Primer Premier 5.0中文使用说明书

Primer Premier 5.0中文使用说明书

Primer

PREMIER

Version 5.0 for Windows and Power

Macintosh

使用说明书

PREMIER

Biosoft International

3786 Corina way,

Palo Alto, CA 94303-4504电话

650 856-2703650 843-1250传真

电子邮件sales@

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目 录

目录 ...........................................………………...................................2

版权声明.................................…………………………….….................5

简介..............…………………………….............................…...............6

新版更新............……………………………………….........................................................6基础指南.............................................................……………………..................6z GENETANK序列编辑...........................................…................7GeneTank Window序列编辑窗口………………………………………………7

查看序列..............................................…………………………………….............................7

打开已有序列 ................................................................……………………………….........7

创建新序列...............................................................…………………………………............7保存序列 .................................................................…………………………………...........8编辑序列 ..................................................................………………………………..............8

查找.........…………....................................................................................8

查看不同链.....................…………………………...……………..........................................8语音校读........................…………….....…………….................................................8编辑序列比较结果.........…………………...............................................................9

序列粘贴窗口..............…………….……………………………............................9参数设置...........................……………...............................................9Rating Parameters评分参数.......................………………………………….................10

序列比较............................……………………….......................10Alignment Parameters序列比较参数设置...................………………...........................10

序列翻译...........................………………………………………….....................12

Edit Codon Table 窗口...........………………………………………………………...............12z PRIMER引物设计.........................…….............................….....14Primer Premier引物设计窗口........................…….....................................14

Direct Select

即点即选框.....................................................................….......... 14在序列比较中应用即点即选功能..........………………………….............................…........14性状列表 ....................................……………........................................15二级结构........................................................................…………..15Edit Primer引物编辑窗口.............…..........……..........................................16Search Criteria搜索标准窗口............……..................................................16Search Parameter搜索参数窗口....……………………................................17

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Automatic Search自动搜索...........…………………....................................................17Manual Search手动搜索及引物设计原理......………………………...............................18Search Results搜索结果窗口...........……………........................................20Multiplex/Nested Primer复式及巢式PCR反应引物窗口...………………...21Database引物数据库窗口..............................…….....................................21Reports分析报告...................................……....................................22Synthesis Order Form合成订单................…………...............................22Optical Activity比吸光度..................................………………....................................22

Degeneracy

多义性..........................………………..................................................23Graphs图表..........................………...................................................23z Restriction Enzyme Analysis限制性内切酶分析.………....24Restriction Enzyme Analysis限制性内切酶分析窗口.............……..........24Restriction Sites酶切位点窗口..............................…………..................24Edit Enzyme限制内切酶编辑窗口.....…………………...............................24Filter特征筛选窗口....................................…………....................................25z Motif AnalysisMotif SitesEdit Motif基序分析.........……………...........................26窗口.....................……......................................26窗口....................……..........................................26Motif Analysis基序分析窗口...............…………….....................................26基序位点基序编辑

Menu Commands菜单命令......………....................................27

GeneTank 主菜单..............................…….........................................27

File....................................................……………...................................................27

Edit ..................................................…………….................................................27

View...................................................………….................................................27

Search ...............................................…………................................................27

Function............................................…................................................27

Translate ...........................................……………...............................................28

Window......................................………........................................................28

Help .........................................………….....................................................28

Primer 主菜单.................................................................................28

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File.....................................................................................................28

Edit .................................………………...........................................28

Function.......................………………….....................................................28

Report.................……………................................................................................28

Graph..............…………..................................................................................28

Window...........……………….....................................................................................29

Help ...........………….......................................................................................29

Enzyme Results Menu 主菜单..........……………….....................................29

File...........................…………...........................................................................29

Function..............……………................................................................................29

Window.........................…………….....................................................................29

Help ............................…………........................................................................29

Motif Menu 主菜单..................................................................................29

File...........................……………...........................................................................29

Function..................……………….........................................................................29

Window.....................……………….........................................................................29

Help ........................................………………..........................................................29

附录......................………………............................................30

附录 A公式法则…………….…………………………………………..........31

附录 B多义碱基表.………………..…………………………......................33

附录 C氨基酸缩写代码……….….………………………………..................34

附录

D软件上限...…………….…………………………….......................35

附录

E参考文献.……………….…………………….............................36

附录

F系统要求……………….………………………………..................37

服务与技术支持.............…………………………….............................................38

其他信息...................…………………….....................................................38

译者后记...................……………………….....................................................38

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版权声明

Copyright © 2000 by PREMIER Biosoft International. All rights reserved.

