蜂蜜中掺入果脯糖浆的检测方法

蜂蜜中掺入果脯糖浆的检测方法 糖浆, 果脯, 蜂蜜, 淀粉, 活性炭

本方法是本人跟据几种不同版本的资料结合自己的经验整理而成的，提供给需要的朋友

作个参考 TLC检测方法

原理：样品中的高分子糖，经活性炭—硅藻土柱的富集、浓缩，再用薄层色谱法分离、检测，经与掺有一定含量高果糖淀粉糖浆的纯蜂蜜比较，来判断蜂蜜中高果糖淀粉糖浆的存在与否。它是利用蜂蜜与异果化糖中的糖成分的不同之原理形成的方法，异果化糖中含有由淀粉原料转化的高分子糖类，而蜂蜜中不存在。本方法判定为阳性的并不是蜂蜜本身。

假如残留有喂养中使用过的糖浆等高分子糖，本方法的结果可能呈阳性。

1. 试剂与材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.1 无水乙醇 1.2 正丁醇 1.3 醋酸 1.4 丙酮 1.5 磷酸

1.6 粒状/粉末状活性炭 1.7 硅藻土, 载体545

1.8 苯胺 1.9 二苯胺盐酸盐

1.10乙醇溶液(7+93)：移取35ml无水乙醇至500ml试剂瓶中,加入465ml水,混匀。 1.11乙醇溶液(1+3)：移取125ml无水乙醇至500ml试剂瓶中,加入375ml水,混匀。 1.12乙醇溶液(1+1)：移取250ml无水乙醇至500ml试剂瓶中,加入250ml水,混匀。

1.13展开剂：正丁醇+醋酸+蒸馏水(2+1+1)

1.14显色剂：称取1g二苯胺盐酸盐,加入50.0ml丙酮,再加入1ml苯胺,混和搅拌,同时加入5ml磷酸,温热完全溶解后使用，随用随配。或者放入冰箱中冷冻保存，用时提前30分

钟取出升温，同时应避光。（注1）

1.15薄层层析板：硅胶G板,膜厚0.20-0.25mm、100mm×200mm。用前在110℃活化1h后，

置于干燥器中冷至室温，备用。

1.16玻璃棉或脱脂棉 1.17蒸馏水。 2. 仪器与设备:

2.1层析柱：带旋塞的玻璃柱,长300-400㎜,内径20-22㎜,上端有19/24的接口。

2.2恒温干燥箱。

2.3旋转蒸发器,配真空冷却系统。

2.4玻璃喷雾器。 2.5薄层色谱展开槽。 2.6微量注射器：10ul。 2.7分析天平：感量0.0001g。

2.8吹风机。

2.9干燥器：盛有硅胶干燥剂。

2.10收集瓶：500ml平底烧瓶、250ml茄型瓶和30ml鸡心瓶。 2.11 漏斗：400ml(下端带有19/24大小的接口的直漏斗)。

2.12 活性炭-硅藻土柱：玻璃层析柱底部加少量水，再加入少量玻璃棉或者脱脂棉（注2），关闭活塞后加入蒸馏水到玻璃管中部，然后放水除去玻璃棉中的气泡至水量10ml时关闭活栓。称取2.0g硅藻土于小烧杯中，加入少量水搅拌后移入层析柱，打开活栓使其沉降形成约1cm厚的硅藻土层，等水柱降至1cm~1.5cm时，把事先称取好的活性炭和硅藻土混合物(1+1)12g，（注3）用150ml水溶解、搅拌并洗涤后，倾入柱中。打开活栓，在真空抽气泵的吸引下使活性炭和硅藻土混合物沉降。当水面到达柱面1cm时关掉活塞，再次注入2.0g用水混好的硅藻土，打开活栓使其沉降形成1㎝厚的硅藻土层（注4）。在玻璃管上端放置一个400ml的直漏斗，用500ml水以5ml/min速度预洗活性炭一硅藻土柱，液面到达柱上1cm时关掉活栓，备用（注5）。注意在使用前填装，如暂时不用，可用50%乙醇溶液200ml

浸泡，用前再用250ml蒸馏水预洗。（注6）

3. 分析步骤: 3.1 样品前处理

称取1g蜂蜜样品精确到1mg,置于50ml烧杯中，加10ml水溶解后，缓慢加到活性炭-硅藻土中（注7），打开活栓，使试料溶液通过柱子。分两次各用5ml水冲洗烧杯，冲洗液也加入柱中，液面下降到柱面上端1cm时关闭活栓，量取7%乙醇溶液300ml加到柱中，洗涤柱子，弃掉洗脱液（注8），再加入25%乙醇溶液100ml洗涤，弃掉洗脱液（注9），然后再加入50%乙醇溶液100ml,在同样条件下洗脱（注10），洗脱液收集在200ml的茄形瓶中。用旋转蒸发器在75℃水浴中旋转蒸干，在茄形瓶中加入50%乙醇溶液2~5ml洗涤茄形瓶，使溶出物完全溶于乙醇，并将洗涤液移入30ml鸡心瓶中，旋转蒸发。再重复上述操作两次。等鸡心瓶完全蒸干后，在65℃条件下，减压干燥30min。干燥后把鸡心瓶取出，加0.1ml

