蛋白质的分离与提纯

分离工程 期末论文

蛋白质的分离与提纯

Separation and Purification of protein

学 院： 化学工程学院 专业班级： 化学工程与工艺 化工081 学生姓名： 闵 亚 娇 学 号： 050811115 指导教师： 戴卫东（副教授）

2011年6月

中文摘要

蛋白质的分离与提纯

摘 要：蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

关键词：蛋白质 分离 纯化

外文摘要

Separation and Purification of protein

Abstract: Protein in tissues or cells in general are complex mixture of form existence, each type of cell contains thousands of different proteins. Protein separation and purification of work is an arduous and onerous task, so far, there's not a single or a ready-made method can take any kind of protein extracted from complex mixture out, but to any kind of protein may select a set of proper purification procedures to obtain high purity of the products.

Keywords: protein separation Purification

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1 蛋白质分离纯化概论

蛋白质具有重要的生理作用和经济价值，进行蛋白的高效率和高灵敏度的分离和分析研究是现代药物分析、分析化学及生命科学研究的热点领域之一。主要从蛋白质分离分析的现代色谱分离方法、毛细管电泳法、微流控芯片技术以及联用技术等方面进行概述。

1.1 现代色谱分离技术

(1)高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱是溶质在固定相和流动相之问进行的一种连续多次的交换过程，它借溶质在两相问分配系数、亲合力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进行分离。反相高效液相色谱(RPLC)是目HPLC分离中最常用的一种模式，RPLC的主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和析，其优点是分辨率高、重复性好。即使被分析的蛋白质发生了变性，RPLC也能够给出该蛋白质的结构特征及疏水性等信息，并将其精确地与其他蛋白质相区分。

(2)离子交换色谱(IEC)

蛋白质分子和离子交换剂之间的相互作用主要是静电作用，蛋白质分子在一定离子强度和pH值条件下所带电荷不同，介质表面的可交换离子和与其带同电荷的蛋白质分子发生交换，利用蛋白质分子交换能力的差别使蛋白质分子混合物得以分离。

1.2 微流控芯片技术

微流控芯片技术是采用微加工技术在芯片表面形成微流路，将样品的采集、加工、检测等功能单元集成在数平方厘米的支持物表面，以色谱泵或电场为驱动力，连续完成多步反应或分离的一种技术。具有分析速度快、可集成化、自动化以及便于携带等特点。微流控芯片毛细管电泳技术在蛋白质的分离分析方面有较广泛的应用，该技术将常规的毛细管电泳操作在芯片上进行，利用玻璃、石英或各种聚合物材料加工微米级通道，以高压直流电场为驱动力，对样品进行进样、分离及检测。芯片毛细管电泳系统具备分离时间短、分离效率高、系统体积小且易实现不同操作单元的集成等优点。

1.3 结语

蛋白质的分离分析技术无论在分子生物学领域，还是在生物化学领域都占 有很重要的地位， 每种分离分析方法都有其自身的优点和缺陷，单靠一种技术已经不能完全满足生产和实验的需要，蛋白质的分离分析技术的发展趋势曰益转向多种技术的联合应用。

2 膜分离在蛋白质分离纯化中的应用

2.1膜分离技术

2.1.1 膜分离类型

以压力差为推动力的液化膜分离过程通常根据分离对象可分为：微滤(MF)、

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超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)四种类型。微滤用于截留直径为0．02 m 到l0 m大小的粒子，用于发酵液除菌、澄清及细胞收集等。超滤可分离分子量从上千到数百万的可溶性大分子物质，对应孔径约2～20nm。超滤膜规格通常不是以孔径大小作为标准，而是用截留分子量作为指标。纳滤集浓缩与脱盐为一体，膜平均孔径约1—2nm，用于分离溶液中分子量为200～1000Da的小分子物质，如抗生素、氨基酸等。反渗透膜因其致密的分离结构，对离子有效截留，主要用于海水脱盐，纯水制造以及小分子产品浓缩等。