Information in this manual may change without notice and does not represent a commitmenton the part of PREMIER Biosoft International.

The software described in this manual is provided by PREMIER Biosoft International under aLicense Agreement. The software may be used only in accordance with the terms of theagreement.

PREMIER Biosoft International

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This program and documentation are confidential and the property of Premier. Use,examination, reproduction, copying, decompilation, transfer, and/or disclosure to others arestrictly prohibited except by express written agreement with Premier.

PREMIER Biosoft International

简称

Premier版权所有本说明书中的内容可以由Premier单方面更改而无需另行通知本说明中涉及的软件由Premier提供

并应有书面授权软件的使用必须在授权范围之内

该软件及相关文档作为一项未公开发表的工作其版权归Premier所有对版权的声明并非意味放弃其他权利该软件及相关文档是Premier的机密与财产除非有Premier

的书面授权任何的使用检查再生产复制分割传递或/和解密行为均被禁止以上版权声明仅是原英文声明的翻译如有歧义应以原英文声明为准

译者声明

本软件说明书著作权归PREMIER Biosoft International

所有译者则保留中

文翻译的相关版权

并授权生物软件网

共享发布该说明书的中文翻译本中文翻译仅限于软件使用者参考其内容如有歧义应以原英文说明书为准译者及生物软件网不承担由翻译打印网页等错误带来的直接和间接损失译者Wenkelly电子邮件wenkelly163@

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简介

PRIMER PREMIER 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列该软件主要由一下四个主要功能板块组成GeneTank序列编辑Primer引物设计Align序列比较Enzyme

酶切分析Motif基序分析

新版更新

种间交叉引物设计利用来自多个物种的序列设计扩增引物

病理检测引物设计可用来在高保守区域设计引物

等位基因特效引物设计专用于扩增某一类相关序列中特定成员的引物

基础指南

这段指南并非详细的说明仅为使用者对PRIMER PREMIER的菜单选项有一个直观的了解四个功能板块都有各自的窗口和菜单正在使用中的窗口就是您所见到的窗口以下列出了各功能板块的主要菜单选项

GeneTank File, Edit, View, Search, Function, Translate, Window,Help.

Primer File, Edit, Function, Report, Graph, Window, Help.Enzyme File, Function, Window, Help.

Motif File, Function, Window, Help.

使用功能菜单时

该菜单所属的窗口就会被激活利用各菜单中的window选项记录的所有打开的窗口可以方便的在各个窗口之间进行切换

所有的列表都有复选功能对于windows或Power Mac

系统而言在点击同时按住CTRL

键即可将当前的选择加入选单按住SHIFT键同时点击可以选择两次点击之间范围内的所有选项

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z GeneTank

利用GeneTank您可以打开DNA

或者蛋白质序列

也可以选择不同的阅读框架

共三种将DNA翻译成蛋白质或利用蛋白序列反推出DNA序列

为方便使用软件已经提供了普通密码子列表和几种线粒体密码子列表您也可以输入您自己的其他线粒体密码子列表序列编辑器提供了包括多媒体语言校读在内的完整的序列编辑功能这一功能板块包括以下部分GeneTank打开浏览编辑及翻译序列Translation将打开的序列翻译或反推成其他序列Edit Codon Table编辑翻译所依据的密码子列表

GeneTank窗口

GeneTank的窗口用来显示序列及其文件题头信息序列可以3碱基10碱基一组显示您可以将打开的序列翻译或反推成其他序列您也可以使用通常的拷贝剪切和粘贴命令编辑当前序列GeneTank的窗口上也有启用PrimerAlignEnzymeMotif功能板块的快捷键查看序列

