滑鼠蛇消化道5-羟色胺细胞形态和分布密度的<p>增龄变</p>

中国组织化学与细胞化学杂志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY 第28卷第6期

2019年12月V ol .28.No .6

December .2019

〔收稿日期〕2019-09-24 〔修回日期〕2019-12-10

〔基金项目〕安徽农业大学2018年国家级大学生创新创业训练计划项目创新训练项目（201810364005）

〔作者简介〕刘溯源，女（1999年），汉族，本科

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：zzq-003@bdb1dbd2a100a6c30c22590102020740bf1ecdf9 滑鼠蛇消化道5-羟色胺细胞形态和分布密度的

增龄变化

刘溯源1，伍亮1，姚利1，汪寅1，杨会会2，张志强3*

（1安徽农业大学动物科技学院动物医学系，2安徽农业大学资源与环境学院生态学系，3安徽农业大学动

物科技学院水产养殖学系，合肥 230036）

〔摘要〕目的 比较50日龄内滑鼠蛇（Ptyas mucosus ）消化道5-羟色胺（5-hydroxytryptamine ，5-HT ）细胞形态和分布密度的增龄变化及部位差异。方法 用免疫组织化学ABC 法鉴别和定位生后3、7~10（首次蜕皮组）、20、30、40和50d 滑鼠蛇消化道各部位的5-HT 细胞。结果 5-HT 细胞形态多样，胃底、幽门和回肠的分布密度无日龄差异，贲门30日龄组显著高于50日龄组，其他部位均在20~50日龄组最高，3日龄组最低。3和7~10日龄组胃部分布密度最高，十二指肠和空肠、十二指肠和回肠最低；20、30、40和50 日龄组直肠和/或胃部密度最高，食道、十二指肠和回肠、食道和回肠、回肠及十二指肠和回肠最低。结论 滑鼠蛇生后3d 消化道各段均有5-HT 细胞分布，分布密度随日龄而变化，开口前胃部密度较高，开口后直肠部位密度增加，提示随发育进程的推进，5-HT 对食物的机械消化作用和促进食物残渣排出的能力均明显增强。

〔关键词〕滑鼠蛇；消化道；5-羟色胺；分布密度；发育

〔中图分类号〕Q952 〔文献标识码〕A DOI ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2019. 06. 006

Age-related changes of morphology and distribution density of 5-hydroxytryptamine

cells along the digestive tract of Ptyas mucosus

Liu Suyuan 1, Wu Liang 1, Yao Li 1, Wang Yin 1, Yang Huihui 2, Zhang Zhiqiang 3*

(1Department of Veterinary Medicine, School of Animal Science and Technology; 2Department of Ecology, School of Resources and Environment, 3Department of Aquaculture, School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036,

China)

〔Abstract 〕Objective To compare the age-related variations of morphology and distribution densities of 5-hydroxytryptamine (5-HT) cells along the digestive tract of Ptyas mucosus within postnatal 50 days period. Methods 5-HT positive cells were identified and localized by avidin-biotin-peroxidase complex immunohistochemical method along the digestive tract of Ptyas mucosus from 3d, 7~10d (first sloughing), 20d, 30d, 40d and 50d age groups, respectively. Results The morphology of 5-HT cells was various. Distri -bution density of 5-HT cells did not show significant age-related differences in the fundus, pylorus and ileum. However, distribution density of 5-HT cells in the cardia of the 30d age group was significantly higher than that of 50d age group , and reached the highest values from 20d to 50d age groups but the lowest of the 3d age group in any other segment of digestive tract. Distribution density of 5-HT cells showed the highest values in the stomach but the lowest in the duodenum and jejunum, duodenum and ileum, respectively in the 3d and 7~10d age groups. While maximum distribution density of 5-HT cells were in the rectum and/or stomach in the 20, 30, 40 and 50d age groups, and their minimum values were in esophagus, duodenum and ileum, esophagus and ileum, ileum, as well as duodenum and ileum, respectively. Conclusion 5-HT cells were firstly observed at 3d age after birth in different segments of the whole digestive tract in Ptyas mucosus , and the distribution density of 5-HT cells changed as age (postnatal day) changed. Higher density of 5-HT cells was found in the stomach before initial feeding, and with a significant increase in the rectum after initial feeding, suggesting that 5-HT may strength the abilities of mechanical digestion of food and the excretion of food residues with the advance of development processes.

