原核诱导表达

原核诱导表达的标准操作程序（SOP） 一．目的：

使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：

本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三．实验原理：

E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

四、试剂准备:

（一）实验器材的灭菌： 枪头的灭菌：

1mL，200μL，20μL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。

螺口管及离心管的灭菌：

将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。

50mL离心管的灭菌：

将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常温放置。

（二）LB培养基的配制 液体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g 氯化钠 10g

酵母提取物 5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。

固体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g

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氯化钠 10g 酵母提取物 5g

琼脂粉 15g

高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放于4℃保存。

（三）1M IPTG的配制：

经过计算，10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。买来的粉末状的IPTG一般全部配成1M IPTG。

1、无菌操作台紫外线照射，后通风。

2、用少量去离子水将IPTG溶解完全，并定容。

3、在无菌操作台中，用0.22μm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中，过滤除菌，-20℃保存。

注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔掉，排出气体，滤头加入IPTG液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。滤的过程中，手不能碰滤头。

（四）3×SDS-PAGE loading buffer的配制：

3×SDS-PAGE loading buffer 1M Tris-Hcl (PH 6.8) SDS BPB(溴酚蓝) 甘油（丙三醇） 去离子水 10ml 1.5ml 0.6g 30mg 3ml 5.5ml 1．将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解，可以在37℃水浴溶

解。完全溶解后，再加入BPB，进行溶解。

2．把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。 3．使用前，每管加入30μL巯基乙醇。

注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。

（五）10×PBS的配制：

0.1M PBS（10×PBS） NaH2PO4.2H2O Nacl Na2HPO4.12H2O 1L 2.83g 85g 28.98g 2

用去离子水将以上药品进行溶解。（溶解的非常慢，可能需要过夜） 调PH值到7.2，用0.4μm的滤膜过滤。常温保存。 工作时用的是1×PBS。

（六）1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制： 1.5M Tris-Hcl 250ml Tris 45.425g 1． 用200ml去离子水将Tris溶解。 2．用浓盐酸调PH值到8.8。

3．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。 4．0.4μm的滤膜过滤，常温保存。

注意事项：Tris的缓冲能力很强，调PH值时，费些时间，但不要调过。

（七）1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制： 1M Tris-Hcl 250ml Tris 30.275g 1．用200ml去离子水将Tris溶解。 2．用浓盐酸调PH值到6.8

3．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。 4．0.4μm的滤膜过滤，常温保存。 （八）30%丙烯酰胺的配制： 30%丙烯酰胺 250ml 丙烯酰胺 72.5 ml BIS甲叉丙烯酰胺 2.5 ml 1．把药品用去离子水溶解后定容到250ml。 2．用滤纸过滤，放在棕色瓶子中，4℃保存。

注意事项：两种药品有毒性，配制过程要带手套和口罩。

（九）10%SDS的配制：

1．1g SDS加入10ml去离子水进行溶解。 2．分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。

（十）10%过硫酸铵的配制：

1．1g 过硫酸铵加入10ml去离子水进行溶解。 2．分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。

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（十一）5×SDS-PAGE电泳缓冲液的配制：

5×SDS-PAGE电泳缓冲液 Tris Glycine（甘氨酸） SDS 1L 15.1g 94g 5g 将以上药品用去离子水溶解后定容到1L，常温保存。工作时用的是1×SDS-PAGE电泳缓冲液。

（十二）考马斯亮蓝R-250染色液的配制： 考马斯亮蓝R-250染色液 1L

1． 往1g考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇，在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。 2． 加入650ml去离子水，磁力搅拌器搅拌过夜。 3． 再加入100ml冰醋酸进行溶解，磁力搅拌器搅拌。

4． 在通风橱内用滤纸进行过滤。常温保存。染色液只能反复用两次。

注意事项：在磁力搅拌器上搅拌时，要把容器封口。

（十三）脱色液的配制：

脱色液 醋酸（冰乙酸） 乙醇（无水乙醇） 去离子水 常温保存。

四．实验步骤： （一）：质粒的转化

1．使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭，然后将灭菌的培养基以及所有要用到的器具放到超净台上，在开紫外照射30min左右。操作之前，关掉紫外，打开通风橱，将手用酒精擦拭后开始操作。

2．从-80℃的冰箱中取出表达菌（BL21）的感受态细胞（每管100μL），在-80℃冰水中融化。

3．载体（PET32a等）与基因片段的连接后质粒1μL，缓慢的加入到100μL BL21感受态中，冰置15min。（无菌操作）

3．42℃下热激90s，随后在冰水中冰置5min。

4．涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放置等它凉却。把处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基（氨苄或卡那等）上。用冷却的涂布棒进行涂布，左手把该盖拿起，小指轻轻转动培养基，右手来涂，涂到培养基表面快干。（无菌操作）

