表面等离子体共振技术在蛋白质_蛋白质相互作用研究中的应用

表面等离子体共振技术在蛋白质_蛋白质相互作用研究中的应用

第28卷第11期分析测试学报Vol128No111　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年11月FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)1344～1350综　述

表面等离子体共振技术在蛋白质-蛋白质

相互作用研究中的应用

杨　彦,戴　宗,邹小勇

(中山大学　化学与化学工程学院,广东　广州　510275)

摘　要:表面等离子共振(SPR)近年来迅速发展为用于分析生物分子相互作用的一项技术。该技术无需标

记、特异性强、灵敏度高、样品用量小,可实现在线连续实时检测。目前SPR已被广泛应用于免疫学、蛋白

质组学、药物筛选、细胞信号转导、受体/配体垂钓等领域。感器的基本原理和技术流程,综述了SPR在蛋白质-蛋白质相互作用动力学研究、、蛋白质突变和碎片分析、信号转导中的应用以及SPR。指

出SPR通过与光谱、电化学等多技术联用后,。

关键词:表面等离子体共振;蛋白质-;中图分类号:O629173;1::1004-4957(2009)11-1344-07

doi:101j111IProtein-ProteinInteractionsbySurfacePlasmonResonance

YANGYan,DAIZong,ZOUXiao2yong

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SunYat2senUniversity,Guangzhou　510275,China)

Abstract:Thetechniqueofsurfaceplasmonresonance(SPR)hasbeenrapidlydevelopedtoinvesti2gatetheinteractionsofbiomoleculesinrecentyearsduetoitsexceptionalcapabilitieswithrespectsto

label2free,specificity,sensitivity,sampledosage,real2timeandonlinedetection.

transduction,ligand/receptorfishingandsoon.Recently,theapplicationsofSPRhavebeenextendedtoimmunology,proteomic,drugscreening,cellularsignalInthispaper,theprincipleandtheexperimental

ItsapplicationondesignofbiosensorchiptechnologyofSPRbiosensorswasfirstlybrieflydescribed.

protein-proteininteraction,includingdynamicstudybymeasuringtheequilibriumbindingcon2stants,theassociation-dissociationrates,structure-functionstudy,mutationandfragmentanaly2

sis,andsignaltransductionwerereviewed.Inaddition,severalkeytechniquesofSPRtechnology

usedinprotein-proteininteractionstudy,includingsurfacemodificationofthesensorchip,meth2

odstoresistnon2specificadsorptionandsurfaceregeneration,werediscussed.Whencoupledwith

otherspectral,electrochemicaltechniques,SPRbiosensorscanextendthecapabilitytoobtainmore

specificinterfacingpropertiesduringtheprotein-proteininteractionprocess.

Keywords:surfaceplasmonresonance;protein-proteininteractions;review

细胞的代谢、信号传导以及基因表达调控等都与蛋白质的功能密切相关。蛋白质分子只有参与到蛋白质相互作用的网络中才能行使其功能。因此,研究蛋白质的相互作用,对于理解生物过程的分子机制、阐明疾病的分子基础、确定潜在的治疗靶点具有重要的理论意义。研究蛋白质相互作用常用的

[1][2][3]技术手段有:酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术、荧光共振能量转移技术(FRET)、等温滴定

[4][5][6][7]量热法(ITC)、圆二色分析(CD)、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)等。本课题

收稿日期:

基金项目:

第一作者:

通讯作者:2009-07-24;修回日期:2009-09-10国家自然科学基金资助项目(20805059);湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室开放基金资助项目(2008002)杨　彦(1987-),女,河南内乡人,硕士研究生戴　宗,Tel:020-84112901,E-mail:daizong@mail1sysu1edu1cn

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第11期杨　彦等:表面等离子体共振技术在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的应用1345