2.1.2膜分离性能

膜分离性能由截留率和透过通量来表征。透过通量是指在一定工作压力和温下，单位面积膜在单位时间内的透过液量。这些参数的优化对实际膜分离过程十分重要，一般是通过对一定的待分离体系进行小试，测定不同条件下的透过通量和截留率，选择较高的透过通量和满意截留率时的参数。

2.2膜分离在蛋白质分离纯化中的应用

蛋白质为两性电解质，每一分子上带有多个正负电荷，具有等电点。其相对分子量约l0 ～l0 Da左右，采用膜分离技术分离蛋白质既可以基于蛋白质问分子量的差异，也可基于其带电性不同。

2．1 乳清蛋白

乳清主要成分为乳清蛋白质、乳糖和灰分等。在乳清蛋白质中， 一乳清蛋白( 一LA)、13一乳球蛋白(13一LG)和牛血清蛋白(BSA)是弱酸性蛋白质，等电点分别为4．8、5．3和5．1，分子量分别为14．2kDa、18．6kDa和67kDa。而免疫球蛋白(IgG)的分子量大于150kDa，有较高的等电点5．5～8．3。配糖巨肽(GMP)具有强酸性和亲水性，分子量为7kDa。膜分离技术可用于乳清蛋白浓缩物(WPC)的生产和乳清蛋白的分离。

2．2 血清白蛋白

在Cohn et al醇沉法制备人血清白蛋白(分子量Mw=67kDa)最后一步，馏分IV上层液中含有浓度15g／I 的向蛋白，乙醇浓度40％ (v／v)。Jaffin ‘等采用浓缩一渗滤一浓缩组合过程使乙醇浓度小于0．1g／L，白蛋白浓缩到2lOg／L，以lu]收白蛋白。采用超滤膜盒(MWCO 1OkDa，聚砜)研究_r循环流速、白蛋白浓度、乙醇浓度对透过通量的影响，并对过程进行优化来确定起始乙醇浓度和渗滤时白蛋白浓度，以使标准过程时间(单位膜面积上生产1 kg白蛋白所需时间)最小。由于乙醇浓度较高时，不仅透过通量降低，而且会损坏有机膜，所以也可采用耐乙醇的ZrO!无机膜(MWCO 1OkDa)处理白蛋白一乙醇溶液.

2．3 蛋清蛋白

蛋清中，主要成分为卵清蛋白(Mw=45kDa，等电点pI=4．7，含量54％ ～57％ )，伴清蛋白(Mw=80kDa，pI=6．5～6．8．含量12％ ～15％ )和溶菌酶(Mw=14．7kDa，pI=1 1．0．含量3％～ 4％ )。Ehsani ?等研究了pH值、盐浓度和膜的改性对分离性能的影响。由于静电排斥作用，采用紫外改性超滤膜(MWCO 50kDa，聚砜)，在p1t4．8和很低盐浓度时透过液几乎为纯卵清蛋白。提高盐浓度，静电斥力降低会引起溶菌酶透过率增大，但膜对大分子伴清蛋白的截留率仍

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很高。因而，在pH4、8和很低盐浓度下进行渗滤操作，得到富集卵清蛋白的透过液；再在pH4．8和高盐浓度下渗滤操作，得到富集溶菌酶的透过液和富集伴清蛋白的截留液

2.4 展望

膜分离技术在蛋白质的分离纯化方面具有非常广阔的应用前景，并向工业化发展。当然，它也存在一定的问题，如在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低，故又必须采用与_T艺相适应的膜面清洗方法；而且单采用膜分离技术效果有限，因此有时需将膜分离_r艺与其他分离工艺组合起来应用。但是可以预见，随着膜分离技术的进一步发展，其势必将取代耶些耗能大、费用高、处理不彻底、周期长、易造成环境污染的传统单元操作，如沉淀、离心、过滤等，并使产品成本降低，质量提高。

