毒（H1N1和H3N2亚型）不重组。因此，在流感病毒中是否存在同源同组是目前流感病毒研究的一个关键问题。

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我们采用国际上通用的重组分析方法对现有的禽流感病毒基因组序列进行一系列的分析，在我国广西省分离得到的3株禽流感病毒重组株。而且，通过对GenBank中大约9000条禽流感病毒序列进行系统作品的科学性、先进性分析，我们也发现了一系列重组体，这是世界上第一次有关禽流感病毒同源重组现象的报道。我们也发现甲型流感病毒中，重组可以发生在人源和猪源流感病毒之间。相关论文已经发表在国际著名杂志及独特之处 Molecular Biology and Evolution (SCI, 影响因子6.438)以及Virology (SCI, 影响因子3.765)上。Molecular Biology and Evolution编辑评价，这项发现将会在很大程度上改变人们看待流感病毒进化的方式。 作品的实际应用价值和现实意义 这项研究为禽流感病毒发生同源重组以及同源重组可以在禽流感病毒进化中发挥一定作用提供了证据。研究结果为理解禽流感病毒的进化以及我国禽流感病毒的现状提供了相关的信息，也为开展禽流感病毒的进一步研究以及新型疫苗的研制和开发奠定了基础。 学 禽流感病毒H5N1、H9N2 和H7N7亚型直接感染人类引起了人们对一场新的流感大流行的高度警惕。深入理解禽流感病毒毒力以及宿主趋向性改变的分子基础对防止禽流感大流行具有重要的意义。虽然其它病毒可以通过同源重组产生强毒变异株，但是在流感病毒中是否存在同源重组还存在很大争议。本研究报道了3株携带有由H9N2和H5N1亚型重组产生的PA基因的H9N2亚型流行株。同时，对GenBank中禽流感序列的系统分析发现了许多同源重组株，同源重组可以在禽流感病毒PB2，PB1，PA，HA和NP片段中发生，而且可以在相同或者不同血清型之间发生。这些结果表明同源重组在禽流感病毒进化的过程中发挥着重要的作用，这可能导致禽流感毒力以及宿主趋向性的改变。 术 论 文 文 摘

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作品在何时、何地、1. He, C., Xie, Z., Han, G., Dong, J., Wang, D., Liu, J., Ma, L., Tang, X., Liu, X., Pang, Y., and Li, G. (2009). Homologous recombination as an evolutionary force in 何种机构举the avian influenza A virus. Molecular Biology and Evolution 26(1):177-187. (SCI, 行的会议上影响因子6.438). 2. He, C., Han, G., Wang, D., Liu, W., Li, G., Liu, X., and Ding, N. (2008). 或报刊上发Homologous recombination evidence in human and swine influenza a viruses. 表及所获奖Virology 380(1): 12-20. (SCI, 影响因子3.765). 励 鉴定结果 1. Nelson, M. I., and Holmes, E. C. (2007). The evolution of epidemic influenza. Nature Reviews Genetics 8:196-205. 理解、审查、2. Han, G., He, C., Ding, N., and Ma, L. (2008). Identification of a natural multi-recombinant of Newcastle disease virus. Virology 371(1): 54-60. 评价所申报3. He, C., Han, G., Wang, D., Liu, W., Li, G., Liu, X., and Ding, N. (2008). 作品具有参Homologous recombination evidence in human and swine influenza a viruses. Virology 380(1): 12-20. 考价值的现请提供对于有技术及技术文献的检索目录 申报材料清单（申报论4. He, C., Xie, Z., Han, G., Dong, J., Wang, D., Liu, J., Ma, L., Tang, X., Liu, X., Pang, Y., and Li, G. (2009). Homologous recombination as an evolutionary force in the avian influenza A virus. Molecular Biology and Evolution 26(1):177-187. 文一篇，相申报论文《同源重组是禽流感病毒进化的一种重要动力》一份。 关资料名称及数量） 科研管理 部门签章 年 月 日 6

C.当前国内外同类课题研究水平概述

说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。

目前，普遍认为负链RNA病毒的重组率非常低。因此，在国际上流感病毒是否存在同源重组现象有很大的争议。Gibbs等认为人源和猪源流感病毒的HA基因之间发生过同源重组(1)。但是他们的重组证据因为缺少系统发生支持而被质疑(2)。最近又有报道认为人源流感病毒（H1N1和H3N2亚型）不重组(3)。因此，在流感病毒中是否存在同源同组是目前流感病毒研究的一个关键问题。 我们采用国际上通用的重组分析方法对现有的禽流感病毒基因组序列进行一系列的分析，发现在我国广西省分离得到的3株禽流感病毒具有重组的基因片段。而且，通过对GenBank中大约9000条禽流感病毒序列进行系统分析也发现了一系列重组体，这是世界上第一次有关禽流感病毒同源重组现象的报道。相关论文(4)已经发表在国际著名杂志Molecular Biology and Evolution (SCI, 影响因子6.438)上。Molecular Biology and Evolution编辑评价，这项发现将会在很大程度上改变人们看待流感病毒进化的方式。另外，我们也发现甲型流感病毒中，重组可以发生在人源和猪源流感病毒之间，相关论文(5)也已经发表在国际著名杂志Virology (SCI, 影响因子3.765)上。 1. Gibbs, M. J., Armstrong, J. S., and Gibbs, A. J. (2001). Recombination in the hemagglutinin gene of the 1918 \Science 293: 1842-1845. 2. Worobey, M., Rambaut, A., Pybus, O. G., and Robertson, D. L. (2002). Questioning the evidence for genetic recombination in the 1918 \Science 2002, 296: 211. 3. Boni, M. F., Zhou, Y., Taubenberger, J. K., and Holmes, E. C. (2008). Homologous Recombination is Very Rare or Absent in Human Influenza A Virus. J Virol 82:4807-4811. 4. He, C., Xie, Z., Han, G., Dong, J., Wang, D., Liu, J., Ma, L., Tang, X., Liu, X., Pang, Y., and Li, G. (2009). Homologous recombination as an evolutionary force in the avian influenza A virus. Mol Biol Evol 26(1):177-187. He, C., Han, G., Wang, D., Liu, W., Li, G., Liu, X., and Ding, N. (2008). Homologous recombination evidence in human and swine influenza a viruses. Virology 380(1): 12-20.