点击相应按钮或从View

菜单中选择您可以查看文件题头改变

5末端序列起始位置选择3碱基或10碱基一组的显示方式

文件题头是指存在于序列文件中位于序列信息上游的文字内容点击header按钮或从View菜单中选择可以显示文件题头信息改变

5末端序列起始位置默认为1序列将从您指定的5位置开始显示序列可选操作

View >Show Header

View >GroupingView > 5’ Seq No 某些版本没有这一项

打开已有序列

使用菜单File >Open可以激活文件选择对话框

文件用来打开您希望处理的包含特定序列的

如果序列文件是GenBank的标准格式PRIMER PREMIER会自动识别打开文件中的序列起始位置或是您曾经使用本软件菜单中File > Save命令以PRIMER PREMIER默认格式保存过该文件序列将自动打开如果打开其他格式的序列文件将出现一个可卷动的Import Sequence

窗口并显示全部序列

在序列第一行的起始处双击则双击处以前的所有信息将被认为是文件题头然后PRIMER PREMIER会自动剔除非序列字符并将序列在GeneTank里打开

创建新序列该项功能可以让您手动键入一个新的序列您可以键入任何DNA或蛋白序列并存在您指定的文件夹内并可以象其他如GenBank

格式的文件一样进行操作

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保存序列

使用本软件保存的序列可以被软件自动识别而无需让您指出序列起始位置建议您在诸如以下情况保存序列您需要经常使用同样的序列您已经编辑完一段序列并希望保存结果您已经输入一段新序列

编辑序列

只需在GeneTank窗口内您就可以方便的编辑DNA或蛋白质序列而编辑翻译或原始序列

十分方便在任一序列上的改变将会正确的反应到与之相关的其他序列

例如如果你在一段蛋白序列上无论该序列是被翻译的或是用来反推DNA的原始序列

删除一个氨基酸残基在相应DNA

上的对应三位密码子将同时被删除但如果您改变一段翻译出的序列这一改变将仅仅在另一段由此翻译出的序列而不会出现在原始序列上编辑序列可以使用直接键入或利用剪贴板通常的剪切拷贝粘贴同样可以方便的在此使用其快捷键分别是CTRL-X, CTRL-C和CTRL-V软件提供三碱基一组的显示方式以利于蛋白相关的工作

在键入蛋白序列在键入DNA序列时可以使用ACGT或者附录B所列出的多义碱基

时可以使用附录C中所列出的氨基酸单字母记号可以从任何文本编辑器如记事本中的剪贴板中拷贝一段序列并将其粘贴进来

辑后请注意保存序列当您完成编查找

利用GeneTank

窗口上的

Find

按钮您可以从指针起始位置开始查找序列中一段特定字符查找到第一个后您也可以使用Find Next按钮在余下的序列中继续查找使用Search菜单选择Go To Position可以将指针移到您指定的位点可选操作某些版本在Edit