3色谱法在蛋白质分离纯化中的应用

色谱法分离效率高，选择性好，在分离纯化生物大分子的过程中是不可缺少的方法。其应用主要以液相色谱法为主。本文对常用的凝胶过滤色谱、离子交换层析色谱和疏水相作用层析色谱的基本原理及其在蛋白质分离中的操作条件和纯化策略进行阐述，为蛋白质的分离提纯工作提供参考。

3.1 基本原理

3.1.1 凝胶色谱(Gel Filtration Chromatography。GFC)

凝胶色谱也叫凝胶过滤和分子筛层析，是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。当样品加载于凝胶柱后，较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部，而与流动相一起流出层析柱，以外水体积(Vo)洗脱下来，小分子蛋白可完全渗入凝胶内部，其洗脱体积(Ve)是外水体积和内水体积(Vi)之和，中等分子的蛋白将在固定相和流动相中产生不同的分配，以分配系数Kd表示其被排阻的程度。Kd只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，Kd与Ve、v。和Vi的关系如下：Kd=(Ve—v0)／Vi

通常情况下0l时，说明凝胶对组分有吸附作用。在实践中，Vi不易正确测定，常运用有效分配系数Kav代替Kd，即：Kay=(Ve—Vo)／(Vt—V0)

Vt为柱床体积，Kav是把整个凝胶相作为固定相，洗脱剂作为流动相。 用于生物大分子分离的传统GFC填料主要是多糖聚合物软胶，必须在低温下使用，目前在一定程度上被微粒型交联的亲水凝胶(如交联琼脂糖Superose 6和12)，乙烯共聚物(如TSK—Gel PW)和亲水性键合硅胶(如Zoubax GF250和450)所代替。

3.1.2 离子交换色谱法(Ion Exchang Chromatography，IEC)

生物大分子和离子交换剂之间的相互作用主要是静电作用，导致介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子发生交换。离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂本身带碱性基团，在其pK以下荷正电，如果蛋白质分子在高于其等电点的p范围内稳定，带负电荷，则可与阴离子交换剂反

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应；阳离子交换剂本身带酸性基团，在其pK以上荷负电，如果蛋白质分子在低于其等电点的pH围内稳定，带正电荷，则可与阳离子交换剂反应。由于离子交换剂所连接的基团不同，每类又分为强和弱离子交换剂。

传统的离子交换树脂不适用于分离蛋白质等大分子物质，主要原因是它们的交联度较大，因而空隙小，不能允许大分子韵进人，而且电荷密度较高，结合比较牢固，使吸附的蛋白质等生物大分子易变性。分离生物大分子所用的离子交换介质其基体主要是亲水性共聚物。用于生物大分子分离的商品离子交换剂，以一价离子测定的交换容量差别不大，故一般更愿意用“蛋白质结合量”来表征。

3.1.3疏水相互作用色谱(Hydrophobic Intemaction Chromatography，HIC)

疏水作用色谱的原理与反向色谱相同，区别在于HIC填料表面疏水性没有反向色谱(RPC)强。所用填料同样分有机聚合物和大孔硅胶键合相两大类。疏水配基一般是低密度分布在填料表面上的苯基、戊基、丁基、丙基、羟丙基、乙基或甲基。和普通反向液相色谱相比，这种表面带低密度疏水基团的填料对蛋白质的回收率高，蛋白质变性可能性小。由于流动相中不使用有机溶剂，也有利于蛋白质保持固有的活性。HIC对蛋白质有较高的吸附容量，由于高盐可增加疏水作用，因而样品中应含有低于蛋白质盐析点浓度的盐离子，一般情况下，1mol／L的硫酸铵或2mol／L的NaCI就可使可溶性很好的亲水蛋白质与填料表面的疏水基团相互作用。流动相一般为pH6—8的盐水溶液，如(NH )2SO 。HIC色谱洗脱时盐浓度的变化与离子交换层析相反，采用盐离子浓度逐渐降低的方式解吸附，作降浓度淋洗，在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度降低时，疏水作用减弱，不同疏水性的蛋白质依次被洗脱下来，疏水性弱的在先，强的在后。为了减弱蛋白质与填料间的相互作用，可通过改变pH值，降低温度以及利用极性弱化剂，促溶离子，非离子去垢剂或变性剂， 视处理系统而决定。