〔Keywords 〕Ptyas mucosus ; digestive tract; 5-hydroxytryptamin; distribution density; development

刘溯源等.滑鼠蛇消化道5-羟色胺细胞形态和分布密度的增龄变化

第6期 515

爬行动物消化道含有多种内分泌细胞，形态上区分为闭合型和开放型两种细胞类型，可执行内分泌、外分泌和旁分泌等多种功能[1-3]。其中，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）细胞是研究较多的一种内分泌细胞类型[2]，广泛分布于爬行动物的消化道中[4-7]，但缺乏生后不同发育阶段间的比较研究[2]。滑鼠蛇（Ptyas mucosus）是人工养殖的主要无毒蛇蛇种之一，出壳后1~2个月是制约其存活的关键生活史阶段[8]。本研究以室内孵化的滑鼠蛇幼蛇为研究对象，对出壳后3d、首次完成蜕皮，以及第一次蜕皮后10d、20d、30d和40d的幼蛇，分别测定了消化道5-HT细胞的形态和分布密度，旨在为生后滑鼠蛇消化功能建立提供形态学基础，为其规模化健康养殖和改进投喂方式提供理论基础。

材料和方法

1 实验材料

实验用不同窝滑鼠蛇幼蛇于2018年8月取自安徽省池州市龙井山蛇类驯养专业合作社，电热油汀控温（30±1）℃，保持相对湿度为（70%~75%）。随机选取生后3d，7~10d（首次蜕皮），20d，30d，40d和50d的幼蛇，每窝每个日龄组各取1条幼蛇，直至每个日龄组取到8条幼蛇为止，体重分别为（17.338 ± 0.864）g、（19.611 ± 0.990）g、（22.201 ± 0.677）g、（27.822 ± 0.652）g、（45.061 ± 0.971）g和（56.417 ± 2.866）g，开口后饲喂活体小蛙。解剖后取消化道各段，剔除肠系膜，去除消化道内容物后，截取食道、贲门、胃底、幽门、十二指肠、空肠、回肠和直肠各段，每段长约1cm，改良后的Bouin’s液固定，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（4~5μm），用涂有甲醛明胶的载玻片贴片，40℃烘干后备用。

2 免疫组织化学染色

参照张志强等[5]对竹叶青蛇（Trimeresurus stej-negeri）的研究方法，用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（avidin-biotin-peroxidase complex, ABC）免疫组织化学法鉴别和定位滑鼠蛇不同发育阶段消化道各部位的5-HT细胞。兔抗人5-HT抗血清为即用型，编号：ZA-0231；生物素化标记的二抗为羊抗兔IgG 抗血清工作液，三抗为辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，用稀释20倍的苏木精染液复染。阴性对照，分别以正常的山羊血清和PBS代替一抗，其余步骤同上。

3 5-HT细胞计数与拍照

用光镜（Motic-BA 210 Digital）观察5-HT细胞的形态；每条幼蛇消化道的每个部位计数完整切片1张，每张切片共计数3个400倍视野中的5-HT细胞数量，以其平均值代表该只幼蛇该部位5-HT细胞的分布密度，以同一发育阶段全部8条幼蛇的平均值表示该日龄组该部位5-HT细胞的分布密度。