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D.推荐者情况及对作品的说明

说明：1．由推荐者本人填写；

2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关 领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）； 3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐；

4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。

姓 名 推荐者情况 单位电话 安利国 性别 男 年龄 50 职称 山东师范大学生命科学学院 教授 工作单位 通讯地址 山东省济南市文化东路88号 山东师范大学生命科学学院 邮政编码 住宅电话 250014 0531-86180698 0531-86187512 推荐者所在 单位签章 请对申报者申报 （签章） 年 月 日 情况的真实性作韩管助等人所申报的项目数据来源可靠，内容真实，结果正确。 出阐述 禽流感病毒以及其他类型的流感病毒是危害人类和其他动物的重要传请对作品的意染病病原。由于其高度的变异性导致该病的防控非常复杂。尽管重配和基因义、技术水平、突变作为流感病毒进化的主要动力已经被广泛认同，但流感病毒是否存在同适用范围及推广源重组还是该病毒研究中一个争论的焦点问题。为了论证流感病毒是否存在前景作出您的评同源重组，该作品组成员对已经发表的数据进行了广泛而深入的研究，他们价 不仅发现在哺乳动物流感病毒存在同源重组现象，在禽流感病毒中也存在广泛的重组。该发现将改变我们对流感病毒进化方式的重新认识。 其它说明 8

姓 名 推荐者情况 通讯地址 工作单位 戴美学 性别 男 年龄 44 职称 教授 山东师范大学生命科学学院 山东省济南市文化东路88号 山东师范大学生命科学学院 邮编 250014 单位电话 0531-86180764 住宅电话 0531-86960382 推荐者所在 单位签章 签章日期 年 月 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述 韩管助等人所申报的项目数据来源可靠，内容真实，问题分析脉络清晰，逻辑性强，结果正确 禽流感病毒正在威胁这人类和动物的健康，其遗传多样性是导致该病毒请对作品的意防控困难的主要原因，因此，了解其遗传多样性的分子机制，对有效防控禽义、技术水平、流感病毒具有非常重要的意义。该作品通过大量的数据和实验结果，证明了适用范围及推广同源重组是禽流感病毒进化的重要动力，他们的相关研究还发现人用疫苗可前景作出您的评能与流行的猪流感病毒重组。这些结果改变我们对流感病毒进化方式的认价 识，对控制禽流感病毒流行，以及疫苗的研究具有深远的意义。 其它说明 9

学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日 各省（区、市）评 审委员会初评意见 评委签名： 年 月 日 各省（区、市）组织协调委员会审定意见 团 委 科 协 教 育 厅 学 联 （签章） （签章） （签章） （签章） 年 月 日 10

E．全国组织委员会秘书处资格和形式审查意见

组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日 组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日 组委会秘书处审查结果 □合格 □不合格 负责人（签名） 年 月 日 11

F．参赛作品打印处

同源重组是流感病毒进化的重要动力

Homologous Recombination as an Evolutionary Force in the Avian Influenza A Virus

韩管助 刘喜平 谢云鹤 张聪 指导老师：何成强 谭效忠

(山东师范大学生命科学学院 山东 济南 250014)

摘要 禽流感病毒H5N1、H9N2 和H7N7亚型直接感染人类引起了人们对一场新的流感大流行的高度警惕。深入理解禽流感病毒毒力以及宿主趋向性改变的分子基础对防止禽流感大流行具有重要的意义。虽然其它病毒可以通过同源重组产生强毒变异株，但是在流感病毒中是否存在同源重组还存在很大争议。本研究报道了3株携带有由H9N2和H5N1亚型重组产生的PA基因的H9N2亚型流行株。同时，对GenBank中禽流感序列的系统分析发现了许多同源重组株，同源重组可以在禽流感病毒PB2，PB1，PA，HA和NP片段中发生，而且可以在相同或者不同血清型之间发生。这些结果表明同源重组在禽流感病毒进化的过程中发挥着重要的作用，这可能导致禽流感毒力以及宿主趋向性的改变。

Abstract Avian influenza A viruses (AIVs), including the H5N1, H9N2 and H7N7 subtypes, have been directly transmitted to humans, raising concerns over the possibility of a new influenza pandemic. To prevent a future avian influenza pandemic, it is very important to fully understand the molecular basis driving the change in AIVs virulence and host tropism. Although virulent variants of other viruses have been generated by homologous recombination, the occurrence of homologous recombination within AIVs segments is controversial and far from proven. This study reports three circulating H9N2 AIVs with similar mosaic PA genes descended from H9N2 and H5N1. Additionally, many homologous recombinants are also found deposited in GenBank. Recombination events can occur in PB2, PB1, PA, HA and NP segments and between lineages of the same/different serotype. These results collectively demonstrate that intragenic recombination plays a role in driving the evolution of AIVs, potentially resulting in effects on AIVs virulence and host tropism changes.

