酵母双杂交实验

酵母双杂交相关实验方法

一、 酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、 酵母质粒提取试剂

Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、 操作步骤：

(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃ 水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。 (10) 12000rpm离心15min。

(11) 将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶 37℃ 放置30min。 (12) 取上清，加入等体积的异丙醇。 (13) 4℃静置10min，1小时以上或过夜。 (14) 4℃10000rpm 离心5min。

(15) 弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。

二、 小规模酵母转化

1、 酵母转化试剂：

转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。

(1) M 醋酸锂（Lithium Acetate）

(2) 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度 50%（w/v） (3) PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）

800μl 50%PEG 100μl 10×TE 100μl 10×LiAc 1ml 总体积

(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配） 11ml 10×TE (5) 11ml 10×LiAc (6) 78ml ddH20 2、 操作步骤：

(1) 第一天下午3点 将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。 (2) 第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。 (3) 下午3:00收集菌体。 (4) 室温离心，700g，5min。

(5) 弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。 (6) 室温离心，700g，5min。

(7) 弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。 (8) 1.5ml/管 分装细胞。 (9) 12000rpm离心15-30s。

(10) 弃上清，每管加入600μl 1.1×TE/LiAc重悬细胞，100μl分装到1.5ml管中。 (11) 冰上准备转化混合物(与收集菌体同步进行)： PEG3350 (50%) 240μl LiAc (1.0M) 36μl Carrier DNA (10mg/ml) 10μl

质粒 2μl（总量大于100ng） ddH20 32μl 总体积 360μl

(12) 12000rpm离心15-30s除去1.5ml离心管中的液体，将转化混合物加入并与感受

态细胞剧烈混匀。

(13) 30℃温浴30min,每15min混合一次。

(14) 加入20μl DMSO,混合，然后在42℃水浴15min,每5min混合一次。 (15) 12000rpm离心30s，吸弃转化混合物。 (16) 加入1ml YPDA重悬细胞。 (17) 30℃温浴90min。 (18) 12000rpm离心15s

(19) 弃上清，用1ml NaCl(0.9%)重悬细胞。

(20) 稀释100-1000倍涂选择性平板（SD/-Trp或SD/-T-L，SD/-T－L－H等）。 (21) 37℃培养2-3天可见长出的菌落。

三、 β-半乳糖苷酶活性检测

1、 β-半乳糖苷酶活性检测试剂：

(1) Z buffer

Na2HPO4·12H2O 21.5g/L NaH2PO4·2H20 6.22g/L KCl 0.75g/L MgCl2.6H20 0.226g/L PH 7.0， 高压灭菌 (2) X-gal

溶解X-gal 于DMF中，浓度20mg/ml。 (3) Z buffer/X-gal 溶液

Z buffer 100ml β-巯基乙醇 0.27ml X-gal 1.67ml

2、 操作步骤：

(1) 用牙签挑取三缺大平板上长出的单菌落,划线到到新的二缺和三缺平板(SD

/-His/-Leu/-Trp)的平板上,同时每个板均涂上正负对照（正对照含pGADT7-ReT和pGBKT7-53质粒的酵母，负对照：pGADT7-ReT和pGBKT7-Lam质粒的酵母），30℃培养，2d。

(2) 三缺平板放于4℃保存，二缺用于X-gal显色。

(3) 用牙签将菌挑二缺平板上的菌体涂到滤纸上，液氮上漂浮30s，再37℃保温

1-2min，重复液氮30s

(4) 取出置于室温，晾干后将滤纸放于经底物溶液（Z buffer, 0.1% X-gal）润湿的普通

滤纸上，避光于37℃，温浴4h,观察滤纸颜色的变化并记录。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/wljg.html