产腈水合酶优良菌种的选育及其在生产中的应用研究

本文通过出发菌株Nocardia.sp.163摇瓶发酵96h后分别向发酵液中间歇加入丙烯腈和催化生成高浓度丙烯酰胺分别对菌丝的毒害和耐受作用以及发酵液中残存菌丝涂布平板置于18℃低温培养成单菌落,筛选到一株比出发菌株Nocardia.sp.163相对腈水合酶酶活提高了76%的24号优良菌株。该菌株在催化腈水合生成丙烯酰胺的反应中,产酰胺酶酶活性比出发菌株降低了近50%;丙烯酰胺水溶液的电导率比

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甄而 c e no nv i e l l c og Ioao Hr h lyn tn a T d

研究报告

产腈水合酶优良菌种的选育及其在生产中的应用研究钟山金黎常宏胡娟潘慧敏廖敏 (江西昌九农科化工有限公司江西南昌 3 0 ) 3 01 2摘要：文通过出发茵株 N c ri.p 1 3瓶发酵 9 h本 oada s .摇 6 6后分别向发酵液中间歇加入丙烯腈和催化生成高浓度丙烯酰胺分别对茸兰的毒 害和耐受作用以及发酵液中残存茵丝涂布平板置于1 8℃低温培养成单茵落，筛选到一株比出发茵株N cr i.p 1 3 oadas .6相对腈水合酶酶活提高了7% 2号优良茵株。茵株在催化腈水合生成丙烯酰胺的反应中，酰胺酶酶活性此出发茵株降低了近 5% 6的 4该产 0丙蚌蔬胺水溶液的电导率比出发茵株降低了4%,应次数提高了3 3次，烯酰胺放料浓度提高了5 9%。 5反 .3丙 .3 关键词：卡氏茵腈水合晦丙烯酰胺耐受菌种选育诺中图分类号： Q9 5 T 2文献标识码： A文章编号： 6 4 9 X( 0 1O () 0 6 3 l 7 -0 8 Z 1 ) 4b一0 0 -0

腈水合酶(irl h d aa e NHa e是 n tie y r ts, s)

耍通过蒸气浓缩及结晶才能得到 9%的含 Na 1 0 Mg O 7 . 0 5酵母缦膏 3O’ 8 C1 .; S .H2 .{ 0, .1 1 2. . . 2发酵培养基 ( L) g/

生提 2 0生物催化珐生产丙烯酰胺 (c ya d, a r l mie AM )量，产中得到的结果表明，高丙烯酰胺琼脂， 0.。所的催化剂，能催化丙烯腈 (cyo i i, N)溶液百分比浓度可减少蒸气用量。以提 arlnt l A re

水合生成丙烯酰胺。酶的活性大小是微该生物法生产丙烯酰胺的关键技术。烯酰丙

高腈水合酶菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意义。同时，烯酰胺水溶液中电导率的高丙

葡萄糖2 .; HP 4 .0KHP .. 1 0OK2 O 5 I 2oo5 0 0Mg O 7 OO 5; S . H, .0谷氨酸 lO, 7 0酵母浸。脲 .l膏50; o 1.H, 1mg L￣ H值7 5。 . C

G,6 O,0/调p .0以

胺( AM)精细化工的重要产品之一，合低直接影响丙烯酰胺生产的效益。是是成水溶性线型高分子聚合物一一聚丙烯酰

上培养基成分除酵母浸膏和琼脂是生化试剂外，余皆为分析纯。其1 2方法 .

胺( PAM)列产品的唯一单体，系 PAM厂泛 1材料与方法 .用于石油、质、金、纸、织、处理 1 1材料地冶造纺水等经济建设的各个领域，号称“百业助剂”。1 1 1产腈水合酶的菌 ..

1 2 1菌体发酵培养 ..将N c r i.p 13 o ada s .6斜面菌种菌块接于盛有 3 mL 0发酵培养基的 l0摇瓶中进行发 5 mL酵培养，摇床转速2 0/ n温度为 2℃。 4 r mi, 8培养9 h 6后得到具有腈水合酶活性的发酵液。1 2 2提高腈水合酶产生菌对底物丙 ..烯酰胺浓度耐受性的方法

在工业生产中，丙烯酰胺达到一定浓度当后，腈水合酶的催化速率显著降低，烯酰丙 _胺浓度很难有进一步提高，浓度通常为终 3 0 0 g L[。得到丙烯酰胺晶体， 0~4 0/ 要还

No a d a.p.6为本实验室保藏。 c r i s 1 3, 1 1 2培养基 ..1 I 2 I斜面和平板培养基 ( L) ... g/

葡萄糖1 .; O4.; 0 0 K2 HP 0 5 KH2 O4 5; P 0.O

将接种N c r i .p 1 3 o a d a s . 6斜面菌种的摇瓶培养9 h, 6后分别在培养9 h 9 h 1 0 6、 8、 0 h、12 1 4 l 6 1 8 1 O l 2和 l 4 0 h、 0 h、 0 h、 0 h、 h、 h h 1 1 1

分别向摇瓶发酵液中加入含量9%定量丙 9烯腈2 mL继续摇瓶培养，菌体产生腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺作用 2 h后，分

别在培养 9 h、 0 h、 0 h、 0 h、 0 h、 8 l0 l2 l4 l6

18、 lh l2 14￣ l6分别从摇瓶 0 h lO、 1h、1h U 1h中取出2发酵液，中l mL其 mL为分别检测发

酵液中丙烯酰胺浓度和腈水合酶活性， 另1 mL发酵液稀释后涂布在固体平板上，置于 2℃恒温培养9 h分别进行平板菌落计 8 6数和残存百

分率。同时摇瓶9 h在未加丙烯 6腈前取发酵液2 mL,别进行平板菌落计分

数和丙烯酰胺浓度及腈水合酶活性检测，图 1水合反应实验装置图 表 1不同丙烯酰胺浓度下菌体存活率和腈水合酶活性变化的检测结果

序号I2 3 4

摇瓶培养时间( h加入丙烯腈的mL )数丙烯酰胺浓度A%)发酵液中的活菌数( mL M( 个/ )9 69 6 9 8 1 0 0

存活率( 腈水合酶活性(/ g%)万u ) m100 0 9 4 5 5

OCK) (2 2 2

0267 53 3

10 0 l94一 0 l 55 0 .×1。

79 875 6 7 0 5

5 6 78

l2 O l8 O 10 11 2 1

2 2 22

8O O l 7 06 1 3331 O 6O

1O 0 ×l 1 0× 0 . l 53 0 . 121 O . 1

l O 0 0l 0,0 3 050.0 0 2l

7l O 60 8 60 461 0

91 0

14 1l6 l

2

l 7 862l3 5

0O

0O

5 0 45 5 2

6

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