流感病毒是单股负链分节RNA病毒，属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)科，它的8个单链RNA片段分别编码至少11个蛋白(图1)。其中跨膜糖蛋白血凝素(HA) 和神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒的主要抗原表位，二者可诱导亚型特异的免疫反应。根据HA和NA 的抗原特性，目前将甲型流感病毒分为16个H亚型(H1 – H16)和9个N亚型(N1-N9)。

高致病性H5N1 亚型禽流感目前已经丛亚洲传播扩散到欧洲和非洲。青海湖是我国西部迁徙鸟类主要的繁殖场所。2005年4月，高致病性H5N1亚型禽流感疫情在青海湖一个野鸟聚集地爆发，并首次从迁徙鸟类中分离得到高致病性H5N1亚型禽流感病毒(Liu et al. 2005)。而且禽流感H5N1亚型病毒可以直接跨越宿主界限，感染人的呼吸系统，导致死亡(Subbarao 1998)。除H5N1亚型病毒外，有报道显示，其他亚型的A型禽流感也能直接感染人。1999年，两个儿童

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流感疑似患者被确认感染H9N2亚型低致病性A型禽流感病毒(Lin et al. 2003)。 2003 年，一个香港儿童流感疑似患者再次确认感染了H9N2亚型低致病性A型禽流感病毒(Butt et al. 2005)。 同年，荷兰出现了89人感染H7N7亚型禽流感病毒(Fouchier et al. 2004)。高致病性禽流感已经导致了至少270例死亡并且引起了广泛的社会关注(Chang et al. 2007; Horimoto and Kawaoka 2005)。因此，深入理解禽流感毒力以及宿主趋向性改变的分子基础对防止禽流感新的较大的流行非常重要。

重配和基因突变是流感病毒进化的关键动力已经得到了详尽的研究(Nelson and Holmes 2007)。重配是指两个或多个流感病毒株共感染同一细胞时交换基因片段从而产生新的流感病毒的过程。HA和NA亚型之间的重配是引起人类1957年H2N2亚型和1968年H3N2亚型世界性流感大流行的主要原因，与这同时PB1片段也伴随着HA片段一起发生重配(Lindstrom, Cox, and Klimov 2004)。基因突变在禽流感病毒毒力改变中发挥着重要的作用(Hatta et al. 2001)。研究表明禽流感病毒的进化速率很快(Chen and Holmes 2006)。高突变率、大群体以及短代时可以使流感病毒很快的产生能够逃避宿主免疫系统的抗原突变株以及对抗病毒药剂的抗性基因型。最近越来越多的研究表明同源重组在正链RNA病毒进化中发挥着重要的作用(Kirkegaard and Baltimore 1986; Nagy and Simon 1997; Peiris et al. 1999)。人工重组证据表明牛腹泻病病毒(一种正链RNA病毒)的疫苗与持续感染株重组后会产生高毒力致死型病毒株，表明重组也能导致病毒毒力的增强(Becher, Orlich, and Thiel 2001)。虽然有证据表明在流感病毒中不同基因片段之间的非同源重组可以发生(Khatchikian, Orlich, and Rott 1989; Orlich, Gottwald, and Rott 1994)，但是基因内的同源重组还存在着很大的争议。Gibbs等认为人源和猪源流感病毒的HA基因之间发生过同源重组(Gibbs, Armstrong, and Gibbs 2001)。但是他们的重组证据因为缺少系统发生支持而被质疑(Worobey et al. 2002)。最近又有报道认为人源流感病毒不重组(Boni et al. 2008)。因此，在流感病毒中是否存在同源同组是目前流感病毒研究的一个关键问题(Nelson and Holmes 2007)。

本研究报道了2000年在我国广西省分离到的3株带有重组基因片段的H9N2亚型禽流感病毒流行株。而且，为了确定同源重组在禽流感病毒进化中发挥的作用，我们对GenBank中现有的禽流感病毒序列的进行了系统分析，发现了在已发表的数据中存在很多同源重组的证据，其中几株重组病毒株也可以在野外流行。这些结果表明同源重组在禽流感病毒进化的过程中发挥着重要的作用，这可能导致禽流感毒力以及宿主趋向性的改变。

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1 材料及方法

1.1 病毒株采集及处理

禽流感病毒株A/chicken/Guangxi/1/00 (H9N2) (以下简称Guangxi1) ，

A/chicken/Guangxi/14/00(H9N2) (以下简称Guangxi14) 和A/chicken/Guangxi/17/00(H9N2)(以下简称Guangxi17)是分别在广西省3个不同城市中表现出禽流感临床综合症的死鸡中采集到的。Guangxi1采集于2000年3月20号，Guangxi14采集于2000年11月13号，Guangxi17采集于2000年11月20号。病毒株的血清型是使用多克隆鸡抗血清，标准血凝抑制抗血清 (购自哈尔滨兽医研究所) 和神经氨酰酶抑制抗血清(香港大学Shortridge博士惠赠)进行血凝抑制反应和神经氨酸酶抑制测试确定的。这3株病毒株都被测定为H9N2亚型。病毒株在进一步实验之前都在鸡胚成纤维细胞中进行了蚀斑纯化。纯化的病毒株在10日龄SPF鸡胚中培养。 1.2 序列测定