菜单下

Search >Find

Search >Find Next

Search >Go To Position

查看不同链

要查看该序列的互补链您只需要点击GeneTank窗口上的A

按钮就会显示该序列的互

补链

此时互补而点击S

按钮就能恢复成原来的序列您亦可点击dsDNA按钮以双链形式显示可选操作

View > Sense Strand

View > Anti-sense Strand

View > ds DNA

语音校读

在GeneTank

打开一段序列后

您可以按下语言按钮启用语音校读功能序列将从指针所在的位置开始被依次朗读序列再次按下语音按钮将停止朗读按下键入朗读键将在键入的同

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时朗读输入的序列再次按下该按钮可以停止键入朗读可选操作

Function > Speaker

编辑序列比较结果

当一项多序列比较完成后比较结果可以通过编辑来获得更准确的配对通常ClustalW法则能够给出一个准确的比较结果因而手工编辑并非必要

但对于个别情况或出于特殊要求

可能有这种需要所以本软件也提供这一功能将点击指针指向的碱基可以实施改动按下空

格键可以插入一个空隙按下Delete键则可以删除一个空隙

一旦比较结果被改动最大和最小同源性参数也会自动改变

粘贴序列窗口这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去分别为正向

As is反向reversed互补

complemented以及反向互补reverse

complemented这样便于从其他程序中粘贴序列而无需考虑其序列保存的方向

参数设置

Preferences

参数设置窗口可以改变本软件所使用的多种默认参数

看及更改引物评分参数设定二级结构在引物评分中所占的权重系数也可以允许您查默认引物长度默认值为25

默认引物长度在Primer Premier

窗口使用即点即选功能时得到的引物长度

Primer Premier窗口启动时的初始默认值这项数值可以设定为1到70个碱基该项参数也是

引物对搜索最大值默认值为100在自动搜索引物时得到的结果数量可以很多

由于该软件按照引物评分来衡量引物效率

有些引物虽然合乎标准但评分较低可能没有全部列出的必要尽管我们设置了100对引物这一较大的数值您仍然可以改变该项参数为10到1000之间的任意值

核酸浓度默认值为250 pM

根据文献

7Freier

等

提供的计算公式这是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的总浓度

它即不是引物浓度也不是起始模板浓度而是PCR产物的浓度由于在PCR过程模板的浓度变化很大很难确定具体数值根据文献11的建议Rychlik等一般经验公式在普通PCR反应中将其当作250 pM

这项数值被用来计算引物的退火温度

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单价离子浓度默认值为50 mM这项数值是指反应混合液中所有单价离子的总浓度

游离Mg2+离子浓度默认值为1.5 mM

这项数值是指反应混合液中充当辅基的Mg2+离子浓度

总Na+当量

这项数值是根据单价离子浓度和游离Mg2+

离子浓度计算得来

计算公式如下

方根

总Na+当量单价离子浓度4Sqrt游离Mg2+离子浓度1000这项数值用来计算引物的退火温度

自由能计算设置温度默认值为25 °C这项数值用来计算自由能G自由能计算公式为Sprt即取平

G=H

TS.

评分参数

Rating parameters

评分参数

窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数二

级结构越稳定

引物评分就会越低

相对于在引物中间形成的二级结构来说

3末端的二级结构对PCR扩增的影响会更大

为了将这一效应计算在内软件将

3末端的二级结构的自由能数值G减去1这一修正会使3末端的二级结构显得更加稳定这一修正值是根据未公开实验结果制定的您可以根据自己的需要来更改

G

如果没有检测到二级结构软件只标注是引物二级结构中最稳定的一个自由能数值

则该数值为0

序列比较

这一部分仅在Primer Premier的Windows版本中使用对于Macintosh系统序列比较是提交到网上完成并下载比较结果在Primer的教程中有关于这方面的完整信息

Align

序列比较窗口让您将已经打开的序列进行比较序列选择框显示所有将要比较的序列使用Add和Delete按钮可以增加一个序列或移除一个序列使用Options按钮可以打开序列比较的参数设置窗口

序列比较参数设置

您可以利用Alignment Parameters序列比较参数设置窗口来修正ClustalW法则用来优化比较结果的各项参数

序列比较可以用两种模式完成

一种准确但较慢

slow/accurate一种快速但较粗略fast/approximate选择不同的模式将会得到不同的结果

SLOW/ACCURATE模式的序列比较参数这些参数无法改变序列比较的运行速度它们被用来对序列比较评分然后换算为百分比数即最后显示的百分数并转化为进化树上的进化距离1Gap Open Penalty比较结果中一个空隙的罚分2Gap extension penalty比较结果中一个空隙每延长一碱基的罚分3Protein weight matrix这是描述氨基酸之间的相似性的评分标准4DNA weight matrix为核酸配对制定的评分标准包括IUB多义密码子值

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FAST/APPROXIMATE模式的序列比较参数

这种同源性评分是由一种快速粗略的通用比较方法计算得来的

方法用以快速获得序列比较结果1只计算准确配对的部分

k-tuples2只计算最佳配对的情况它包括4项参数有两种

K-TUPLE SIZE

这是默认的准确配对的片段长度

增加这一数值可以提高运行速度对

减少这一数值则可以增加灵敏度对于较长的于蛋白序列最大值为

2对于DNA最大值为

4序列例如大于1000字符您可能需要增加默认值GAP PENALTY这是快速比较种每个空隙的罚分影响不大若非设定成很大的值对比较的速度TOP DIAGONALS在一个虚拟的点划分分析法中需要计算的在每个对角线上使用的k-tuple配对数量