5．放在37℃培养箱中，倒置培养过夜。

1L 100ml 50ml 850ml 4

注意事项：

1．质粒的转化时，质粒是冻在-20℃的冰箱中，等它完全化了在进行吸取，往感受态中加入质粒时，一定要缓慢，因为感受态非常脆弱，防止感受态受伤。

2．质粒的转化时，热激的时间90s，一定要控制好时间。

3．质粒的转化时，涂布棒在涂布前，一定要晾凉涂布棒。防止感受态被烫死，或固体培养基的损坏。

（二）：挑菌与接菌：

1．无菌操作台紫外线照射，后通风。将转化后的平板取出。 2．在无菌操作台中，把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺口管，进行平行实验）取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。

3．灭菌后的LB培养基从冰箱中取出，在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。吸取LB培养基（一般5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨苄霉素、卡那等）。氨苄霉素（卡那）：LB培养基=1:1000（5.5μL），抗性由载体决定。

4．镊子用酒精棉球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镊子晾凉。用晾凉的镊子，夹取20μL小枪头，在转化后的平板上挑取单菌落，扔到培养基中。

5．接好菌的螺口管，进行摇菌。37℃，180rpm。摇到菌的对数期（OD600值0.4-0.6），时间大概2-3h。可以模糊看到手即可。（注意不要摇过）

6．用完的平板用封口膜封住，倒置放于4℃保存。

7．若直接用菌液进行接菌，接菌比例为，菌液：LB培养基=1：100。

注意事项：

1． 接菌吸培养基时，把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基，移液枪尽量不

要插进三角瓶中。

2．接菌时一定要加入抗性，挑菌落时，要挑单个的菌落，且不要把培养基也扣起来。

3．摇菌不要过了它的对数期，2小时后随时注意其生长状态。

（三）小量保菌：

1．无菌操作台紫外线照射，后通风。

2．将摇到标准OD值的菌液进行小量保菌，先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。 3．保菌：从灭菌的饭盒中取出4个1.5ml的灭菌的离心管，加入50μL的灭菌后的80%的甘油，并分别加入相应的350μL菌液。一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌。（若不保菌，实验不能进行重复，只能从头做）

4．标清保菌的类别，名称，时间，如“BL21 PET32a VAV 1号2010.7.14”,其中的1号是平行对照中它排几号。

5．混匀，-20℃保存。

注意事项：

1．在小量保菌中，一个基因的四个平行对照都要保菌，否则得重新摸条件。 2．在小量保菌中，菌液与甘油一定要混匀在保存，否则菌会被冻死。

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蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。BL21(DE3)即我们做表达是常用的表达菌。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2 系列就是更好的选择―― 这种携带pRARE2质粒的 BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒）

当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K-12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB)和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。（卡那霉素敏感）

Rosetta-gami? 2 则是综合上述两类菌株的优点，既补充7种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）

Origami B 是衍生自 lacZY突变的 BL21菌株，这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。（四环素敏感）

在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小Tips是要注意的，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。比如Rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。 现象 无蛋白表达 出现截短蛋白 可能原因 改进方案 建议菌株 Rosetta 2 补充稀有密码子的E. coli Rosetta-gami 2 tRNA；将稀有密码子突变为Rosetta-gami B 的密码子偏移性 普通大肠杆菌密码子 RosettaBlue 降低宿主胞质的还Origami 2 二硫原性；利用促进二硫键形成的Rosetta-gami 2 键形成困难 Rosetta-gami B 各种载体标签 表达控制优化表达水过快，表达量过高 平：降温，IPTG浓度优化 Tuner Rosetta-gami B 包涵体 蛋白无活性 蛋白错误折叠 降低宿主胞质的还Origami 2 原性；利用促进二硫键形成的Rosetta-gami 2 Rosetta-gami B 各种载体标签 控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化 Tuner Rosetta-gami B pLysS 菌株 pLysS、pLysE 菌株 细胞死亡，生长极困难 无克隆生长 毒性蛋白 过高本底表达 更严格的本底表达控制 更严格的本底表达控制 4．若实在不可溶，只能把蛋白截短，这样可溶性会明显增加。

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六．SDS-PAGE的相关技巧： 1．SDS-PAGE电泳的原理：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

2．SDS-PAGE电泳遇到的相关问题及解答。

（1）配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

（2）提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

（4）“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

（5）“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

（6）为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

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（7）为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

（8）什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

（9）为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

(10)为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/wcjw.html