病毒感染力的滴定(TCID50的测定)

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病毒感染力的滴定(TCID50的测定)

概念:半数感染量(median infective dose, ID50) 表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测

蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU):用细胞来检测 三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV) 四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释,从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共8 孔,每孔接种100μl。

3、在每孔加入细胞悬液100μl,使细胞量达到2~3×105个/ml。 4、设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排。(100μl生长液+100μl细胞悬液)

5、逐日观察并记录结果,一般需要观察5-7天。

6、结果的计算,按Reed-Muench两氏法或Karber法 五、TCID50的计算方法 1、Reed-Muench两氏法 出现CPE孔病毒液稀释度 数(cytopathic effe无CPE孔数 ct,细胞病变效应) 累计 出现CPE孔所占的% CPE孔数 0 0 1 5 7 8 27 19 11 4 1 0 无CPE孔数 0 0 1 6 13 21 10 10 10 10 10 10 -6-5-4-3-2-18 8 7 3 1 0 100(27/27) 100(19/19) 91.6 (11/12) 40(4/10) 0.7(1/14) 0(0/21) CPE:Cytopathic effect(细胞病变效应) 距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数) =(91.6-50)/(91.6-40) = 0.8 lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 怎么计算?查看下例karber法计算 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1ml 含义:将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。 2、Karber法 病毒液稀释度 10-1 10-2 出现CPE的孔数 8 8 出现CPE孔的比率 8/8=1 8/8=1 10-3 10-4 10-5 10-6 7 3 1 0 7/8=0.875 3/8=0.375 1/8=0.125 0/8=0 lgTCID50=L-d(s-0.5) L:最高稀释度的对数(-1)

D:稀释度对数之间的差(lg10-1-lg10-2=1)

S:阳性孔比率总和(1+1+0.875+0.375+0.125=3.375) lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875

TCID50=10-3.875/0.1ml

含义:将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。

实例1鸡新城疫活疫苗

(一)培养病毒 将鸡新城疫病毒(la sota株)接种于9~11d鸡胚的尿囊腔中,接种后48~72h收获病毒,供检测与制苗用。 (二)检测尿囊液病毒的EID50

1.EID50的概念 EID50为半数鸡胚感染量,是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后,能使半数鸡胚发生感染的病毒量。 2.病毒EID50的测定

(1)稀释病毒 将收获的尿囊液充分混匀后取1ml,作10倍递进稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀释度。 (2)接种鸡胚 每个稀释度接种9~11d SPF鸡胚5枚,接种量为0.1ml/枚,37℃温箱培养,逐日观察至120h,其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏,至第5d时将所有的鸡胚置4℃冰箱中冷却4h或过夜,收获每枚鸡胚的尿囊液,分别存放。

(3)检测血凝价,判断感染情况 用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价,当HA≥1:128时判为感染。

3.根据血凝价计算EID50:EID50计算举例 (1)EID50测定结果见表

EID50测定结果 (接种剂量0.1ml)

观察结果 病毒稀释度 感染数 无感染数 感染% 感染数 无感染数 感染% 累计结果 10-5 5 0 100 10 0 100 10-6 3 2 60 5 2 71 10-7 2 3 40 2 5 29 10-8 0 5 0 0 10 0

(2)按Reed和Muench法计算EID50

EID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6,距离比例为0.5,稀释系数的对数为-1。代入上式则: lg EID50=(-6)+0.5×(-1)=-6.5 ∴ EID50=10-6.5/0.1ml

即:将病毒悬液作10-6.5稀释后,给鸡胚接种0.1ml,可以使50%的鸡胚感染。 (3)结果判断

在生产实践中,通过EID50检测,当尿囊液中病毒的EID50≥10-6.0时,方可作为制苗毒液,达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理,达到毒价标准后方可灭活制苗。

实例2鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备 (一)培养病毒

按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液,通过细胞计数结果,调细胞数为100万个/ml。按0.3%~0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒,置37℃ 5%CO2培养箱培养72~96h,观察CPE,由法氏囊炎

病毒所致的CPE主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。细胞出现70%以上的CPE时即可将培养瓶反复冻融3次,收获病毒,供检测用。

(二)检测TCID50

1.TCID50的概念 TCID50为半数细胞培养物感染量,是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后,能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。

2.病毒TCID50的测定

(1)稀释病毒液 将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释,即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。

(2)接种细胞培养板 取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合,接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4~6孔,每孔100μL,同时设立病毒对照和细胞对照组。置37℃ 5%CO2培养箱培养72h。观察记录病变情况。

(3)判断 70%以上的细胞出现CPE判为感染。 3.TCID50计算举例 (1)CPE结果见表

TCID50测定结果 (接种剂量100μL)

观察结果 病毒稀释度 CPE数 无CPE数 感染% CPE数 无CPE数 感染% 累计结果 10-5 5 0 100 11 0 100 10-6 4 1 80 6 1 86 10-7 2 3 40 2 4 33 10-8 0 5 0 0 9 0

(2)计算按Reed和Muench法

TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

本例高于50%病毒稀释度的对数为-6,距离比例为0.68,稀释系数的对数为-1。代入上式则:

lgTCID50=(-6)+0.68×(-1)=-6.64 ∴ TCID50=10-6.64,100μL

即:将病毒悬液作10-6.64稀释后,给细胞培养物接种100μL,可以使50%的细胞产生CPE。

(3)结果判断 当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。

本例高于50%病毒稀释度的对数为-6,距离比例为0.68,稀释系数的对数为-1。代入上式则:

lgTCID50=(-6)+0.68×(-1)=-6.64 ∴ TCID50=10-6.64,100μL

即:将病毒悬液作10-6.64稀释后,给细胞培养物接种100μL,可以使50%的细胞产生CPE。

(3)结果判断 当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/wwxr.html

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