酶水解法测定玉米中淀粉含量方法的探讨

酶水解法测定玉米中淀粉含量方法的探讨

刘海明，王旭艳，高凤宇

（承德避暑山庄企业集团有限责任公司，河北 承德 067500）

摘 要：玉米中淀粉含量的测定方法有很多，GB/T5514-2008标准中规定采用酶水解法对玉米中的淀粉含量进行测定，但该方法存在结果偏低、偏差较大的缺点。本实验对标准中的实验方法及相关条件进行了优化，如玉米称样量、加水量、液化酶用量、液化温度、液化时间、水浴条件、过滤方式、加酸量等，并对实验中存在的问题进行了分析和探讨，优化后的方法适合低脂肪谷物中淀粉含量的测定，具有实用、准确、稳定性好的特点。

关键词：玉米；淀粉含量；酶水解

玉米是世界三大粮食作物（稻谷、小麦、玉米）之一，也是畜牧业生产的主要原料 [1]。玉米淀粉是淀粉的主要品种，占世界淀粉总量80%[2]。玉米淀粉主要在玉米胚乳中，由单一的葡萄糖分子脱水聚合而成的，葡萄糖分子以α-1,4-糖苷键，α-1,3-糖苷键，α-1,6-糖苷键链接而成的天然物质，质量分数在70%～80%之间[3]。近年来，随着玉米淀粉产量的加大，其在食品、制糖、发酵、医药和化工等的增稠剂、甜味剂中应用越来越多[4]。

淀粉含量的测定方法有酸水解法[5]，酶水解法[6]和旋光法[7]等，本文主要针对GB/T5514-2008[8]标准方法，为保证淀粉含量测定的准确性，对标准中的相关环节及存在的问题与不足之处进行了分析探讨，并提出了相关解决方法，为进一步完善酶水解法测定玉米中淀粉含量方法提出了建议。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂及仪器

原料：玉米（产地：东北和承德，种类：粉质和胶质玉米）。

试剂：淀粉酶溶液（5 g/L酶活力为14万U/mL的耐高温a-淀粉酶），碘溶液，甲基红指示液，6 mol/L盐酸溶液，200 g/L氢氧化钠溶液，碱性酒石酸铜甲液，碱性酒石酸铜乙液，葡萄糖标准溶液，所用试剂均为分析纯，且实验用水应符合GB/T 6682中三级水的要求。

仪器与设备：粉碎机，回流冷凝装置，天平，三角瓶，容量瓶，分样筛：孔径0.45 mm (40目)。 1.2 实验原理

淀粉经淀粉酶水解成小分子糖，再用盐酸水解成还原性单糖，最后按GB/T 5009.7-2008[9]测定还原糖，并折算成淀粉含量。 1.3 实验方法

1.3.1 淀粉酶溶液配制

称取耐高温α-淀粉酶0.5 g，加100 mL水溶解，临用现配。

碘溶液、盐酸溶液和氢氧化钠溶液和甲基红指示剂，均参照GB/T 5514-2008中方法进行配制；碱性酒石酸铜甲液，碱性酒石酸铜乙液，葡萄糖标准溶液，均参照GB/T 5009.7-2008的方法进行配制。 1.3.2 玉米粉液化酶用量和液化时间的确定

称取2.0 g的玉米粉4份进行糊化后，分别加入耐高温α-淀粉酶稀释液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL在75~80℃水浴中进行液化实验（淀粉酶稀释液:称取14万U/mL耐高温α-淀粉酶0.5 g，加100 mL水溶解，相当于700 U/mL。临用现配），在不同的时间分别取出上清液和试样中玉米细渣与碘液进行显色试验，细渣需要用玻璃棒进行研磨，通过渣子显色情况来判断细渣中淀粉是否完全液化好。 1.3.3 计算

本文中所有实验标定碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖m1＝10.3 mg，试剂空白消耗葡萄糖液都是10.2mL。按GB/T5009.7-2008测定还原糖。

（1）试样中淀粉的计算公式：

X=

式中：

X一试样中淀粉的含量，g/100 g；

ml一碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量，mg； m一称取试样的质量，g；

V一测定时平均消耗试样溶液的体积，mL；

m2—试剂空白相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量，mg； 0.9—还原糖(以葡萄糖计)换算成淀粉的换算系数。 （2）试样中还原糖的计算公式：

