实验三 高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定

实验三 高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定

一、实验目的

1、掌握微生物分离纯化的基本操作；

2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法； 3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法； 4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。

二、实验原理

在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。

苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。

+ COOHCH2CH2COOH CH3COOH

CO2+H2O

从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。

三、实验器材与试剂

1、样品

实验土样采自校园污水处理厂。 2、器材

恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、pH试纸。 3、试剂

葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。

苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。

Na2B4O7饱和溶液：称取Na2B4O7 40g，溶于1L蒸馏水中，冷却后使用，此溶液的pH值为10.1。

3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。

2% （NH4）2S2O8溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 4、培养基

富集培养基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，调节pH 7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。

基础培养基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.025g，水1000mL，调节pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。

四、实验步骤

（一）富集培养和驯化

采集活性污泥或土样，接种于装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取1mL转至另一个装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中，如此连续转接2-3次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优势的混合培养物。 （二）平板分离和纯化

1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充分混匀，并继续稀释到适当浓度。

2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200 mg/L。）中央，用无菌玻璃涂棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3个重复。

3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱中培养2-3d。

4、挑选不同菌落形态，在含适量苯酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于

30℃恒温箱中培养2-3d。 （三）转接斜面

将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的试管斜面，30℃恒温箱中培养2-3d。 （四）降解实验

用接种环取斜面菌苔一环，接种于100mL基础培养基中，添加适量的苯酚，30℃震荡培养2-3d。 （五）酚含量的测定

1、标准曲线的绘制：取100mL容量瓶7只，分别加入100mg/L苯酚标准溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，于每只容量瓶中加入Na2B4O7饱和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1mL，再加入Na2B4O7和溶液10mL，2%（NH4）然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置2S2O8 1mL，

10min后将溶液转至比色皿中，

在560nm处测定吸光度，根据吸光度和苯酚的量绘制标准曲线。

2、培养液中苯酚含量的测定：取经降解的培养液30 mL，离心，取上清液10 mL于100 mL容量瓶中，加入Na2B4O7饱和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1 mL，再加入Na2B4O7饱和溶液10mL，2%（NH4）2S2O8 1mL，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置10min后将溶液转至比色皿中，在560nm处测定吸光度，从标准曲线上查得苯酚的量。 （六）、计算

C（苯酚，mg/L）=查得的苯酚毫克数/10×1000

苯酚脱除率=（C1-C2）/C1×100%

式中：

C1----降解前溶液中的苯酚浓度； C2----降解后溶液中的苯酚浓度；

五、注意事项

1、各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是苯酚的称量和pH； 2、涂布平板的菌悬液只作适度稀释，菌浓度不必过低； 3、涂布平板的菌悬液不要过多或过少，0.2mL为宜； 4、平板上挑取菌落时，要挑取单菌落；

5、单碳源实验的培养基和培养条件一定要严格把握。

六、思考题

1、如何从环境中分离高效苯酚降解菌株？

七、参考文献

1、张清敏. 环境生物学实验技术，化学工业出版社，2005 2、王兰. 环境微生物学实验方法与技术，化学工业出版社，2009 3、刘娜等. 环境生物技术实验，清华大学出版社，2012 4、孔志明等. 现代环境生物学实验技术与方法，2005

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/wbp3.html