按照以前研究所应用的方法(Xie et al. 1997)从尿囊液中抽提得到病毒RNA。采用表4中的特异性引物使用RT-PCR对8条全长基因进行扩增。扩增得到的DNA片段被克隆到pMD18-T easy载体(Takara Biotechnology，大连)上然后由Takara Biotechnology(大连)完成测序。这些序列在GenBank登录号为 DQ485205~DQ485228。 1.3 重组分析

重组分析所需的参考序列来自于GenBank。使用CLUSTALW软件(Thompson et al. 1997) 对序列进行多重比对。Phi测试用来测试同源重组事件是否统计意义上显著(Huson and Bryant 2006)。使用Phyml (Guindon and Gascuel 2003) (http://atgc.lirmm.fr/phyml/) 在线软件用最大似然法构建系统发育树。使用1000次重复的自展分析来评估系统发育树的可信度。所得自展值标在系统发育树枝的上方或者下方。同时，我们也采用MEGA 4软件包中的邻接法构建系统发育树，以最大组成似然模型作为距离测度，自展重复1000次 (Tamura et al. 2007)。用Treetest 软件 (http://aix1.uottawa.ca/~sarisbro/) 进行Shimodaira-Hasegawa测试以检测不同区域估计的系统发育树的拓扑结构是否存在显著差异。使用Splitstree 4来寻找重组病毒株及其亲本的网状结构 (Huson and Bryant 2006)。

按照我们以前研究所应用的方法(He et al. 2007)，采用Simplot软件包(Lole et al. 1999) 来确定可能的重组序列。这个程序是基于滑动窗口法图形化显示一组已经比对的序列之间的相关性。同时用Simplot软件中的χ2最大化，并结合小样本Akaike信息量准则 (在线运行GARD, Genetic Algorithm Recombination Detection, http://www.datamonkey.org/GARD/) 来确定重

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组位点(Kosakovsky Pond et al. 2006)。

为了进一步确定禽流感病毒中是否存在同源重组，我们从GenBank中下载了大约9000条禽流感病毒基因序列。将这些禽流感病毒序列分成100个组然后在进行重组分析。为了确定最准确的亲本，每个重组体都被用作为置询在GenBank中执行BLAST运算。

2 结果

2.1 三株广西分离到的H9N2亚型禽流感病毒具有重组基因片段

2000年，我国广西省的很多养鸡场爆发禽流感。在这些爆发禽流感的养鸡场中有接近3%的鸡死于禽流感所引发的疾病。我们于3月和11月在3个不同的城市分离得到了3株禽流感病毒，经测定这3株病毒都属于H9N2亚型。在这3株H9N2病毒的全部基因片段测序之后，我们发现它们的PA基因片段具有很高的相似性(图2A) Guangxi17和Guangxi14之间的相似度为 99.81% (2138/2142)，Guangxi17和Guangxi1之间的相似度为99.49% (2131/2142)。

我们发现这3个PA基因片段是由H9N2和H5N1亚型的PA基因之间进行同源重组产生的 (图2B,C,E和F)。当重组体整合到PA基因参考序列比对时，我们执行Phi测试发现了重组的证据 (P<0.0001)。Delta分布给出的p值为10-40 (Boni, Posada, and Feldman 2007)。χ2最大化结合小样本Akaike信息量准则将重组位点定位到nt1332处 (图2B和C) (Lole et al. 1999; Kosakovsky Pond et al. 2006)。使用所有位点构建的相似度标绘图显示在重组位点之前PA重组体和其亲本株A/chicken/Jiangsu/CZ1/02 (H5N1) 具有更高的相似度 (99.32%, 1323/1332)，在重组位点之后重组体和A/chicken/Guandong4/00 (H9N2) 具有更高的相似度 (99.26%, 809/815) (图2B)。从重组位点两侧区域核苷酸推测出来的系统发生树的拓扑结构存在着显著差异

(Shimodaira-Hasegawa 测试, p < 0.001)，这就为重组提供了有力的证据 (图2E和F)。系统发育树显示，重组体在重组位点前后两个不同区域落入了不同的世系，而且具有100%的自展值 (1000次重复)；这就为这3个PA基因片段是由H9N2和H5N1亚型的PA基因之间进行同源重组产生的提供了可靠的证据(图2E和F)。为了观察带有重组体的亲本网状系统，我们构建了PA基因的分裂树。分裂树显示这3株H9N2病毒的PA片段是由A/chicken/Jiangsu/CZ1/02(H5N1)和A/chicken/114 Guangdong4/00(H9N2)世系重组而来的(图2G)。

这3株病毒在测序之前就用蚀斑形成的方法进行了纯化。另外，相同分离株的每个片段都测定了几个克隆的序列来避免人为错误。重组体和它们可能的亲本在重组位点前后分别具有很高的相似度。而且，序列的巨大改变是基因随机突变所无法解释的。因此，在不同时间不同地点分离得到的3株相似度很高的PA重组体证明了同源重组是禽流感病毒进化的一种自然现象。