3.2 纯化策略

在蛋白质的分离纯化中，一条好路线要求纯化步骤尽可能简单，操作的成本低廉，同时有具有高的活性回收率和高纯度。选择何种纯化路线不仅与各种提取方法的原理和应用范围有关，还取决于目标蛋白的特征和样品蛋白溶液的复杂性。

3.2.1 凝胶色谱

凝胶过滤由于上样量受到柱床体积限制，常用在纯化路线的最后一步，此时的样品蛋白溶液杂质量很低了，经过凝胶过滤就可纯化。如阎家麒等 提取酶时，最后两步用的Sephadex G一100和Sephacryl S-200，在一种碱性蛋白酶 的提取过程中最后一步也是凝胶过滤，即Toyopeal HW一50F。在蛇毒 、地鳖虫 、枯草芽孢杆菌发酵液中提取酶时的最后一步用的是Sephadex G一75，提取过程中，最后一步是Sephadex G-50。

当然，根据样品蛋白溶液的特征，也有把凝胶过滤放在提纯最初步骤中。 Sephadex G一50以下型号的胶体都可用于脱盐、去除微量杂质和替换缓冲液，可用于提纯中的任何需由于离子交换剂的交换容量大，流速较快，最适用于早期纯化阶段” 。一般情况下，粗胶粒的离子交换剂用在提纯的前面步骤中，

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高分辨率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中。如Kim，HK．eta1．分离一种来自于枯草芽孢杆菌的蛋白时，首先将样品经过DEAE—cellulose凝胶，然后再经过Mono Q。Kim，JH．eta1．在分离酶时也是首先经过DEAE—cellulose，再进行MonoS层析。

运用IEC分离样品时，根据目标蛋白和溶液的复杂性，找到适合的操作条件是很重要的。有人曾只用离子交换这一种层析法就分离到了纯品。例如Chiou，sh．eta1．分离酶时，以碳酸氢铵(pH7．5)为起始缓冲液，运用TSK—DEAE 650(M)离子交换剂，经过三步不同梯度的洗脱，最后得到纯品。

3.2.2 IEC

高盐状况下有利于疏水相互作用，因此HIC常用于硫酸铵沉淀、IEC和亲和层析等操作之后。进行HIC层析的样品不需要透析、凝胶过滤等方式脱盐，特别适合于离子强度较高的状态。

3.2.3 色谱法的组合

在对目标蛋白还不了解的情况下，应根据各种层析法的基本原理和应用情况，设计纯化程序。很多情况下，采取三阶段纯化策略：第一阶段的目标是捕获目标蛋白质(capture)，采取分离、浓缩方法，使样品转成小体积的操作；第二阶段为中间提纯阶段(intermediate purification)，在该阶段应除去大量杂质；第三阶段为最终提纯阶段， 目的是获得最后的高纯度的目标蛋白。在实际工作中，我们发现文献报道的分离过程中重复使用一种分离介质的操作并不少见。事实上，完全的重复是不被提倡的，造成这种现象的原因是没有优化好操作条件。 ’在层析过程中，不论哪步操作，一定要记录纯化情况，列出纯化表，计算分离前后的比活力情况。纯化倍数低于两倍的操作通常是被舍弃的。在实验中也会出现活性回收率大于100％的情况，这说明原来的样品中存在抑制目标蛋白活性的物质，不要因此而怀疑操作步骤有问题。纯化表所显示的信息将决定实验流程的进一步设计和改进。

4 结论

在实际工作中，很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化，往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法，要求产品纯度和总回收率越高越好，但实际上两者难以兼顾，因此，考虑分离提纯的条件和方法时，不得不在两者之间作适当的选择；一般情况下，科研上更多地选择前者，工业生产上更多地选择后者。因此，每当需要提纯某种蛋白质时，先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质，以便选最佳的分离纯化方法，从而得到理想的效果。今后，蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究，同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术，两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献

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