发酵——糖、氮、磷检测方法

发酵生产过程中糖、氮、磷检测方法

(六)总糖含量测定

总糖:指在酸性条件下完全水解生成葡萄糖的糖的总和。

1.操作程序

1.1.原理:多糖经酸水解后,生成的葡萄糖分子的醛基具有还原性,可在碱性条件

下将二价铜离子还原成一价铜离子。二价铜离子在酸性条件下与碘化钾作用析出

游离碘,用硫代硫酸钠标准溶液进行滴定,据此可计算出溶液中二价铜离子的含

量。通过检测加入样品后溶液中二价铜离子消耗量, 可间接计算或查表得出样品

中总糖的含量。

1.2.反应式 酸性

（1） 酸水解 (C6H10O5)n+nH2O = n(C6H12O6)

（2）碱性二价铜离子制备 CuSO4+2NaOH=Cu(OH)2↓+Na2SO4

─CHCOOK

2 =2O

（3）─CHCOONa

CHO O─ （4）葡萄糖还原反应 (CHOH)220 =4+Cu2O↓ CH2OH O─CHCOONa CH2OH

（5）碘化钾还原溶液中剩余二价铜离子:

酸性

2Cu+4KI = Cu2I2+4K+I2↓

（6）硫代硫酸钠滴定反应:

酸性

2Na2S2O3+I2 =Na2S4O6+2NaI 2++

发酵生产过程中糖、氮、磷检测方法

1.3.试剂:斐林混合液:6.0mol/l盐酸,4.0mol/l盐酸,0.5%淀粉指示剂, 0.1mol/l硫代硫酸钠滴定溶液。

1.4.器具及仪器:0.05ml、1ml、5ml吸量管,25ml容量瓶,25ml酸式滴定管,25ml碱式滴定管,大试管H.H.S91-6电子恒温水浴锅,漏斗,试管。

1.5.操作

1.5.1.糖标准曲线制作:准确称取0.6000g(±0.0005g)分析纯葡萄糖于100ml 容量瓶中,加水溶解、定容、摇匀。精密量取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml上述溶液于大试管中,准确加入10ml斐林混合液,100℃ 沸水浴10分钟后,取出冷却至室温。用酸式滴定管加入6.0ml 6.0mol/L盐酸, 边加边轻轻振荡,使盐酸与试管内溶液充分接触。用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液将显乳白色时，加入1-2ml0.5%淀粉指示剂，继续滴定至蓝色刚好消失。以葡萄糖加入量为横坐标,滴定数为纵坐标,在坐标纸上绘出曲线图,然后从中查出每间隔0.1ml滴定数所对应的葡萄糖量,并绘制成表格。

1.5.2.样品测定: 将发酵液过滤,精密量取续滤液1.00ml于25ml容量瓶中,加入4.0mol/l盐酸5.0ml,沸水浴加热10分钟,取出冷却至室温,用纯化水定容,摇匀。精密量取上述水解液2.5ml于大试管中,加入10.00ml斐林试剂,同时以10.00ml斐林试剂作空白, 沸水浴加热10分钟,冷却至室温,加入6.0mol/l盐酸6.0ml,用硫代硫酸钠标准溶液滴定, 溶液将显乳白色时，加入1-2ml0.5%淀粉指示剂，继续滴定至蓝色刚好消失。

1.6.计算:(V空白-V样品) x5查表即可得样品总糖含量(g/100ml)。

1.7.还原糖

1.7.1.样品测定；将发酵液过滤，精密量取滤液0.5ml于装有10ml斐林试剂的大试管中，沸水浴加热10分钟，冷却至室温，加入6.0mol/L盐酸6.0ml，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，溶液将显乳白色时，加入1-2ml 0.5%的淀粉指示剂,继续滴定至兰色刚好消失。同时，以10.00ml斐林试剂做空白.