4 统计与分析

用SPSS 19.0 for windows进行数据处理和统计分析。以日龄和消化道部位作为组间因子，用双因素方差分析（Two-way ANOVA）统计滑鼠蛇消化道5-HT细胞分布密度的日龄和部位差异。用单因素方差分析（One-way ANOVA）及多重比较（multiple comparisons）post hoc test统计出壳后3、7~10（首次蜕皮组）、20、30、40和50日龄组消化道5-HT 细胞分布密度的部位差异，以及消化道同一部位5-HT细胞分布密度的日龄差异。文中数据均以平均值±标准误（Mean ±SE）表示，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

结果

1 滑鼠蛇消化道5-HT细胞形态的增龄变化

50日龄内，5-HT细胞见于滑鼠蛇消化道各段，多位于绒毛上皮细胞之间，少数分布于腺上皮细胞之间，分为闭合型细胞和开放型细胞。闭合型细胞呈圆形或椭圆形，多见于食道（图1A，图1B）、十二指肠（图1C，图1D）和贲门（图1E，图1F）。开放型细胞呈蝌蚪状、毛笔头状、短棒状或三角形，主要分布于食道（图1G，图1H）、胃底（图1I，图1J）和直肠（图1K，图1L），十二指肠（图1M，图1N）和空肠（图1O，图1P）偶见。

2 滑鼠蛇消化道同一部位5-HT细胞分布密度的日龄差异

5-HT细胞分布密度的日龄（F5,336 = 4.494, P < 0.01）和消化道部位（F7,336 = 37.564, P < 0.01）差异都极为显著，两者之间也有极明显的交互作用（F35,336 = 2.677, P < 0.01）。

食道5-HT细胞的分布密度40日龄组显著高于3、7~10、20和30日龄组（F5,42 = 7.433, P < 0.05），

中国组织化学与细胞化学杂志516第28卷50日龄组与其他日龄组无显著差异；贲门30日龄组

显著高于50日龄组（F 5,42 = 3.210, P < 0.05），十二

指肠20、30、40和50日龄组显著高于3和7~10日

龄组（F 5,42 = 12.074, P < 0.05），空肠（F 5,42 = 4.512, P < 0.05）和直肠（F 5,42 = 4.002, P < 0.05）20和50日龄组均显著高于3日龄组；胃底（F 5,42 = 1.937, P > 0.05）、幽门（F 5,42 = 0.709, P > 0.05）和回肠（F 5,42

= 0.759, P > 0.05）无日龄差异（表1

）。

增龄变

图1 滑鼠蛇消化道5-羟色胺细胞形态的增龄变化。A ，3日龄食道圆形的5-HT 细胞；B ，3日龄食道椭圆形的5-HT 细胞；C ，20日龄十二指肠圆形的5-HT 细胞；D ，20日龄十二指肠椭圆形的5-HT 细胞；E ，3日龄贲门圆形的5-HT 细胞；F ，50日龄贲门椭圆形的5-HT 细胞；G ，40日龄食道蝌蚪形的5-HT 细胞；H ，3日龄食道蝌蚪形的5-HT 细胞；I ，3日龄胃体毛笔头状的5-HT 细胞；J ，3日龄胃底短棒状的5-HT 细胞；K ，10日龄直肠蝌蚪形的5-HT 细胞；L ，30日龄直肠毛笔头状的5-HT 细胞；M ，3日龄十二指肠毛笔头状的5-HT 细胞；N ，10日龄十二指肠短棒状的5-HT 细胞；O ，20日龄空肠三角形的5-HT 细胞；P ，50日龄空肠三角形的5-HT 细胞。EP ，上皮；SG ，胃腺；箭头，5-HT 阳性细胞；比例尺，15μm