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值得注意的是，Guangxi1的PB2片段也是一个来自A/chicken/Guandong4/00(H9N2)和A/chicken/Jiangsu/cz1/02 (H5N1)世系的重组体(图3)。根据序列相似度分析，Guangxi14和Guangxi17的PA基因片段似乎是通过重配来自于Guangxi1。 2.2 GenBank中存在着许多可能的禽流感病毒重组体

在以往禽流感病毒株序列大规模分析中未发现重组体(Obenauer et al. 2006)，所以在禽流感病毒的重组率很低的观点被广泛接受。但是当我们对来自于GenBank的大约9000条禽流感病毒序列进行系统分析时，除了上面提到的重组分离株外，我们在别的研究(Li et al. 2004; Kou et al. 2005; Li et al. 2005; Lee et al. 2006; Smith et al. 2006)中也发现了41条重组基因片段(表3)。这些片段相当于1100 (9000/8)个禽流感病毒的完整基因组，这就意味在GenBank中完整禽流感病毒基因组的重组率大约在3-4%的水平。

然而，这些禽流感病毒序列来自于公共数据库，因此我们不能得到每条重组体的详细信息。这些来自GenBank的重组体可能包括一些人工重组体。因此，我们估计的重组率可能过高。为了消除人工重组体有必要对这些重组体片段的序列进行重新测定。 2.3 相似的重组体片段可以在不同的禽流感病毒分离株中发现

除了我们分离得到的3株重复的PA重组体片段(图2)，有不同研究组在不同时间报道的几株重组体具有接近100%的序列相似度。这些重组体片段是A/chicken/Henan/wu/2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)的PB2基因片段，A/chicken/Jilin/hj/2003(H5N1)和A/chicken/Jilin/hh/2002(H5N1)的PB2基因片段，A/chicken/Jilin/hd/2002(H5N1)和

A/chicken/Jilin/156 9/2004(H5N1)的PB1和NP基因片段。不同研究组在不同时间不同地点分离到的不同禽流感病毒具有相似的重组体的现象也支持了禽流感病毒可以发生重组的假说。

3 讨论

在本研究中，我们报道了在我国广西省分离得到的3株禽流感病毒重组株。同时，我们也在GenBank中发现了一系列可能的重组体。值得注意的是，几乎所有的重组体都是在中国分离得到的。这些结果表明同源重组可能是流感病毒进化的重要动力。

在广西分离的这3株禽流感病毒具有相似度很高的重组PA基因片段(图2A)。系统发育分析表明这些PA基因片段可能来自于一个共同的H9N2/H5N1重组体祖先。Guangxi1，Guangxi14和Guangxi17分别收集于3月20号，11月13号和11月20号。Guangxi14和Guangxi17的PA基因片段可能来自于Guangxi1世系，这也得到了这3个重组体的系统发育关系的支持(图2D)。我们也在A/chicken/Jilin/hj/200 (H5N1)和A/chicken/Jilin/hh/2002(H5N1)的PB2基因以及

16

A/chicken/Henan/wu/2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)的PB2基因中观察到了类似的现象。这些结果都为同源重组可以产生新的，稳定的，并且可以在野外流行的病毒株提供了强有力的证据。因此，同源重组是禽流感病毒进化的一种重要动力。

同源重组尤其是不同亚型之间的同源重组可以加快病毒的进化。从1994年禽流感病毒H9N2亚型第一次在我国分离得到之后， 在1996年到2000年之间我国93.89%的禽流感爆发是由H9N2亚型引起的(Guo et al. 2000)。目前禽流感H5N1亚型病毒在在中国时有爆发。这表明H5N1和H9N2这两种禽流感病毒亚型在中国可以同时流行，这就为在它们的基因片段之间发生同源重组提供了环境。我们发现的这3株重组体来自于H5N1和H9N2亚型(图2和3)，而且我们也在GenBank中H9N2/H5N1重组体。因此评估不同亚型间重组对H9N2毒力的影响是十分重要的。

我们应该高度重视一种威胁人类的新的流感大流行的可能。目前，流感病毒从禽类传播到人的机制还不是十分清楚(Li et al. 2004)。就进化以及病原学方面而论，传染的宿主屏障被认为是位于供体和受体不同的适应峰间的一种适应谷(Kuiken et al. 2006)。人们认为1918年流感大流行的原因是聚合酶基因突变导致了禽流感病毒传播到人群(Taubenberger et al. 2005)。同源重组和重配的过程允许一些病毒一步就可以获得很多关键性的适应性突变，这就可能导致病毒宿主趋向性的改变(Kuiken et al. 2006)。类似的，禽流感病毒和人流感病毒基因间重组也可以产生一种适应于人的新病毒(Russell and Webster 2005)。本研究所发现的同源重组发生在涉及病毒复制以及与宿主因子互作的聚合酶 (Taubenberger et al. 2005) 之间，因此可能对宿主特异性可能有一定影响。而1957年和1968年流感大爆发中涉及了甲型流感病毒PB1的禽对人传播(Kawaoka, Krauss, and Webster 1989)。虽然对乙型流感病毒进行分析我们发现重组病毒的数量较少(Han et al. 2008)，但我们也发现甲型流感病毒中，重组可以发生在人源和猪源流感病毒之间 (He et al. 2008)。因此，我们应该警惕同源重组通过改变基因结构或者功能从而触发流感大流行以及允许强毒病毒转换宿主的可能性。