组利用电化学手段考察蛋白质在电极界面的电子传递机理,为研究蛋白质在生物体系中的电子转移机

[8-10]制及其结构和功能的关系提供有效的手段;利用免疫学方法通过研制电化学免疫传感器,实现对

相应抗原的灵敏检测;利用化学计量学方法预测蛋白质的结构和功能。虽然上述技术能够实现在天然状态下测定蛋白质的相互作用,并具有较高的通量、选择性和灵敏度,但仍存在假阳性、假阴性结果,难以实时、直接反映蛋白质相互作用信息,采用标记技术则容易影响蛋白质的活性。

[15][16]表面等离子共振(SPR)技术利用生物大分子间(抗体与抗原、酶与底物等)的特异性结合进

行分子识别,并通过光激励-分子识别-光输出-电输出的途径,完成分子相互作用的信息传递与检测。1902年,Wood首次发现表面等离子体共振现象;1971年Kretschmann建立Kretschmann结

[19]构,为SPR传感器奠定基础;1983年Liedberg等首次将SPR技术用于抗原抗体的相互作用研究;

[20]1990年瑞典的BIAcoreAB公司开发了第一台SPR生化分析仪器,使SPR传感技术的研究获得了迅

速的发展。SPR技术的特点主要有:样品无需标记,避免了荧光标记或放射性标记可能导致的被标记分子活性降低、选择性变差等缺点;可实现在线连续实时分析,,提供反应的动态过程,从而为研究反应机理提供新的空间;[21]白只需1～10μg,样品溶液量为0101～1mL;。[17][18][11-12][13-14]

1　,而当光波在一定条件下入射到金属,,在金属与介质的交界面产生表面等离子波(SPW)[22]

。

如图1所示,当光波从光密介质A向光疏介质B

传播时,若入射角大于临界角,则会在介质A、B的交

界面处发生全内反射。同时,电磁场会透射进入反射

面外侧的B介质一定深度(约为1个波长),且其振幅

在垂直于界面的Z方向随入射深度呈指数衰减,称为

倏逝波。倏逝波沿界面传播约半个波长,再返回光密

介质A中。若光疏介质很纯净,反射光的光能无衰减,

反之,光能会损失,反射率R将小于1。因此,当在2

个介质的界面上镀1层厚度小于100nm的金属薄膜

(Au或Ag),当光以某一特定角度或波长入射到金属

和介质的交界面时,倏逝波和表面等离子波将发生共

振,即表面等离子共振。此时,倏逝波的能量耦合进

入表面等离子波,反射光的强度和相位均发生剧烈变

[23]化,呈现衰减全反射现象,反射率出现最小值,该

点称为共振波长或共振角。由菲涅尔公式可知,反射

率是入射波长或入射角的函数。所以,SPR光谱可以

实时监测传感芯片表面液相折射率的变化,而这一变

[24]化和传感芯片表面所结合的生物分子的质量成正比,

用共振单位(Responseunit,RU)相对时间来表示。因

此,通过分析反应过程中各时刻的SPR光谱,可在非标记的情况下监测生物分子间的相互作用。

当进行分子间相互作用研究时,将其中一个反应物(称为配体)偶联在传感芯片上,将含有分析物(称为受体)的样品利用蠕动泵以恒定的流速通过传感芯片表面,若发生分子间的结合反应,会导致传感芯片表面分子浓度的变化。将SPR信号的改变以时间对RU连续作图,记录反应过程(见图2)。结合过程的不同阶段包括:持续地流入缓冲液(基线平衡);注入样品,金膜表面的配体与样品中的受体结合(结合过程);持续地流入缓冲液(解离过程);流入再生液(传感器表面再生);持续地流入缓冲液(基线平衡)。当反应结束后,用再生液洗脱结合在传感芯片上的反应物,可实现传感芯片的再生,进

[25]

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1346分析测试学报第28卷

行下一轮结合反应。

2　表面等离子体共振对蛋白质-蛋白质相互作用研究

211　主要研究方向

21111　蛋白质相互作用动力学研究　蛋白质在溶液中的三维空间结构与其生物功能的关系是在分子水平上理解生命现象的重要基础。许多生物过程是通过蛋白质构象变化完成的。一方面,蛋白质分子需要足够的刚性以识别特定的底物;另一方面,它也需要足够的局部柔性以诱导底物的结合。因此,