在比较中只有最佳配对的情况才会被使用由这项参数指定其数量增加这一数值可以提高运行速度减少这一数值则可以增加灵敏度

多序列比较参数这些参数控制最终的多序列比较每个多序列比较包括多个双序列比较的过程按照预定

顺序依次进行

相应的基本控制参数有两种空隙罚分

gap penalty以及位置同源或替代的权重系数

scores for various identical/nonidentical residues1和2GAP PENALTY由菜单选项1和2控制它们设定空隙以及空隙长度造成的罚分增加空隙罚分可以减少比较结果中空隙的数量加空隙长度的罚分可以使空隙更短末端的空隙不会被罚分

增3

DELAY DIVERGENT SEQUENCES

打开这一选项将会先比较同源性高的序列后比较同源性较低的序列该项数值即将特定同源性百分数设定为阀值低于该同源性的序列将会推迟比较4

The TRANSITION WEIGHT

为碱基转换A<>G或C <>T即嘌呤之间和嘧啶之

间的替换设定从0到1的权重系数系数0

意味将碱基转换看作一个完全的错配系数1意味将其看作一个完全的配对

对于远源序列建议将其设置为

而对于同源性较高的序列将这一系数适当增加会有好处

5

PROTEIN WEIGHT MATRIX

该选项可以打开一个让你选择权重矩阵weight

matrices的菜单对于蛋白质分析默认的矩阵是由Jorja和Steven Henikoff 创建的BLOSUM系列矩阵请注意是使用一系列矩阵

因为到底使用哪一个矩阵取决于序列之间的同源程度进化差异不同所使用的矩阵也不同6DNA WEIGHT MATRIX该选项打开一个菜单选择一个而不像蛋白分析那样是一系列核酸权重矩阵默认的一个是BESTFIT用来比较核酸序列的矩阵

7

在权重矩阵中

如果您愿意可以使用正值也可以使用负值

MATRIX负值权重矩阵选项系统将默认使用正值8PROTEIN GAP PARAMETERS蛋白序列空隙参数选项如果不使用NEGATIVE可以打开一个菜单让您可

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以设置蛋白序列比较结果的空隙罚分参数该选项仅在蛋白序列比较中可用

更多信息

如果您想得到关于设置参数和ClustalW法则的更多信息请从以下网址获取由原作者提供的完整文件www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/clustalw.html

序列翻译

激活序列

在GeneTank窗口的一个列表框内显示了原始序列以及由它翻译出的其他序列产生翻译序列的机制如下Translated DNA从原始的蛋白序列推导DNA

序列

由蛋白序列反推出的DNA序列或由原始DNA

翻译出蛋白序列再

Translated Protein从原始DNA翻译而成蛋白序列或原始蛋白序列翻译出DNA

序列再由DNA序列反推出蛋白序列

推导DNA按钮

当前序列为原始或推导DNA时该按钮不可用当前序列为蛋白序列时点击该按钮将会激活一个Codon Table Selection窗口您可以选择密码子列表和阅读框架翻译结果中的多义碱基请参照说明书的附录可选操作

Translate > To DNA

翻译蛋白质按钮当前序列为原始或推导蛋白序列时该按钮不可用当前序列为DNA序列时点击该按钮同样将会激活Codon Table Selection窗口您可以选择密码子列表和阅读框架如果原序列中存在的多义碱基使密码子无法翻译成为蛋白残基该残基位点会用*号代替可选操作

Translate > To Protein

Edit Codon Table窗口

使用这一窗口

您可以创造新的密码子列表删除或编辑已有的密码子列表但PRIMERPREMIER 提供的标准密码子列表是不能编辑的

使用

ADD按钮创建新的密码子列表会使用标准列表并初始命名为<New Organism 某一数字>使用Edit Codon Table Name

对

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话框可以编辑列表名称

使用

DELETE按钮则删除当前列表要改变某一密码子对应的氨基酸只需要用鼠标将其拖放到相应位置就可以点击密码子时鼠标指针会发生变化提示您正对其操作任何拖放操作会改变两行内容