的水洗涤至溶出物完全溶解，作为薄层层析样液。

3.2 薄层层析

用10微升微量注射器在距离薄层板下端2.0 cm的位置，点上2.0ul样液（注11）,水平间隔1cm，左右边各1.5cm。点上同样量经过同样处理的纯蜂蜜（阴性对照样）和含有5%高果糖淀粉糖浆的蜂蜜标准液（阳性对照样）作为对照。把薄层板放入展开槽中（注12），按倾斜上行法展开，当展开剂前沿到达薄层板顶端时（注13），从展开槽中取出薄层板，用吹风机把展开剂完全吹散后，把显色剂均匀喷雾在薄层板上，等显色剂完全蒸发后（约30

分钟后再吹干），放入94℃的恒温干燥箱中干燥11min，使之显色。

3.3实验操作方法成立

阴性对照中，在Rf值0.35以上范围内，仅能辨认2-4个较大的带灰色的青色斑点，

或待茶色的青色斑点；

阳性对照中，在Rf值0.35以下范围内，出现连续的青色条状、或连续的斑点群； 如确认阴性对照为阴性，阳性对照为阳性，则判断该实验成立；如阴性对照、阳性对

照得出非上述结果时，则该实验不成立，应重新测试。

3.4结果判定

纯蜂蜜只在Rf值0.35以上的区域有2-3个蓝色中带灰色或咖啡色的斑点,而高果糖淀粉糖

浆或混有这种糖浆的蜂蜜却从原点开始呈现蓝色带状斑点群。

供试品点样展开后，与阳性对照品进行结果比较，从原点起至Rf值0.35附近，如不能明

确辨认连续的青色条状或连续的斑点群时，为阴性；

供试品点样展开后，与阳性对照品进行结果比较，从原点起至Rf值0.35附近，如可明确辨认出连续的青色条状或连续的斑点群的颜色有同等以上的浓度时，应进行以下的确认实

验，作出最终判断。 3.5确证实验:

进行样品前处理时，用7%乙醇溶液300ml冲洗活性炭一硅藻土柱后，再用25%乙醇溶液100ml冲洗活性炭——硅藻土柱，最后用50%乙醇溶液100ml洗脱溶出后，浓缩减压干燥。溶出物

加水0.1ml溶解后，点样2ul。

与阳性对照结果比较，如果从原点起至Rf值0.35附近，如可明确辨认出连续的青色条状或连续的斑点群的颜色有同等以上的浓度时，判定为阳性。（注13）（另一方法：如果在原点和Rf值0.35之间仍然出现蓝色带状斑点群，就可以判定为阳性，否则为阴性。）

4. 结果表述用阳性和阴性表示

附注：

1）显色剂配制时应采取防护措施，戴手套、并在通风厨中操作；

2）加脱脂棉或玻璃棉是为避免硅藻土被吸入茄形瓶，脱脂棉应塞紧，玻璃棉应塞均匀

平整；

3）活性炭、硅藻土应提前按1：1比例旋转混合好；

4）填充活性炭柱时应使各层分界明显；

5）活性炭柱中的液体不能流干，应在柱上方1cm处时先关闭活拴，加好试剂后再打开； 6）充填时应注意除去气泡，充填不可过于紧密，在负压状态下通过活性炭柱的流速应

控制在5ml/min程度，不能减压过度；

7）蜂蜜样品溶液加入活性炭柱时，应尽量避免硅藻土表面受到冲击，保持稳定；

8）除去蜂蜜中的小分子成分；

9）除去干扰判断的异果糖中的小分子低聚糖类；流速控制在1D/s.

10）当溶出液（主要为大分子的低聚糖类和多糖类）回收到200ml茄形瓶中时，应考虑活性炭柱中尚残留有一定的液体，可加入适量的50%酒精溶液，以不足液体的规定量，或者在开始时多加50%乙醇溶液，或者用真空泵抽干柱中的液体，以保证溶出液足量。 11）点样时应当将2ul样液分5~7次点下，每次点下后用电吹风吹干再点，把点样点的大小控制在5mm以内，点样点应完全干燥后再放入展开剂中；点样时应避免针尖划破硅胶

板，不能用手接触板面，以免显色不正。

12）展开剂随用随配，在使用前15分钟倒入展开槽中，使展开剂的蒸汽完全充满展开槽，

呈饱和状态；

13）在展开剂中展开的时间以展开剂前沿到达板的上沿为好，不能时间太久。 14）甘露蜜即使是纯蜂蜜，有时也会看到青色条状、连续的斑点群，如不进行确认实验就判断为阳性，是很容易出错的；正如甘露蜜，通过本操作可以除去妨碍判断的低聚糖类，但通过本操作异构糖丢失的主要为小分子的低聚糖类，大分子的低聚糖类和多糖类仍

然存在；

据介绍，蜂蜜行业内一种特殊的办法鉴别蜂蜜是否掺有果葡糖浆，取一小勺蜂蜜加4倍的水，稀释均匀后再缓慢加入95%酒精，出现白色絮状物表明掺有果葡糖浆

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