[26][27][28]研究蛋白质相互作用的动力学性质对了解蛋白质的折叠、分子识别、酶催化、结合或释放配

体分子[29]等生物过程起着十分重要的作用。

SPR技术能实时动态反映蛋白质相互作用的结合速率、解离速率,获得结合常数(Kb)、解离常数(Kd)等动力学信息[30]。假设蛋白分子A和B的亲和反应是简单的一级反应,即:A+B=AB。

在反应结合阶段,dR/dt=kαc(Rmax-R)-kdR。式中,R为时间t时的,c为样品的浓度,Rmax为配体表面的最大结合容量。在反应解离阶段,/dt=-kdR分别对上述两式进行非线性拟合,kd[31]得结合常数Kb(Kb=k在研究载脂蛋白E与脂蛋白α/kd)和解离常数KdKddα,E与高密度脂蛋白主要是蛋白质-。Karlsson等以SPR技术研究了HIV2124(mAb)的结合动力学,为抗体-抗原的相互作用动力学

[33]研究提供了通用模式。Margulies等用该方法研究了组织相容性复合体(MHC)与抗原递呈细胞递呈

的抗原(Ag),T细胞受体(TCR)与MHC/Ag,TCR与抗原相互作用的动力学常数,结果发现TCR与[32]MHC/Ag相互作用的亲和力低、半衰期短,说明短暂而低亲和力的相互作用即可激活T淋巴细胞。Robinson等[34]利用SPR技术测得了在翻译过程中起催化作用的氨酰tRNA合成酶复合物中心蛋白p43、p38、p18和表面蛋白间结合的动力学参数,及其它表面蛋白间作用的动力学参数,并平行地验证了复合物组装的顺序。

[35]SPR技术还可以在不同环境条件下(温度、离子强度、pH等)研究蛋白质分子间的相互作用。

在不同条件下获得的蛋白质相互作用的动力学和热力学常数可在不同层面上研究蛋白质作用机理。如在不同离子强度下测定蛋白质的动力学常数,可以研究静电作用在蛋白质相互作用中的影响;在不同温度下测定结合速率和亲和力则能提供热力学信息。根据VanπtHoff方程,可获得反应的活化能等Baerga[37][36]。利用SPR技术研究了凝血酶-凝血调节蛋白的结合与离子强度的关系,发现随离子强度的增加,其结合常数减小了10倍,而解离常数没有明显变化,说明凝血酶-凝血调节蛋白之间的作用力几

[38]乎完全依赖于静电作用,凝血调节蛋白沿凝血酶分子偶极方向与其结合。Chan等研究转录调控蛋

白与枯草芽孢杆菌基因组噬菌体<105中的热诱导突变阻抑剂相互作用,利用SPR研究了它们在不同温度下的亲和力,结果表明原型阻抑剂与转录调控蛋白的亲和力不受温度影响,而突变阻抑剂与转录调控蛋白的亲和力则随温度变化而变化,解释了热诱导如何触发突变阻抑剂的释放以及使外援基因表达。

21112　蛋白质结构与功能研究　利用SPR对分子间相互作用的实时监测能力,能够获得非常有价值的动力学信息。如基于同一蛋白质中不同氨基酸残基与其它分子相互作用时的动力学参数不同,可推测该蛋白内部存在的不同官能团及蛋白在翻译后发生的不同修饰。Robbio等[39]采用SPR技术,将脂蛋白B2100固定于传感器芯片上,依次注入不同的单克隆抗体。由于不同单克隆抗体与脂蛋白B2100相互作用的能力不同,可以准确鉴定脂蛋白B2100上的不同结构域。当某种蛋白质中单个氨基酸发生改变时,此蛋白与其他分子间的结合会随之改变,由此可在蛋白水平上筛选遗传多态性。Stoop[40]利用SPR技术筛选和鉴定蛋白质结合功能决定簇的氨基酸位点,通过深入研究血纤维蛋白溶酶原活性抑制剂PAI2I的突变体结构功能区域,发现PAI2I三个表面抗原决定簇是其不同生物活性的分子基础。21113　蛋白质碎片和突变分析　有些蛋白质因为本身不稳定、不溶或者没有足够的量,无法直接用于SPR分析。此时,可用包含有响应位点的碎片蛋白质分子代替全分子。如全分子可用SPR分析,比