一行即某种氨基酸

得到一个密码子的同时另一行失去这个密码子

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z Primer引物设计

Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎软件包含了强大的自动搜索法则只需要简单的操作就可以得到合适的引物PRIMER PREMIER

也提供了人工控制搜索引擎的方法便于根据您的特殊要求制定标准输出的引物通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和

二级结构关键参数如Tm值GC

含量和自由能G还能以图形显示还有另一个窗口来显示引物的比吸光度activity单位nmoles/OD和ug/OD及引物的分子量还可以将当前引物输入数据库打印或填写引物合成定购单为设计用于定点突变的引物该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的引物编辑工具您可以通过输入碱基或氨基酸残基来手动修改引物为分析多对反应引物如在复式及巢式PCR中使用function菜单下Multiplex/Nested选项您可以分析所有想用到的引物可以选择事先搜索的引物或手动添加引物软件提供将引物储存到数据库的功能也提供填写引物合成定购单的功能定购单上会自动填入引物序列和其他重要信息该项功能板块由以下部分组成Preferences参数设置窗口Primer Premier引物设计窗口Edit Primer引物编辑窗口Search Criteria搜索标准窗口Search Parameter搜索参数窗口Search Results搜索结果窗口Multiplex/Nested Primer复式及巢式PCR引物设计窗口Database引物数据库窗口Synthesis Order Form

生成引物合成订单Reports

结果报告Graphs图表Primer Premier引物设计窗口Primer Premier引物设计窗口是分析引物的关键该窗口包括以下功能即点即选Direct

Select引物性状列表和二级结构显示具体介绍如下Direct Select即点即选框

当您将鼠标指针移至该框中指针将变为铅笔型点击框中任何一处会产生一条起始位置最接近点选位置并与原序列互补的引物所有引物性状将即时更新引物5和3末端也会标记上以区分引物的扩增方向

如果点选一组序列比较结果引物序列将依据保守序列来确定这使得您很容易知道引物与某一特定序列有哪些错配位点

在序列比较中应用即点即选功能

在利用高保守序列区域设计引物时Primer Premier

会在引物窗口显示序列比较这样您很容易知道引物与每一特定序列有哪些错配位点点击序列任一地方将根据保守序列产生一条引物并加以分析引物也可以被编辑以便同某一特定序列匹配这些可以用来设计针对等位基因的引物通过View菜单选项可以切换显示多数倾向和少数分歧碱基Majority or Minority

Consensus切换到显示少数分歧碱基可以看出哪些核苷酸不能很好的与所有序列匹配

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性状列表这一列表显示了当前引物对的各种性状您可以通过以下三种方式选择一对引物作为当前

引物对

Direct Select

框根据上述使用Direct Select

的方法选择一条引物切换到另一条互补链选择反向引物得到一对引物对

在Search Results搜索结果窗口里选择一对引物对

使用输出命令在数据库窗口里选择一对引物对.

GC含量

GC%多性状列表能自动更新正反引物的长度起始位置

融链温度T

m

义性比吸光度Optical Activity单位ug/OD对于引物对来说长度条显示了PCR产物的长度而Ta Opt项显示了PCR反应适宜的退火温度各种引物性状计算公式请参阅附录A二级结构

PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构在左下的两排按钮可以想您显示发现了哪些二级结构而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构除了二级结构图框里也显示二级结构的自由能数值G单位

kcal/mol

在PRIMER PREMIER

窗口内的图框里显示的是最稳定的二级结构连续碱基配对用实线

显示而不连续碱基配对用虚线显示

按下按钮

All就会给出当前二级结构的报告您选择正向引物的发卡结构并点击

All

就会显示以下内容可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序看到未显示的部分最稳定的一种排在最前使用卷动条可以除了上述功能

这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮 Search Criteria

搜索参数窗口Search Results搜索结果如果已经实施过搜索窗口以及Edit Primer引物编辑窗口

点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示

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Edit Primer引物编辑窗口Edit Primer引物编辑

窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列在windows系统或Power Mac的Command-XCommand-C及Command-V

