WB-自己总结

WB实验步骤

1. 组织样品制备

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵裂解后，将裂解液移1.5ml 离心管中，（若有组织残渣可继续冰上振荡30min）；然后4℃、12000rpm离心20min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20 ℃保存（-80℃长期保存）。12000g离心，4℃，2min。

⑶取少量上清进行定量。

⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 2. 蛋白定量

2.2.1制作标准曲线

（1）从－20℃取出浓度为1μg/μl的BSA（牛血清白蛋白，蛋白标准品），室温融化后，备用，使各个孔的终体积为20ul。 BSA浓度（μg/μl） 0 BSA(μl) PBS(μl) BSA含量(μg) 0 20 0 0.025 1 19 0.5 0.050 2 18 1 0.100 4 16 2 0.200 8 12 4 0.300 12 8 6 0.400 16 4 8 0.500 20 0 10 （2）根据样品数量（每样200μL），按50体积BCA试剂A+1体积BCA试剂B（50:1）配制适量 BCA工作液，充分混匀（刚开始混合时可能会有浑浊，但混匀后浑浊就会消失，BCA 工作液在室温 24 小时内稳定）；

（3）向各孔中各加200μl BCA工作液；

（4）迅速把酶标板放在震荡器上震荡30s混匀，然后37℃孵箱孵育30min，然后在 562nm 下比色测定，以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 2.2.2蛋白样品测定

（1）首先将样品做一定比例稀释（最好测定前多做几个梯度，一开始可稀释10倍：Protein/PBS=2/18μL），以确定好最佳样品浓度；

（2）将稀释好的样品加入到96 孔板中，使样品稀释液总体积为20μL，每个浓度重复2-3次；

（3）加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃孵箱孵育30分钟（注：若使用温箱孵育时，应注意防止水分蒸发）；

（4）以标准曲线0号管做参比，用酶标仪测定562nm处的吸光度值；（注：由于移液器在取小量时的误差较大，标准线前面的点可能不是很准确，所以尽可能的让样品点落在标准曲线的后 1/2部分）；

（5）根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品

稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。 3. 蛋白样品上样前处理

（1）首先，调整蛋白样品的浓度，使各个实验组、空白组和Model组蛋白浓度保持一致，并使其在后续的上样中，每孔样品所含的蛋白总抽提物在20-40μg左右； （2）蛋白变性：5×SDS上样缓冲液20μL+1M二硫苏糖醇（DTT）10μL+适量纯水统一成浓度为1 μg/μL的蛋白样品混匀；

（3）样品混匀后，PCR仪上98℃变性5min（或70℃加热5-10min），简短离心，取上清，-20℃短期或-70℃长期保存。 3蛋白电泳

3.1制胶（聚丙酰胺凝胶，PAGE胶）

聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%，其中: a=双体(bis)的重量；b=单体(arc)的重量；m=溶液的体积(ml)。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，

5%C构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。

不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表），原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。

蛋白分子量(kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 凝胶浓度(%) 20 15 12.5 10 8 （1）玻璃板蘸洗洁精轻轻擦洗，用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里烘箱烘干；

（2）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。

（3）分离胶（10％） 超纯水 30％Acr/Bic 1.5 mol/L Tris ·HCl（pH8.8） 10％SDS 10%AP（过硫酸胺） TEMED 1块 3.08ml 2.475ml 1.875ml 75μl 37.5μl 3.75μl 2块 6.16ml 4.95ml 3.75ml 150μl 75 μl 7.5 μl a、加 TEMED 后立即混匀灌胶：快速在右上角斜灌（注：可用10ml枪吸取5ml 胶沿玻璃放出。最后几滴不注入以免产生气泡），使胶面与把手齐平。

b、灌胶后立即加水，枪平放，快速均匀缓慢注水（注：灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度；操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡；加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型）。

c、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固，就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

（4）浓缩胶（4％）

试剂用量

H2O 2.7mL 30?r/Bis 0.67mL 1.5MTris/HCl(PH 8.8) 0.5mL 10%SDS 0.04mL 10% APS 0.04mL TEMED 0.004mL

浓缩胶配好后迅速沿右上角灌封，迅速插入梳子（水洗晾干），水平插入后等1h（注：由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出）。 3.2电泳

（1）给灌好的胶上方梳子部分冲少量双蒸水，然后双手对称轻轻将梳子拔出，再用蒸馏水冲洗梳孔，将孔内水分排净。将夹子松开取出玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外；若只跑一块胶，另一边需垫塑料板）。先向两块板间注入1 ×电泳液至玻板上缘，然后电泳液在外盒亦加1/4；

（2）测完样品蛋白含量后，计算含20-40μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入 5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS（注：上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加30μl 样品）；

（3）样品混匀后PCR仪95℃加热5min，迅速冰上冷却，4℃ 12000r×30s 瞬时离心； （4）上样：用微量进样器吸取样品，插入加样孔缓慢加入，防止样品溢出（加下一样品前在电泳液中洗涤3 次，防止交叉污染）；