Fig. 1 Age-related changes of morphology of 5-hydroxytryptamine cells along the digestive tract of Ptyas mucosus . A, round shaped 5-HT cells in the esophagus of 3d old Ptyas mucosus ; B, ellipse shaped 5-HT cells in the esophagus of 3d old Ptyas mucosus ; C, round shaped 5-HT cells in the duode-num of 20d old Ptyas mucosus ; D, ellipse shaped 5-HT cells in the duodenum of 20d old Ptyas mucosus ; E, round shaped 5-HT cells in the cardia of 3d old Ptyas mucosus ; F, ellipse shaped 5-HT cells in the cardia of 50d old Ptyas mucosus ; G, tadpole shaped 5-HT cells in the esophagus of 40d old Ptyas mucosus ; H, tadpole shaped 5-HT cells in the esophagus of 3d old Ptyas mucosus ; I, brush-head shaped 5-HT cells in the fundus of 3d old Ptyas mucosus ; J, short-bar shaped 5-HTcells in the fundus of 3d old Ptyas mucosus ; K, tadpole shaped 5-HT cells in the rectum of 10d old Ptyas mucosus ; L, brush-head shaped 5-HT cells in the rectum of 30d old Ptyas mucosus ; M, brush-head shaped 5-HT cells in the duodenum of 3d old Ptyas mucosus ; N, short-bar shaped 5-HT cells in the duodenum of 10d old Ptyas mucosus ; O, triangle shaped 5-HT cells in the jejunum of 20 day old Ptyas mucosus ; P, triangle shaped 5-HT cells in the jejunum of 50d old Ptyas mucosus . EP, epithelium; SG, stomach gland; arrows, 5-HT positive cells; scale bar, 15μm

刘溯源等.滑鼠蛇消化道5-羟色胺细胞形态和分布密度的增龄变化

第6期 517表1 滑鼠蛇消化道5-羟色胺细胞分布密度的增龄变化和部位差异（单位：细胞个数/400×视野）

Tab. 1 Age-related and segmental differences of distribution densities on 5-hydroxytryptamine immunoreactive positive cells in

the digestive tract of Ptyas mucosus (unit: cells/400×

增龄变

fields)

注：同一行不同的上标小写字母表示消化道同一部位不同年龄组之间的分布密度差异显著（a > b）；同一列下标不同的大写字母表示同一年龄组消化道不同部位之间的分布密度差异显著（A > B > C > D）

Notes: Different superscripts lowercase letters at the same line mean significant differences of distributive densities in the same segment among different age groups (a > b); Different subscripts capital letters at the same column mean significant differences of distributive densities among different segments of the digestive tracts for the same age group (A > B > C > D)

3 同一日龄组滑鼠蛇消化道5-HT细胞分布密度的部位差异

3日龄组5-HT细胞的分布密度（F7,56 = 6.816, P < 0.01）贲门最高，胃底和幽门与之接近，食道、回肠和直肠居中，十二指肠和空肠最低；7~10日龄组（F7,56 = 8.367, P < 0.01）胃底最高，贲门和幽门与之接近，直肠居中，食道和空肠较低，十二指肠和回肠最低；20日龄组（F7,56 = 10.205, P < 0.01）直肠、胃底和幽门最高，贲门和空肠其次，食道、十二指肠和回肠最低；30日龄组（F7,56 = 8.912, P < 0.01）直肠和贲门最高，胃底和幽门其次，十二指肠和空肠较低，食道和回肠最低；40日龄组（F7,56 = 5.586, P < 0.01）直肠最高，食道和幽门其次，贲门和胃底居中，十二指肠和空肠较低，回肠最低；50日龄组（F7,56 = 10.525, P < 0.01）直肠最高，幽门和胃底与直肠接近，空肠、食道和贲门较低，十二指肠和回肠最低。

讨 论

50日龄内滑鼠蛇消化道5-HT细胞的形态学特征较为稳定，5-HT细胞分布密度在开口前后的部位和日龄差异较大，提示滑鼠蛇消化功能建立可能始于生后30~50d，该时期是投喂配合饲料的最佳时期。1 滑鼠蛇消化道5-HT细胞形态学特征的增龄变化