X=

式中：

X一试样中还原糖的含量，g/100 g； m一称取试样的质量，g；

m2一标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于还原糖的质量，mg。

2 结果与分析

(m1?m2)?0.9?100 V50m?250?250?1000m2?100 10m?250?1000

2.1玉米称样量和加水量的确定

选择合适的玉米称样量和加水量，对实验结果是很重要的。标准要求称样量2-5 g、加水量50 mL，按此方法，我们选择2.7 g称样量进行实验，糊化效果不好。由于玉米含淀粉含量一般在60%以上，根据实验和定容时的稀释倍数最后我们选择称取2 g玉米粉试样，加水量70 mL时能够达到较好的糊化效果。 2.2 洗涤与不洗涤玉米粉对淀粉含量测定的影响

按照GB/T5514-2008标准中7.3.1项，比较玉米粉进行洗涤（去除脂肪、可溶性糖）和不洗涤时其淀粉含量情况，测定结果如表1。

表1 洗涤与不洗涤条件下淀粉含量的测定结果

玉米种类 承德玉米1# 东北玉米1# 东北玉米2#

水分 (%) 13.8 13.1 12.9

称样量 (g) 2.008 2.018 2.007 2.006 2.001 2.006

消耗葡萄糖 的体积 (mL)

9.00 9.20 8.90 9.15 9.00 9.40

玉米淀粉 含量 (%) 63.6 61.9 64.3 62.6 63.8 60.9

折14%水时玉米淀粉含量 (%)

63.4 61.8 63.6 62.0 63.0 60.1

备注 * # * # * #

注：备注项不洗滤标注“*”，洗滤标注“#”

由表1可以看出，同一玉米样品不洗涤时，其淀粉含量比洗涤时高出1.6-2.9%，由此可以看出洗涤造成了淀粉的损失，致使测定结果偏低（标准中标注试样中脂肪含量很少时，可不用乙醚洗涤脂肪）。 2.3 玉米中还原糖含量的测定试验

玉米中还原糖含量测定结果如表2。

表2玉米中还原糖含量的测定结果

玉米种类 承德玉米1# 承德玉米2# 承德玉米（陈化粮）

东北玉米1# 承德胶质玉米 承德粉质玉米

称样量

(g) 2.005 2.000 2.000 2.006 2.006 2.006

消耗葡萄糖的体积

(mL)

9.60 9.65 9.80 9.60 10.10 9.80

还原糖含量

(%)

0.87 0.81 0.63 0.87 0.25 0.63

由表2可知，不同玉米所含的还原糖有所不同，含量范围在0.2~0.9%之间。因此，结合表2和表3，建议称取试样2份约2 g(精确至0.001g)分别于150 mL三角瓶中，一份测定淀粉含量，另一份测定玉米中可溶性糖含量。可溶性糖的测定是加100 mL水浸泡半小时，用滤纸过滤、洗涤并定容至250 mL，按GB/T5009.7

测定其还原糖m0。计算淀粉含量时可以减去可溶糖折淀粉的量，即玉米淀粉含量为X-0.9 m0，可以省掉洗滤步骤，提高结果准确性。 2.4 液化酶用量和液化所用时间的确定

GB/T 5514-2008中要求液化温度为55~60℃，液化时间为1 h，未注明是中温或高温淀粉酶。鉴于酒精行业所用均为耐高温淀粉酶，通过文献资料[10]可知，耐高温α-淀粉酶液化的最佳温度是75~80℃（玉米液化液的温度）。本实验采用耐高温α-淀粉酶，按照1.3.2对液化酶用量和液化时间进行优化，结果如表3、表4。

表3 不同液化时间试样上清液遇碘液的变色情况

加酶体积

(mL)

1 2 4 6

液化时间 (min)

5 淡蓝色 棕色 浅棕色 浅棕色

20 棕色 浅棕色 浅黄色 浅黄色

40 浅棕色 浅黄色 浅黄色 浅黄色

60 浅黄色 浅黄色 浅黄色 浅黄色

表4 不同液化时间试样中细渣遇碘液的变色情况

加酶体积 (mL)