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较全分子和碎片分子的动力学常数,可得到更多的信息。由于使用SPR技术可直接从粗提液中将待分析的蛋白质结合到传感芯片上,因此可很方便地分析蛋白的位点突变。如在研究B淋巴细胞抗原CD22分子的唾液酸识别位点的结构中,对候选区域中的某些残基突变,使用SPR技术测定突变后的亲和力等参数,确定连接位点的基序

的作用,如抗体

识别。[42][41]。目前对蛋白质识别的特异结构的认识主要来自具有高亲和力[44]、激素受体[43]、蛋白酶等,而对亲和力较低的作用则研究很少,如细胞黏附与

21114　信号转导　SPR技术能够在不影响酶活性的条件下测定分子间的相互作用,因此在信号转导研究中具有很强的优势。李雪玲等[45]研究胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF21R)的信号通路,利用SPR传感器PY20能够表达由IGF21R激活酶不同浸泡时间和不同细胞裂解液引起的不同水平的肽酪氨酸磷酸化。结果表明只有磷酸化的肽能与其下游胰岛素受体发生相互作用。这种新的模拟细胞受体的肽磷酸化方法具有实时、快速、免标记等优点,为研究受体磷酸化信号传导通路提供了更有效的方法。Schuster[46]运用SPR技术研究了大肠杆菌中控制趋向性的信号通路中的1,通过分析相互作

[47]用发现了一种新的蛋白激酶与底物的相互作用。Bader等,

并插入脂修饰的Ras蛋白,从而研究信号传导过程中212　表面等离子体共振对蛋白质-21211　SPR,研究者对检测芯片的多样,已不能满足人们的需求。研究者通常采用在芯片上制备1、(SAM),再利用交联剂将配体蛋白质共价键合到该SAM上形成3层结构来制备检测芯片。虽然该方法能够实现大部分蛋白质的表面固定化,但由于芯片表面的配体分析蛋白质密度过高,导致蛋白质与蛋白质相互作用时的堆积现象和空间位阻效应显著。混合自组装单分子层的使用虽然可在一定程度上降低配体蛋白质分子的密度,但配体在SAM表面无序的分布和空间取向导致部分配体仍排列紧密,且配体的利用率和对受体的结合能力不[48]高。利用蛋白A[49]或蛋白G[50-51]等大分子对相应配体的定向捕获能力,首先在芯片表面固定一层蛋白A或蛋白G,再定向固定配体分子。该方法既能形成均一的配体层,又能最大限度保持配体的活性,

)片段固定抗体是近年来兴起的一种可有效解决上述SAM法或混合SAM法的问题。利用抗体的F(ab′

)段的一端是巯基能够直接与金共价结合,抗体的特异性识别位点则位于另一端能够实新方法,F(ab′

现与抗原的特异性结合[52-53]。

21212　抑制非特异性吸附技术　非特异性吸附的存在是研究蛋白质-蛋白质相互作用时的最大难题。非特异性吸附在多数情况下难以完全消除,其带来的信号叠加在分子间特异性结合的信号上,严重干扰正常的分析,因此必须尽量消除。通常采用的消除方法有调节孵育液组成、构建抗吸附性表面和使用可移除膜封闭技术等。

蛋白质分子的相互作用力有疏水作用、静电作用、氢键和范德华力,其中前两者约占总能量的85%。疏水作用能够引起蛋白质的构象变化,使其活性降低,因此要尽量降低芯片表面的疏水性。而对于静电作用,应增大缓冲液的离子强度与膜表面的带电基质形成离子对,中和带电位点,减弱静电作用。同时,在缓冲溶液中加入01005%～011%的表面活性剂Tween220也是防止非特异性效应的方法之一[54-56]。