系统中您可以使用CTRL-XCTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法

进行粘贴时

Paste

粘贴

窗口会激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式

您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑

发生变化Analyze按钮就可以使用点击Analyze按钮即可分析编辑后的引物您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基如果您修改氨基酸残基相应位置可能出现多义密码子

除了上述的引物性状和二级结构资料具体参阅PRIMER PREMIER

窗口的章节该窗口也提供了限制性酶分析功能

您可以通过点击

Enzyme

按钮通过手动或软件提供的筛选方案来选择一组限制性酶

您可以使用

Prime按钮来将引物移动到更合适的结合位点

认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在通常这项功能可以让您确其他信息如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表请关闭本窗口从主菜单上选择Function >GeneTank激活GeneTank

窗口再选择Translate > Change Parameters打开Select Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口可选操作

Function > Edit PrimerSearch Criteria搜索标准窗口以下是基本搜索标准的详细信息

根据PCR引物

测序引物或杂交探针的不同要求选择不同的搜索标准是很有必要的PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准某些用以优化引物扩增能力的

标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计这两者需要的是较高的退火温度因此当您选

择不同的搜索标准PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求搜索公式中使用的具体参数请参看后面的Automatic Search Parameter自动搜索参数章节

Search Type

搜索类型框当前引物找寻合适的反向引物将指定您要搜索的是单个引物两条单独引物引物对或为默认设置下Search Range搜索范围是当前序列的全长默认PCR产物长度为100 bp到500 bp如果您是搜索单个引物该数值将不会起作用您也可以为搜索设定Primer Length引物长度您将会在下一章节了解该项设定的具体作用

最后您可以设定Search Mode搜索模式为自动或手动除非您有很特殊的要求或想完

全控制特定的搜索参数

建议您使用自动搜索利用PRIMER PREMIER找到多条引物再从中通过详细分析来挑选合适的使用可选操作

Function > Search

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Search Parameter Windows搜索参数窗口搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配

选项后利用Files按钮选择这些序列文件您可以在激活False PrimingAutomatic Search自动搜索

尽管PRIMER PREMIER已经自动设置了一些数值您还是可以选择在自动搜索中需要使用哪些参数

点击去掉相应参数左边框中的则该参数在搜索中不会被考虑

自动搜索开始的标准很严格但如果没有找到合适的引物则标准会自动降低直到找到合适的引物下列图表中显示了在PCR引物设计中自动搜索初始的严格参数其中Tm值范围是根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的如果您是搜索测序引物则相应参数会有所不同

具体列表如下图

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如果您是搜索杂交探针则相应参数如下图

Manual Search手动搜索及引物设计原理

在过去十年中为获得高效扩增PCR方法得到的很大发展我们对引物稳定性二级结

构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下大大提高了引物的扩增效率而PRIMER PREMIER 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡引物长度

引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度对越多数实验适宜引物长度为18到24

个碱基等于或少于15

碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建

library protocol28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物也允许您通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡PRIMER PREMIER

已经包含了合适的引物长度范围

如果您改变了它们软件将会自动记录并在下次使用直到您再次改变它们

因此您最好根据不同实验的特殊要求输入合适的长度范围

PRIMER PREMIER

以最短的指定长度开始搜索引物如果找到的引物的Tm值小于设定范围或GC含量不符合要求它将给引物增加一个碱基长度并重新计算Tm值和GC含量看其是否符合要求如果引物长度达到最大值还不能符合要求则该引物将会被剔除这种搜索机制保证找到的引物是符合Tm值和GC含量要求的最短引物

为设计一条高效引物

有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次如下Tm

融链温度

PRIMER PREMIER

根据相邻二碱基对作用理论

nearest neighbor theory

来计算融链

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温度请参看附录A中关于公式的说明选择的Tm范围应该为退火提供足够的热度在自动搜索中PRIMER PREMIER

使用的范围选择机制如下

首先计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm

值

得出平均值后按照不同的严格度要求确定的波动值根据这一平均值来计算出Tm范围

PCR反应的合适Tm范围为56到63°C以上机制是被设根据已发表的实验数据文献

8

计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物GC%GC

含量

对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%请参看上文Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具体参数Degeneracy