滑鼠蛇出壳后3d消化道各段都有5-HT细胞分布，既有呈圆形或椭圆形的闭合型细胞，也有形态多样的开放型细胞，后者有细胞质突起伸向肠腔，或有突起与邻近细胞相接触，可能执行腔分泌和旁分泌的功能，这与生后1~45d的大鼠[9]、生后5～60d的小鼠[10]和其他两栖爬行动物相似[2, 11]。50d龄内滑鼠蛇消化道5-HT细胞的形态学特征未见明显改变，幼体、成体和老年长爪沙鼠（Meriones Unguiculatus）肠道5-HT细胞[12]，以及幼体、亚成体和成体中华蟾蜍（Bufo gargarizans）消化道嗜银细胞[13]和生长抑素细胞的形态学特征也都无明显的年龄变化[14]，但在禁食条件下，东方蝾螈（Cynops orientalis）禁食组开放型和闭合型5-HT细胞的比值胃体和空肠高于喂食组，回肠低于喂食组[15]。

2 同一发育阶段滑鼠蛇消化道5-HT细胞分布密度的部位差异

3日龄和首次蜕皮的滑鼠蛇消化道5-HT细胞都在贲门、胃底和幽门数量较多，十二指肠和空肠、十二指肠和回肠较少；20、30、40和50 日龄组直肠和/或胃部最多，食道、十二指肠和回肠、食道和回肠、回肠及十二指肠和回肠最少。大鼠生后1~45d 及小鼠生后5~60d，胃肠道各段均可见到5-HT细

中国组织化学与细胞化学杂志

518第28卷

胞，两者均以十二指肠分布最为密集，大鼠从空肠到回肠数量渐少[9]，小鼠十二指肠明显多于小肠其他段和结肠，腺胃数量最少[10]；随生后发育过程进行，5-HT细胞数量持续增加[9, 10]。滑鼠蛇出壳后和首次蜕皮后，胃部5-HT细胞密度较高，有助于促进消化道的机械运动，尽快排空消化道内来源于胚胎时期的营养物质，促进滑鼠蛇尽快开口摄食；开口后，滑鼠蛇除继续通过较高密度的5-HT细胞来维持胃部的机械运动外，直肠部位的5-HT细胞密度明显升高，这可能有助于食物残渣的排出。

3 滑鼠蛇消化道同一部位5-HT细胞分布密度的日龄差异

滑鼠蛇食道、贲门、十二指肠、空肠和直肠5-HT细胞的分布密度都在20~50d龄最高，3d龄最低，但贲门30d龄组高于50d龄组，说明随着发育历程的推进，贲门的机械消化作用在开口后显著增强，但随着发育进程的推进而减弱，这可能是滑鼠蛇幼蛇开口难的原因之一。大鼠生后45d内，18d时胃肠道各段5-HT细胞的数量最多[9]，小鼠生后5~60d 5-HT细胞的数量随生后发育成熟而持续性增加[10]。出壳、蜕皮和开口时间早晚是制约滑鼠蛇养殖效益的关键生活史阶段[8, 16]。生产上，通常以活体幼蛙诱导滑鼠蛇开口摄食，之后再投喂褪毛后的鸡雏或鸭雏[8]。首次蜕皮后，滑鼠蛇开始主动摄食，根据其消化道5-HT细胞的发育特点和年龄变化，结合5-HT调控摄食、促进消化道蠕动和调节肠道菌群组成的生理功能[2, 3]，建议可在滑鼠蛇开口后尽量投喂活体小动物，以便于食物顺利进入消化道，满足其快速生长发育的能量需求。

滑鼠蛇出壳后3d消化道各段均有5-HT细胞分布，开口前胃部密度较高，开口后直肠部位密度增加，说明随发育进程滑鼠蛇幼蛇对食物的机械消化作用、对营养物质的消化吸收能力和排出食物残渣的能力均明显增强，可考虑在开口后逐渐增加投喂量和饲料块的大小。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/wwtl.html