1 2 4 6

液化时间 (min)

5 渣子蓝色 渣子蓝色

20 大部分渣子蓝色 小部分渣子蓝色

40

小部分渣子显蓝色 个别渣子显蓝色 渣子全为浅棕色 渣子全为浅黄色

60 渣子为棕黄色 渣子全为浅棕色 渣子全为浅黄色 渣子全为浅黄色

大部分渣子蓝色 小部分渣子蓝色 大部分渣子蓝色 个别渣子显蓝色

通过实验结果可以看出，糊化好的试样液化完全的标准应是液化液中的玉米细渣遇碘液变为浅黄色。根据上述实验加入4 mL淀粉酶稀释液能使2 g玉米粉糊化液60 min液化完全，为保证60 min试样彻底液化完全，酶液的加入量应该过量。因此，为保证更好的液化，本实验采用添加耐高温α-淀粉酶溶液6 mL，液化温度75~80℃，液化时间60 min。 2.5 液化试样过滤方式的探讨

GB/T 5514-2008中7.3.5步骤中过滤采用的是抽滤，本实验对采用抽滤与脱脂棉过滤定容液化试样中淀粉含量的测定进行了比较（此实验加盐酸溶液选择15 mL，水解1 h），结果如表5。脱脂棉过滤和抽滤方式下，淀粉含量差别不大，而脱脂棉过滤操作更简单，因此，建议采用脱脂棉过滤。

表5 不同抽滤方式液化试样中淀粉含量的比较

玉米种类 承德玉米1# 承德玉米2# 承德玉米3#

水分(%) 12.4 12.6 11.6

称样量(g) 2.008 2.008 2.009 2.009 2.026 2.026

消耗葡萄糖的体积(mL)

8.85 8.88 8.70 8.65 8.65 8.60

淀粉含量(%) 64.6 64.4 65.7 66.0 65.6 65.9

折14%水时玉米淀粉含量 (%)

63.4 63.2 64.6 64.9 63.9 64.1

备注 a b a b a b

注：备注中脱脂棉过滤标注为“a”，抽滤标注为“b”

2.6 水浴温度的确定

本实验分别采用水浴锅内水微沸状态和全部沸腾时，对玉米淀粉含量进行测定并比较（玉米样水分11.6%），结果如表6。

表6 微沸和全沸条件下淀粉含量的测定结果

玉米产地 承德玉米3#

承德玉米3#

水浴状态 微沸 全沸

称样量(g) 2.007 2.009

消耗葡萄糖的体积 (mL)

9.02 8.71

玉米淀粉含量 (%)

63.4 65.7

折14%水时玉米淀粉含量 (%)

61.7 63.9

注：此实验加盐酸溶液选择15 mL，水解1 h。

通过实验结果可以看出，水浴温度对玉米淀粉含量影响很大，水浴锅内水全部沸腾时，淀粉含量提高2%左右，水解更彻底。 2.7 加酸量的确定

按标准中7.3.6步骤，本实验采用水分为10.8%的东北玉米3#样（1等），分别添加盐酸溶液5 mL、10 mL，水解1 h、1.5 h、2 h和加盐酸溶液15 mL水解1 h进行不同加酸量和不同水解时间的实验，结果如表7。

表7 不同加酸量和水解时间对玉米淀粉含量的影响

玉米样品 东北玉米3# 东北玉米3# 东北玉米3# 东北玉米3# 东北玉米3# 东北玉米3# 东北玉米3#

称样量(g) 2.004 2.004 2.007 2.004 2.008 2.007 2.014

加酸量(mL) 5 5 5 10 10 10 15

水解时间(h) 1 1.5 2 1 1.5 2 1

消耗葡萄糖的体积 (mL)

9.12 8.69 8.64 8.69 8.55 8.45 8.41

玉米淀粉含量(%) 62.8 66.0 66.3 66.0 66.9 67.8 67.9

折14%水时玉米淀粉含量 (%)

60.5 63.8 63.9 63.8 64.5 65.4 65.5

由表7可以看出，当盐酸溶液的加入量为5 mL时，其淀粉含量测定值均比较

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