病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。

3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。 4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液）

5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法 五、TCID50的计算方法 1、Reed-Muench两氏法 出现CPE孔病毒液稀释度 数（cytopathic effe无CPE孔数 ct,细胞病变效应） 累计 出现CPE孔所占的% CPE孔数 0 0 1 5 7 8 27 19 11 4 1 0 无CPE孔数 0 0 1 6 13 21 10 10 10 10 10 10 -6-5-4-3-2-18 8 7 3 1 0 100（27/27） 100（19/19） 91.6 （11/12） 40（4/10） 0.7（1/14） 0（0/21） CPE：Cytopathic effect（细胞病变效应） 距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8 lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 怎么计算？查看下例karber法计算 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1ml 含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。 2、Karber法 病毒液稀释度 10-1 10-2 出现CPE的孔数 8 8 出现CPE孔的比率 8/8=1 8/8=1 10-3 10-4 10-5 10-6 7 3 1 0 7/8=0.875 3/8=0.375 1/8=0.125 0/8=0 lgTCID50=L-d(s-0.5) L：最高稀释度的对数（-1）

D：稀释度对数之间的差（lg10-1-lg10-2=1）

S：阳性孔比率总和（1+1+0.875+0.375+0.125=3.375） lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875

TCID50=10-3.875/0.1ml

含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。

实例1鸡新城疫活疫苗

（一）培养病毒 将鸡新城疫病毒（la sota株）接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。 （二）检测尿囊液病毒的EID50

1．EID50的概念 EID50为半数鸡胚感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后，能使半数鸡胚发生感染的病毒量。 2．病毒EID50的测定

（1）稀释病毒 将收获的尿囊液充分混匀后取1ml，作10倍递进稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀释度。 （2）接种鸡胚 每个稀释度接种9～11d SPF鸡胚5枚，接种量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，逐日观察至120h，其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏，至第5d时将所有的鸡胚置4℃冰箱中冷却4h或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别存放。

（3）检测血凝价，判断感染情况 用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价，当HA≥1:128时判为感染。

3．根据血凝价计算EID50：EID50计算举例 (1)EID50测定结果见表

EID50测定结果 (接种剂量0.1ml)

观察结果 病毒稀释度 感染数 无感染数 感染% 感染数 无感染数 感染% 累计结果 10-5 5 0 100 10 0 100 10-6 3 2 60 5 2 71 10-7 2 3 40 2 5 29 10-8 0 5 0 0 10 0

（2）按Reed和Muench法计算EID50

EID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.5，稀释系数的对数为-1。代入上式则： lg EID50=（-6）＋0.5×（-1）=-6.5 ∴ EID50=10-6.5/0.1ml

即：将病毒悬液作10-6.5稀释后，给鸡胚接种0.1ml，可以使50%的鸡胚感染。 (3)结果判断

在生产实践中，通过EID50检测，当尿囊液中病毒的EID50≥10-6.0时，方可作为制苗毒液，达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理，达到毒价标准后方可灭活制苗。

实例2鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备 （一）培养病毒

按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液，通过细胞计数结果，调细胞数为100万个/ml。按0.3%～0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒，置37℃ 5%CO2培养箱培养72～96h，观察CPE，由法氏囊炎

病毒所致的CPE主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。细胞出现70%以上的CPE时即可将培养瓶反复冻融3次，收获病毒，供检测用。

（二）检测TCID50

1．TCID50的概念 TCID50为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。

2．病毒TCID50的测定

（1）稀释病毒液 将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释，即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。

（2）接种细胞培养板 取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合，接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4～6孔，每孔100μL，同时设立病毒对照和细胞对照组。置37℃ 5%CO2培养箱培养72h。观察记录病变情况。

（3）判断 70%以上的细胞出现CPE判为感染。 3．TCID50计算举例 （1）CPE结果见表

TCID50测定结果 (接种剂量100μL)

观察结果 病毒稀释度 CPE数 无CPE数 感染% CPE数 无CPE数 感染% 累计结果 10-5 5 0 100 11 0 100 10-6 4 1 80 6 1 86 10-7 2 3 40 2 4 33 10-8 0 5 0 0 9 0

（2）计算按Reed和Muench法

TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.68，稀释系数的对数为-1。代入上式则：

lgTCID50=（-6）＋0.68×（-1）=-6.64 ∴ TCID50=10-6.64，100μL

即：将病毒悬液作10-6.64稀释后，给细胞培养物接种100μL，可以使50%的细胞产生CPE。

（3）结果判断 当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。

本例高于50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.68，稀释系数的对数为-1。代入上式则：

lgTCID50=（-6）＋0.68×（-1）=-6.64 ∴ TCID50=10-6.64，100μL

即：将病毒悬液作10-6.64稀释后，给细胞培养物接种100μL，可以使50%的细胞产生CPE。

（3）结果判断 当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。

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