使用惰性封闭试剂或具有合适端基的巯基化合物来构建非吸附性表面是抑制非特异性吸附的常用

[57][58-60][61]方法。其中,常用的封闭剂有乙醇胺(MEA)、牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白等。而非吸附性

表面主要采用端基为羟基

应具有如下特征[73][62-64]、甲氧基[65]、糖基[66-68]、磷酸胆碱[69][70-72]、聚乙二醇(PEG)等的巯基化合物构建,美国哈佛大学Whiteside研究组对此进行了详细研究,认为此类巯基化合物的分子结构:无静电荷、不包含氢键给予体、具有氢键受体、包含极性官能团。其中无氢键给

[74]予体是抑制非特异性吸附的关键性结构因素。

可移除膜封闭技术是最近发展的一种降低非特异性吸附的有效方法。利用双层磷脂膜覆盖传感器表面,蛋白质特异性结合后,在该上层磷脂膜表面产生的非特异性吸附将同双层磷脂膜一起被洗去,

[75]从而可消除非特异性吸附的影响。Phillips等将12巯丙醇-巯基乙胺(7∶3)或12巯丙醇-1032二巯

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1348分析测试学报第28卷基丙烷(7∶3)修饰在传感芯片金表面,为配体蛋白提供结合位点,同时也为形成双层磷脂膜提供亲水性表面。固定配体蛋白后,芯片浸泡在脂囊泡溶液中形成磷脂膜,经过蛋白特异性结合后,用非离子型表面活性剂洗去双层磷脂膜,消除了非特异性吸附的干扰,实现了在高浓度基体蛋白质共存条件下(如血清样品)测定痕量目标蛋白的目的。

21213　传感芯片表面再生技术　经过蛋白质的特异性结合后,如何能在保持配体蛋白的生物活性的基础上,实现传感芯片表面的再生是另一大难题。需要根据蛋白质分子间的结合力强弱选择合适的再

[76]生条件,通常采用强酸、强碱、高浓度盐或合适的表面活性剂等方法。Pei等研究羊血清中抗鼠免

疫球蛋白的活性,分别使用8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍、011mol/L醋酸、011mol/LHCl、011mol/LH3PO4、011mol/LNaOH、0101mol/LHCl、011mol/L氨基乙酸-HCl(pH215、2)考察传感芯片的表面再生效果。结果表明,8mol/L尿素、011mol/LH3PO4、0101mol/LHCl、011mol/L氨基乙酸-HCl(pH215、2)均能实现再生并且保持配体蛋白的活性;6mol/L盐酸胍、011mol/LHCl虽然再生效果良好,但会降低配体蛋白的活性;011mol/LNaOH的再生效果则高达14514%,[77-78]]片表面的配体或葡聚糖基质。常用的表面活性剂主要是S抗原抗体的结合和解离,实现解离,。3　[80]SPR,如表面等离子体共振成像技术(SPRI)与电化学表面等离子体

[81][82][83][84][85]共振(EC2SPR),SPR技术与质谱、荧光光谱、红外光谱、紫外-可见光谱(UV2Vis)、

[86][87]石英晶体微天平(QCM)、原子力显微镜(AFM)等联用,极大地拓展了SPR技术的应用领域,如

[88][89][90][91]电化学掺杂/去掺杂过程、吸附/脱附反应的研究、痕量物质的检测、薄膜性质、介电常数

[92][93][94][95][96][97][98]的测定等方面。并能对包括蛋白质、多肽、DNA、复杂配合物、细菌、病毒、毒

[99][100][101][102]素、药物、农药和有机膜等物质或体系多种分析对象进行研究。而且,联用技术克服了SPR无识别能力的缺陷,能鉴定生物分子与表面固定分子非特异性键合,同时能够给出某些蛋白质和

[82]蛋白质与其它分子化合物的结构信息。

4　总结与展望

SPR技术以其无需标记、特异性强、灵敏度高、样品用量小、可实现在线连续实时检测等特点,并结合微型化、便携式,以及多种分析手段的联用技术的不断完善和发展,必将在蛋白质-蛋白质相互作用研究中起到积极作用。

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