1.7.2.计算:

(V空白-V样品)查表即可得样品还原糖含量(g/100ml

1.8.注意事项

1.8.1.沸水浴准确控制10分钟。

发酵生产过程中糖、氮、磷检测方法

1.8.2.沸水浴后要将样品冷却至室温,加入盐酸酸化时轻轻振荡,使溶液酸化完全。

1.8.3.滴定速度可稍快,滴定过程中不宜剧烈振荡。

1.8.4.淀粉指示剂不宜加入太早。

（七）氨基氮含量测定

1.检测方法

1.1.原理:铵离子或氨基与中性甲醛起反应,生成酸或羧酸,用氢氧化钠溶液滴定。

1.2.试剂:18%中性甲醛溶液,0.1%甲基红指示剂,0.5%酚酞指示剂,0.1mol/l盐酸；0.03569mol/L氢氧化钠标准溶液。

1.3.仪器及器具:250ml锥形瓶,5ml吸量管,25ml碱式滴定管,定量加液器,50ml量筒, 漏斗,试管。

1.4.操作:取发酵液过滤,精密量取滤液2.50ml至250ml锥形瓶中,加入20ml蒸馏水,摇匀，加甲基红指示剂2-3滴,用0.1mol/l盐酸调至红色,放置3分钟,用0.03569mol/L氢氧化钠溶滴定液调至黄色。用定量加液器向锥形瓶内加入5.0ml中性甲醛,摇匀放置5分钟,再加入3滴酚酞指示剂,用标准氢氧化钠滴定至微红色即为终点,记录所消耗标准氢氧化钠溶液的体积。

1.5.计算:

M×V1×m×100 0.03569×V1×14×100

氨基氮含量(以氮计,mg/100ml)= ─────── = ──────────≈20V1 V2 2.5

式中: M:氢氧化钠滴定溶液浓度, V1:滴定时消耗氢氧化钠滴定溶液的体积,ml; V2:被测样品的体积,ml; m:氮原子摩尔质量,14mg/mmol。

1.6.注意事项

标准氢氧化钠溶液使用期限不得超过两月。

（八）溶磷含量的测定

分光光度法:利用被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收,对物质进行定性和定量分析的方法。

发酵生产过程中糖、氮、磷检测方法

1.检测方法

1.1.原理:酸性条件下,磷酸根与钼酸铵作用生成的磷钼酸铵经米吐尔作用后,高价钼被还原成低价钼呈蓝色,可根据朗伯-比尔定律于650nm处测其吸光值。

1.2.反应式:

2H3PO4+24(NH4)2MoO4+21H2SO4→2(NH4)3PO4·12MoO3+21(NH4)2SO4+24H2O

米吐尔

(NH4)3PO4·12MoO3───→(MoO2·4MoO3)2·H3PO4

1.3.试剂:磷试剂Ⅰ(钼酸铵),磷试剂Ⅱ(米吐尔),10%三氯醋酸。

1.4.仪器及器具:25ml、50ml容量瓶,1ml、5ml、10ml吸量管,10ml量筒,试管,漏斗,H.H .S91-6电子恒温水浴锅,722型分光光度计。

1.5.操作

1.5.1.标准曲线制作:准确称取分析纯磷酸二氢钾0.4394g(±0.0005g)于1000ml容量瓶中,加入0.10mol/l H2SO420.0ml溶解,加水至刻度,摇匀。再吸取

5.00ml于50ml容量瓶中,定容,摇匀,即得10.00ug/ml的磷标准溶液。

分别吸取上述标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00ml于25ml容量瓶中,各加水至12ml,分别加入磷试剂Ⅰ,Ⅱ各1.0ml,沸水浴加热30min,冷却后,加水至刻度。用纯化水作空白, 使用722型分光光度计于650nm处比色。以吸光值(A)对浓度(c,ug/ml)绘制标准曲线或线性回归得出曲线方程。

1.5.2.样品测定:取发酵液过滤,精密吸取清液5ml于50ml容量瓶中,加入10% 三氯醋酸10.0ml,平摇,静置5min后,定容、摇匀、过滤,吸取5.00ml滤液于25ml容量瓶中,加磷试剂Ⅰ,Ⅱ各1.0ml，水7.0ml，沸水浴30min后,冷却至室温, 用蒸馏水定容摇匀后,使用722型分光光度计于650nm处比色,由所得吸光值A 查表或代入线性方程计算出样品中溶磷含量。

1.6.注意事项

1.6.1.磷试剂Ⅰ,Ⅱ应保存于棕色瓶中,使用期为两周,如果变蓝色应不再使用。

1.6.2.钼蓝产生与温度,时间,酸度有密切关系,因此,要严格控制显色条件。

1.6.3.试剂Ⅰ,Ⅱ稳定情况下,可以纯化水为空白,否则,应以试剂为空白。

(八)试剂的配制和标化:

所用试剂均为分析纯或相应等级。

发酵生产过程中糖、氮、磷检测方法

1 斐林试剂:

1.1 配制:

称取120g五水硫酸铜,用蒸馏水溶解加入浓硫酸5mL并稀释至1600ml,制成A液;

称取250g氢氧化钠和375g酒石酸钾钠,用蒸馏水溶解并稀释至1600ml,制成B液;(注意:氢氧化钠溶解时要缓缓加入)

称取300g碘化钾,用蒸馏水溶解并稀释至800ml,制成C液;

将A和B混合后摇匀,加入C充分振荡即可。

1.2 标化:

精密量取10ml新配斐林试剂至250ml锥形瓶中,加入6.0mol/l盐酸溶液6ml,轻轻振荡均匀后,用0.1000mol/l硫代硫酸钠溶液滴定至溶液黄色刚好消失,加入1-2ml淀粉指示剂, 用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液蓝色刚好消失。记录消耗的标准硫代硫酸钠溶液的体积,应在8-12ml之间。

2 6mol/l盐酸溶液:

配制:在盛有5000ml蒸馏水的10000ml试剂瓶中,缓缓加入5000ml浓盐酸。待冷却后,摇匀。

标化:精密量取1ml待标液至50ml容量瓶中,定容。精密量取该稀释液5ml于250ml锥形瓶中,加入20ml蒸馏水,滴加3滴0.5%酚酞指示剂,用0.03569mol/l氢氧化钠溶液滴定至溶液由无色转变为微红色且30秒不消失即为终点。滴定体积应在16.5-17.1ml之间。

3 4mol/l盐酸溶液:

配制:在盛有667ml蒸馏水的1000ml试剂瓶中, 缓缓加入333ml浓盐酸。待冷却后,摇匀。

标化:精密量取2ml待标液至50ml容量瓶中,定容。精密量取该稀释液5ml于250ml锥形瓶中,加入20ml蒸馏水, 滴加3滴0.5%酚酞指示剂,用0.03569mol/l氢氧化钠溶液滴定至溶液由无色转变为微红色且30秒不消失即为终点。滴定体积应在21.8-23.0ml之间。

4 2.0ml/L氢氧化钠溶液

发酵生产过程中糖、氮、磷检测方法

配制:称取80g氢氧化钠,置于1000ml试剂瓶中,加入1000ml蒸馏水,摇匀,备用. 5 18%中性甲醛

配制:取36%的甲醛溶液,以等量蒸馏水稀释。临用前以0.5%酚酞为指示剂,用 0.03569mol/L氢氧化钠溶液调至微红色。

标化:用定量加液器在250ml锥形瓶中加入5ml18%中性甲醛溶液,再加入20ml蒸馏水,并滴加3滴0.5%酚酞作为指示剂,溶液应为无色;用0.03569mol/L氢氧化钠溶液进行滴定,滴定数不得超过0.2。

6.磷试剂Ⅰ(钼酸铵)

配制:在500ml烧杯中加入57.5ml蒸馏水,然后向烧杯中慢慢加入85.7ml浓硫酸,边加边搅拌,放冷;称取5.72g钼酸铵置于100ml烧杯中,加入57ml蒸馏水使溶解将该溶液慢慢加入上述硫酸溶液中,搅拌均匀。冷却后, 转移至200ml棕色试剂瓶中,放入冰箱储备待用。

标化:每次更换新配制试剂前,参照《磷含量测定SOP》与旧试剂作对照试验,所选用样品最终显色吸光值应在0.2-0.8之间,新旧试剂对比吸光值差异应在0.01以内。

7.磷试剂Ⅱ(米吐尔)

配制:称取1.70g米吐尔置于100ml烧杯中,再加入1.0g亚硫酸钠,用50ml蒸馏水溶解; 称取44.0g亚硫酸氢钠置于250ml烧杯中,加入150ml蒸馏水充分搅拌使溶解。再将上述米吐尔-亚硫酸氢钠溶液转移至此烧杯中,充分混合均匀。将混合液转移至200ml棕色试剂瓶中,放入冰箱储备待用。

标化:每次更换新配制试剂前,参照《磷含量测定SOP》与旧试剂作对照试验,所选用样品最终显色吸光值应在0.2-0.8之间,新旧试剂对比吸光值差异应在0.01以内。

8 10%三氯醋酸溶液

配制:称取100g三氯醋酸置于1000ml烧杯中, 加入1000ml蒸馏水使溶解,搅拌均匀后,转移至1000ml棕色试剂瓶中待用。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/wfd4.html