多义性

当设计多义引物时

应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免

3

末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸详情请参看本说明的Degeneracy多义性章节3’ End Stability3

末端稳定性

引物稳定性影响它的错配效率一条理想的引物应该有一个稳定性较强的

5末端和相对稳定性较弱的

3末端如果引物

3

稳定性强有可能在即使

5末端不配对的情况下造成错而3

末端稳定性低的引物较好的原因是配形成非特异性扩增条带

secondary bands

在引物发生错配时由于3末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸GC ClampGC

钳

引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳它保证引物与模板的稳定结合选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度使用菜单Report > Internal Stability选项可以看到象下图所显示的

一个引物的内部稳定性曲线表

Primer Premier 5.0中文使用说明书

请注意上图就显示一个好的引物3末端稳定性较弱而5末端有一个较强的GC钳Repeats and Runs

重复和循环

PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物例如引物包含ATATAT这样AT被重复三次那么这个引物将被剔除您可以设定可以接收的碱基重复的数量Secondary Structures

二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用

发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构并由于发卡结构的形成是分子内的反应仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳定性可以用自由能衡量自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应

按下按钮

All可以使用PRIMER PREMIER软件中的Hairpin Report功能帮助您回避类似二级结构Dimer

二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成

如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布

smearPRIMER PREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成局部的错配

3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量Pair Rating匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始PRIMER PREMIER会计算

每一对引物的匹配度100

分为满分并按照分数按降序排列计算引物对匹配度以及单个引物评分的公式请参看本说明的附录Search Results搜索结果

当您点击搜索程序窗口的

OK

按钮接受搜索结果后

Search Results

搜索结果窗口将会打开它显示了搜索中找到的所有引物或引物对

如果您选择了一条引物或一对引物对在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果与当前的序列配对的引物的位置和序列也会在Direct Select框上显示可选操作

Function > Search Results

Primer Premier 5.0中文使用说明书

Multiplex/Nested Primer复式及巢式PCR反应引物窗口

巢式PCR反应通常能大幅提高灵敏度同时又减少非特异性扩增产物通常在模板DNA浓度太低或不纯时采用您可以使用自动搜索或按您实验的需要搜索然后从中选择一系列合乎要求的引物PRIMER PREMIER可以确认它们是否会形成二聚体来帮助您选择巢式PCR反应引物当您接受搜索结果选择菜单Function >Multiplex/Nested Primers选项即可打开该窗口所有引物与全序列以图形显示在窗口顶部序列上的框架代表窗口中间放大显示的部分序列所在的位置通过拖动横行滚动条可以改变放大显示的区域所有提供的引物以竖线形式在顶部的图框显示

以蓝色三角形或红色三角形在下面的放大框中显示蓝色代表正向引物红色代表反向引物

点击三角形即选定一条对应的引物应用于您的巢式PCR反应同时三角形由空心变为实心表明已被选中选中的引物会在下面的图框中以图表形式显示您会看到在您选择引物的同时已选引物间可能存在的交叉二聚体也同时显示出来PRIMER PREMIER能即时分析所有的已选引物并显示它们之间间可能存在的交叉二聚体结构您可以继续选择引物直到您找到一组没有或很少有稳定的交叉二聚体的引物要剔除一条已选引物非常简单再次点击对应的实心三角形就可以了您也可以手动添加一条引物这样便于您使用已有的引物或通用引物您

也可以手动添加所有的引物并分析它们之间的能否形成交叉二聚体您可以指定输入的寡聚核酸作为正向引物还是反向引物它们的起始位置和序列如果不指定起始位置则默认为

5末端第一个碱基如果想删除一条引物只需选定并点击Delete按钮您可以打印模板序列及所有的引物已选引物显示为实心三角形未选引物显示为空心三角形列表包含的引物以及所有可能的交叉二聚体结构也同样被打印出来Database引物数据库窗口引物数据库可以用来保存引物序列您可以为每一条引物命名并保存在一个原有的或新建的数据库中

在数据库窗口中您可以使用Order Primers按钮来定购引物有两种主要方法可以将已选的引物输入到数据库中您可以在Search Results窗口中标记想选择的引物

然

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