最近，在包括沙粒病毒(Charrel, de Lamballerie, and Fulhorst 2001; Archer and Rico-Hesse 2002)，人呼吸道合胞病毒(Spann, Collins, and Teng 2003)以及新城疫病毒(Han et al. 2008; Qin et al. 2008)在内的几种负链RNA病毒中报道了同源重组的存在。既然流感病毒可以发生各种形式的非同源重组(Khatchikian, Orlich, and Rott 1989; Orlich, Gottwald, and Rott 1994)，那么在禽流感病毒进化过程中就有机会发生同源重组。然而，在流感病毒中这种重组的机制还不是很清楚。对于正链RNA病毒，模板转换被认为是同源重组的机制(Lai 1992)。然而，对于禽流感病毒来说，基因组RNA链的合成是颗粒相关的，而且在感染的细胞中从来未观察到双链和负链RNA。

17

这看上去能够减少同源重组以及在病毒合成过程中的模板转化的可能性。实际上，我们发现重组率并不和某些正链RNA病毒那么高。例如，口蹄疫病毒在一个复制循环中就有10-20%的病毒基因组发生重组(Nagy, Ogiela, and Bujarski 1999)。在不同基因型脊髓灰质炎病毒的研究中，重组发生在RNA能够形成二级结构来发挥重组活化子作用的RNA区域(Alejska et al. 2001)。这就允许两个不同来源的亲本RNA形成复合体从而迫使重组发生(Romanova et al. 1986; Tolskaya et al. 1987)。因此，分析重组位点的特点可以为禽流感病毒的重组机制提供启示。当我们分析重组位点附近序列时，在一些重组体的重组位点附近发现了潜在的二级结构，这可能为重组发生提供分子机制。

总之，这项研究为禽流感病毒发生重组以及重组可以在禽流感病毒进化中发挥一定作用提供了证据。因此，评估重组对毒力以及宿主趋向性的影响以及研究禽流感病毒重组机制是非常重要的。

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表1. 分离自广西的重组体和其亲本相似度比较

segment HA PA PB1 PB2 NP NA M NS

similarity

GX1/GD4

99.31 92.92 99.18 94.8 98.4 98.4 99.61 98.2

GX1/JS

57.6 95.48 90.56 95.96 90.12 49.14 92.3 90.63

GX14/GD4

98.51 92.88 89.31 88.97 88.83 88.3 98.44 95.17

GX14/JS

57.7 95.43 91.25 93 92.09 50.96 91.82 90.63

GX17/GD4

96.84 92.97 89.27 85.66 89.22 89.2 99.61 94.83

GX17/JS

56.13 95.52 91.12 86.6 92.04 51.1 92.31 90.29

注: GX1, Guangxi1; GX17, Guangxi17; GX14, Guangxi14; JS, A/Chicken/Jiangsu/CZ1/02 (H5N1) ; GD, A/Chicken/Guangdong4/00 (H9N2) .

21

表2. 这项研究分析的完整基因序列及得到的重组片段的数目

PB2 PB1 PA HA NP NA MP NS Mosaic Total

H5N1 H9N2 382 397 472 841 496 839 558 615 Yes 4600

94 95 113 156 136 286 204 292 Yes 1376

H6N1 H7N1 H7N2 H7N7 H6N2 H7N3 H4N6 H3N8 Total Mosaics 52 53 52 60 56 65 55 60 No 453

21 20 23 51 29 31 26 24 No 225

5 5 4 26 4 54 52 57 No 207

13 11 12 54 19 15 21 26 No 171

50 50 45 71 54 69 64 79 No 482

38 39 40 62 43 64 60 58 No 404

46 46 42 53 61 58 125 141 No 572

43 48 42 97 53 78 74 74 No 509

744 764 845 1471 951 1559 1239 1426 No 8999

13 8 14 4 5 1 0 0 45

表3. 具有重组证据的禽流感病毒株

GenBank number DQ073402

Mosaic virus strain (subtype)

(reference)

A/Treesparrow/Henan/4/04 (H5N1) J. Virol. 79 (24) , 15460-66 PB2 (2005) A/Tree

DQ073399

(H5N1)

J. Virol. 79 (24) , 15460-66 (2005)

DQ064560

A/chicken/jilin/53/01 (H9N2) Virology 340 (1) , 70-83 (2005) A/chicken/Guiyang/1655/06

EF124780

(H5N1)

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16936-41 (2006)

A/SCk/HK/YU100/2002 (H5N1)

AY651625

Nature 430 (6996) , 209-13 PA (2004)

A/Ck/HK/37.4/2002 (H5N1)

AY651512

Nature 430 (6996) , 209-213 NP (2004)

AF461526 DQ485205 DQ997093 DQ997372 DQ997225

A/Chicken/Tianjing/1/96 (H9N2) Avian Dis.47 116-27 (2003) Guangxi1 (This study)

A/duck/Hubei/wg/2002 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/hq/2003 (H5N1) (Unpublished)

HA PB2 PB2 PB2

A/Ck/HK/31.2/2002 (H5N1) A/chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) A/duck/Shanghai/38/2001 (H5N1) A/Ck/HK/31.4/02_ (H5N1) A/Chicken/Tianjing/2/96 (H9N2) A/Chicken/Liaoning/1/00 (H9N2) A/duck/Shanghai/13/2001 (H5N1) A/chicken/Jiangsu/1/00 (H9N2) A/swine/Anhui/ca/2004 (H5N1) A/ck/Nanchang/4-301/01 (H9N2) A/duck/Hubei/wp/2003 (H5N1) A/black_duck/AUS/4045/80 (H6N5) A/duck/HK/278/1978 (H2N9)