注：a、插入加样孔缓慢加入，防止样品溢出；加下一样品前在电泳液中洗涤3次，防止交叉污染；

b、样品体积＝（20-40μg）/蛋白浓度，不足部分以裂解液补充； c、显影Marker（红色）2μl +3μl（5×上样buffer）；

（5）电泳：盖好电极盖(红-红，黑-黑)，设置为恒压80V，电泳约 30min，各样本跑至积层胶末端（浓缩胶和分离胶的分界面）后，调节电压至160V，继续电泳约90min，待

溴酚蓝前沿距电泳槽底部1cm时，停止电泳。 2.5 转膜 2.5.1 准备

（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸+1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜；

注：a、切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜；

b、将切好的硝酸纤维素膜置于纯水浸2h才可使用，操作方法是：用镊子捏住

膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触，这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿，若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）；

（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）； 2.5.2转膜

（1）裁剪12张同等大小的转膜专用滤纸和4张纱布：将①2张纱布、②4张滤纸浸泡于PH10.4的Anode bufferⅠ中；将③2张滤纸浸泡于PH10.4的Anode bufferⅡ中；将④6张滤纸和⑤2张纱布浸泡于PH9.4的Gathode buffer中；将凝胶从电泳槽内取出，切割至合适大小并剪角标识，先浸泡纯水10秒，再浸泡在PH9.4冰冷的Gathode buffer中孵育5min；将PVDF膜，先放入20%甲醇中浸泡活化1-2min，再于冰冷的电转液中浸泡至少5min；

（2）切胶：要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬，撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

（3）按照以下顺序：正极板、纱布①×1张、滤纸②×2张、滤纸③×1张、PVDF膜（剪角标识）、凝胶、滤纸④×3张、纱布⑤×1张、负极板，整齐叠放，小心清除叠层中的气泡；

（4）将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移2 h或40V 转移3 h（注：视

目的蛋白分子量大小确定转膜时间，可做预实验摸索经验）；

（5）丽春红染色（观察膜的转移情况）：将PVDF膜放入TBST 洗一次，再置于1：10稀释后的丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5min，倒回染液；用大量的蒸馏水浸泡膜（或用甲醇冲洗，条带会更清晰），直至水变清，无色蛋白条带清晰（注：膜可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色；PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭）； 2.6封闭

为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭。传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（注：因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白；使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景；某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法）。

将 PVDF 膜条放入盛有约 20mL 5%封闭液的小盒中(膜正面朝上)，盖上盖子，室温水平摇晃 45 rpm，封闭2h。 2.7一抗孵育

（1）孵育 Buffer的配制：按说明书建议的稀释倍数，用过滤除菌后的TBST稀释一抗到合适浓度（GAPDH为1:10000），如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带；某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含有封闭剂的TBST孵育，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时不同；

（2）孵育：TBS/T溶液洗去膜表面多余的封闭液，每块加入TBS/T溶液10mL，摇荡95 rpm，5min×3次。按照预染彩色蛋白Marker的分子量指示条带确定目的蛋白位置，把PVDF膜剪成2条条带（目的蛋白和内参条带），立即完全浸泡于对应的一抗反应液中。4℃摇荡45 rpm，过夜（一抗回收后可加入 10% 叠氮钠 2μL中多次利用）。

注：a、孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜不等，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的的孵育时间来保证特异性结合；

b、孵育温度：如果在封闭液中孵育过夜，应在4℃进行，否则污染会导致蛋白降解（特别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆盖膜，防止结合不均匀。

2.8二抗孵育

(1)TBST 洗膜：洗涤过程中放于摇床水平摇晃，摇荡95 rpm，5min×3次；

(2)孵育；按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释（1:1000 - 1:20,000）预实验，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带，室温振荡1-2h；

(3)1×TBST 水平摇晃洗膜3次，每次至少 5min；再用TBS 洗一次，10min；准备进行 ECL 显色。 2.9 ECL显影

(1)物品准备：移液器、薄塑料袋、胶带、剪刀、镊子、枪头、曝光夹、废液缸、手套、EP 管、X-光胶片底片(密封防止曝光)、PVDF 膜、ECL 液、大平皿、大饭盒、水槽、将曝光夹、薄塑料袋、胶带事先准备好；

(2)配ECL 液：A、B 液等量1：1混合，吸完A液再吸B液时一定要换枪头，否则会造成污染，使试剂失效； 1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X-光片夹中。

(3) 显影和定影：在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X-光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开 X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1-5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为30s～3min（20～25℃），温度过低时（低于16 ℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min ，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

注：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

2.10灰度扫描X光胶片在凝胶自动成像仪上进行照相、数据分析。经凝胶密度扫描系统处理，测定各信号带灰度值。以内参GAPDH的蛋白信号灰度为内参照，计算待测蛋白的信号灰度值与它的灰度比值，作为待测蛋白的表达值。即：待测蛋白相对量＝待测蛋白信号灰度值/GAPDH蛋白信号灰度值。

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