859，1951

China

PA

A/chicken /Guiyang/441/06 (H5N1) A/ goose Shantou/18442/05 (H5N1)

313, 595

China

PB2

A/ck/Yokohama/aq144/01 (H9N2) A/chicken/Jilin/hk/2004 (H5N1)

1925

China

sparrow/Henan/1/04

PB2

A/duck/HK/278/1978 (H2N9) A/WildDuck/GD/314/04 (H5N1)

636

China

Gene

Putative parent lineages (subtype) A/Treesparrow/HN/3/04 (H5N1) A/dk/Hk/293/1978 (H7N2)

Position of Break-points 1116, 1704,1812

Countries

China

799 China

895 1066 156, 1192 1887 613, 1617

543,

China China China China China

A/chicken/Henan/wu/2004 (H5N1) PB2

22

(Unpublished)

AY950280 DQ997121 DQ351870 A/chicken/Henan/210/2004 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Hubei/wj/1997 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Hebei/718/2001 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/hh/2002 (H5N1) PB2 PB2 PB2 A/chicken/Jilin/hg/2002 (H5N1) A/duck/HK/278/1978 (H2N9) A/chicken/Jilin/hg/2002 (H5N1) A/duck/HK/278/1978 (H2N9) A/ck/HK/NT873.3/01-MB (H5N1) A/duck/Guangxi/xa/2001 (H5N1) A/duck/Germany/1215/1973 (H2N3) A/black_duck/AUS/4045/80 (H6N5) 613, 1617 585 783, 979 China China China DQ997314 DQ997101 DQ997317

DQ997510 DQ997281 DQ997084 DQ997288 DQ351874 AY653199

DQ997297 DQ997449 DQ997137 DQ351867 DQ997107 DQ997274

DQ997280 (Unpublished)

A/chicken/Hubei/wh/1997 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/hj/2003 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Beijing/ne/1999 (H9N2) (Unpublished)

A/goose/Jilin/hb/2003 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Hubei/wf/2002 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/hd/2002 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Hebei/718/2001 (H5N1) A/chicken/Jilin/9/2004 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/he/2002 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/jiangsu/nf/02 (H9N2) (Unpublished)

A/chicken/Hubei/wl/1997 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Hebei/108/02 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Hubei/wi/1997 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/ha/2003 (H5N1) (Unpublished)

A/goose/Jilin/hb/2003 (H5N1) (Unpublished)

PB2 A/duck/Hubei/wp/2003 (H5N1) PB2 A/chicken/Jiangsu/wa/2002 (H9N2) A/chicken/Hubei/wi/1997 (H5N1) PB2 A/duck/Hongkong/d73/76 (H6N1) A/chicken/Jilin/xv/2002 (H5N1) PB1 A/chicken/Henan/nd/98

(H9N2) A/duck/Xuzhou/07/03 (H9N2) PB1 A/Chicken/Henan/16/2004 (H5N1) A/chicken/Jiangsu/wa/2002 (H9N2) PB1 A/swine/Anhui/ca/2004 (H5N1) A/duck/Fujian/19/2000 (H5N1) PB1

A/duck/Hubei/wp/2003 (H5N1) A/swine/shandong/na/2002 (H9N2) PB1 AA/chicken/Hebei/1/2002 (H7N2) A/duck/Guangxi/35/2001 (H5N1) PB1

A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/duck/Jiangsu/nf/2003 (H9N2) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1)

PB1

A/swine/shandong/na/2002 (H9N2) A/duck/Hubei/W1/2004 (H9N2)

PB1

A/CK/Yokohama/aq45/02 (H9N2) A/chicken/Jiangsu/wa/2002 (H9N2) A/CK/Henan/210/2004_ (H5N1)

PA

A/swine/Anhui/ca/2004 (H5N1) One parent lineage is missing

PA A/duck/Fujian/01/2002 (H5N1) A/quail/Dubai/303/2000 (H9N2) PA A/tree sparrow/Henan/2/04 (H5N1) A/ goose /Hujian/bb/2003 (H5N1) PA

A/chicken/Jiangsu/wa/2002 (H9N2 A/chicken/Jilin/9/2004 (H5N1) A/chicken/Yamaguchi/7/2004 PA

(H5N1)

A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/quail/Shantou/1461/2001 (H9N2)

23

1638 711,1323, 1695 1713 642, 1566 1283, 1690 541,

650

1234, 1963 1182, 1843 1638 1182, 1843 736, 1302, 1791 673 334, 489,

1659 1877 1174,1484 1678

674,1228, 1835

China China China China China China China China China

China

China

China

China China China

China

DQ997414 DQ485223 DQ485215 DQ485207

A/duck/Zhejiang/bj/2002 (H5N1) (Unpublished) Guangxi17 (This study) Guangxi14 (This study) Guangxi1 (This study)

PA PA PA PA

A/chickem/Jilin/9/2004 (H5N1) A/Gf/HK/38/2002 (H5N1) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/chicken/Guangdong/4/00 (H9N2) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/chicken/Guangdong/4/00 (H9N2) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/chicken/Guangdong/4/00 (H9N2) A/mallard/Maryland/1131/05 (H12N5)

A/ mallard/Maryland /124/05 (H4N6) A/chicken/Jilin/hl/2004/ (H5N1) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/duck/Shangdong/093/04 (H5N1) A/chicken/Henan/01/04 (H5N1) A/chicken/Osaka/aq48/97 (H9N2) A/Chicken/Shandong/1/98 (H9N2) A/CK/HK/NT142/03 (H9N2) A/CK/HongKong/WF120/03 (H9N2) A/goose/Vietnam/3/05 (H5N1) The other putative parent is missing A/chicken/Jilin/hp/2003 (H5N1) A/chicken/Henan/5/98 (H9N2) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/chicken/Jilin/hg/2002 (H5N1) A/chicken/Jiangsu/cz1/2002 (H5N1) A/chicken/Jilin/hg/2002 (H5N1) A/chicken/jilin/xv/2002/ (H5N1) A/chicken/Henan/5/98 (H9N2) A/ starling/England/983/79 (H7N1) A/goose/Hk/3014.5/2000 (H5N1)

203,1558 1332 1332 1332 1343

China China China China USA

CY014862 A/mallard/ohio/1801/2005/ (H3N8) PA A/chicken/jilin/hg/02 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/jilin/hj/03 (H5N1) (Unpublished)

A/Chicken/Gansu/1/99 (H9N2) Avian Dis.47 116-27 (2003) A/CK/HongKong/NT142/03 (H9N2) (Unpublished)

A/duck/Vietnam/8/05 (H5N1)

DQ997303 DQ997321 AF461512

PA PA HA

661, 1173 687, 1173, 1749 911

China China China

AY664667 HA 652, 1160 China

DQ366322 Arch. Virol. 151 (8) , 1615-1624 HA (2006)

A/chicken/Jilin/hq/2003 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/9/2004 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/hd/2002 (H5N1) (Unpublished)

A/chicken/Jilin/hn/2003 (H5N1) (Unpublished)

A/chieken/hebei/718/01 (H5N1)

1086, 1400 Vietnam

DQ997369 AY653196 DQ997285 DQ997346 DQ349117

NP NP NP NP NA

486, 903 936, 1135 936, 1135 612, 1040 1090

China China China China China

表4. 这项研究中采用的特异性引物对的核苷酸序列

gene pb2 pb1 pa ha np na m ns

sequence of primers

F: 5’-AAAAGCAGGTCAATTATATTC-3’ R: 5’-AAGGTCGTTTTTAAACTATTCA -3’ F: 5’-AAAAGCAGGCAAACCATTTGA -3’ R: 5’-TTTTCATGAAGGACAAGCTAA -3’ F: 5’-AGCAAAAGCAGGTACTGAT -3’ R: 5’-AGTAGAAACAAGGTACTTTT -3’ F: 5’-AGCAAAAGCAGGGGAATTTCAC -3’ R: 5’-AGTAGAAAACAAGGGTGTTTTTGC-3’ F: 5’-GCAGGTAGATAATCACTCACTG -3’ R: 5’-AGTAGAAACAAGGGTATTTTT -3’ F: 5’-AGCAAAAGCAGGAGTAAAAATG -3’ R: 5’-CAAGGAGTTTTTTTTTAAAATTGC -3’ F: 5’-AGCAAAAGCAGGTAGATGTTTAAAG -3’ R: 5’-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTAC -3’ F: 5’-AAAGCAAGGGTGACAAAGACAT -3’ R: 5’-TAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCA -3’

24

图1. 甲型流感病毒结构示意图 (引自 Nelson and Holmes 2007)

25

图2. 2000年分离子广西的3株禽流感H9N2型病毒PA基因重组证据

(A) 3株禽流感病毒分离株Guangxi14, Guangxi17和Guangxi1PA基因比较。Guangxi14是质询对象。Y轴表示相似度的百分数滑动窗口200bp，步长20bp。 (B) A/chicken/ Guangxi/17/00 (H9N2) 的PA基因和其亲本的比较。红色垂直线表示重组位点。 (C) 禽流感病毒PA序列Bootscanning

26

分析。Y轴表示滑动窗口得到的重排列树的百分比。人源流感病毒A/Albany/3/58 (H2N2) 被用来作为外围群。其余的和 (A) (B) 相同。 (D) ， (E) 和 (F) 是PA基因片段1-2147，1-1332，和1333-2147区域的最大似然树。 (G) 用全长PA序列构建的分裂树表示了重组体和其亲本的进化关系。最准确的亲本被表示在每个亲本世系上。

27

图2. Guangxi1的PB2片段重组证据

Guangxi1的SimPlot分析结果。Guangxi1是质询对象。Y轴表示相似度的百分数滑动窗口200bp，步长20bp。两个亲本用不同的颜色表示。红色垂直线表示重组位点，并带有χ2最大化值。(B) 禽流感病毒PB2序列Bootscanning分析。Y轴表示滑动窗口得到的重排列树的百分比。其余的和 (A) 相同。(C)，和 (D) 是重组区域1-1066和1067-2247区域的最大似然树。人源流感病毒A/New York/233/2000 (H1N1) 被用来作为外围群。(E) 用全长PB2序列构建的分裂树表示了Guanxi1和其亲本的进化关系。最准确的亲本被表示在每个亲本世系上。

28

G1．全国评审委员会预审意见粘贴处

29

G2．全国评审委员会终审意见粘贴处

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/x0x8.html