基因的分子生物学读书笔记

分子生物学读书笔记

第1篇 化学和遗传学 第1章 孟德尔学派的世界观

知识点：

1. 孟德尔定律是什么？

答：显性和隐性基因都是独立传递的，并且在性细胞形成过程中能够独立分离。这个独立分离规律（principle of independent segregation）经常被称为孟德尔第一定律。

基因存在，并且每一对基因在性细胞发育过程中，都可以独立地传递到配子中。这一独立分配律（principle of independent assortment）经常被称为孟德尔第二定律。

第2章 核酸承载遗传信息

知识点：

1. 中心法则：

答：1956年，Crick提出将遗传信息的传递途径称为中心法则（central dogma）。 转录 翻译

复制 DNA RNA 蛋白质

其中，箭头表示遗传信息的传递方向。环绕DNA的箭头代表DNA是自我复制的模板。DNA与RNA之间的箭头表示RNA的合成（转录，transcription）是以DNA为模板的。相应地，蛋白质的合成（翻译，translation）是以RNA为模板的。更为重要的是，最后两个箭头表示的过程，只能单方向存在，也就是说，不能由蛋白质模板合成RNA。也难以想象由RNA模板合成DNA。蛋白质不能作为RNA的模板已经经受了时间的验证，然而，正如我们将在第11章中要提到的，有时RNA链确实可以作为互补的DNA的模板。这种与正常信息流的方向相反的事例，与大量的以DNA为模板合成的RNA分子相比，是非常少见的。所以，大约50年前提出的中心法则在今天看来仍然是基本正确的。

第3章 弱化学作用的重要性

知识点：

1. 弱化学键主要有4种:

答：范德华力, 疏水键, 氢键及离子键。 2. 弱化学键的作用：

答：介导了到分子内/间的相互作用，决定了分子的形状及功能。

第4章 高能键的重要性

知识点：

1． 蛋白质与核酸的形成：

答：蛋白质是氨基酸间通过肽键连接, 核苷酸间通过磷酸二脂键连接而形成核酸。以上2种重要生物大分子的形成都是由高能的 p~p水解提供能量, 对反应前体进行活化。 2． ATP的作用：

答：ATP被称为生物的能量货币, 其上储存的高能磷酸键可以直接为生物反应供能。

第5章 弱、强化学键决定大分子的结构

知识点：

1. 强化学键的作用：

答：核酸（DNA/RNA）和蛋白质都是由简单的小分子通过共价键组成的高分子。这些小分子的排列顺序决定了其遗传学和生物化学的功能。 2. 弱化学键的作用：

答：核酸（DNA/RNA）和蛋白质的三维空间构型及它们间的相互作用是由弱的相互作用来决定和维持。除少数特例外，对这种弱的相互作用的破坏（如加热或去污剂），即使不破坏共价键，都将会破坏其所有的生物活性。 3. 蛋白质的四级结构：

答：1级结构（primary structure）：多肽链中氨基酸的线性顺序。 ２级结构（secondary structure）：邻近的氨基酸通过弱的相互作用形成二级结构。最基本的二级结构是α螺旋和β折叠。二级结构可通过计算机做准确预测。 ３级结构（tertiary structure）：多肽链在二级结构基础上形成的空间结构。可用x射线晶体衍射和核磁共振术进行测定。

４级结构（quaternary structure）：多亚基蛋白所形成的结构。

第2篇 基因组的维持 第6章 DNA和RNA的结构

知识点：

1. DNA由多核苷酸链构成：

答：通常DNA最重要的结构特征是两条多核苷酸链（polynucleotide chain）以双螺旋的形式相互缠绕。双螺旋两条单链的骨架是由糖和磷酸基团交替构成的；碱基朝向骨架的内侧，通过大沟和小沟可以接近碱基。DNA通常是右手双螺旋。大沟中有丰富的化学信息。 多核苷酸链以磷酸二酯键为基础构成了规则的不断重复的糖-磷酸骨架，这是DNA结构的一个特点。与此相反，多核苷酸链中碱基的排列顺序却是无规律的，碱基排列顺序的不规则性加上其长度是DNA储存大量信息的基础。

习惯上，DNA序列由5’端（在左边）向3’端书写，一般5’端是磷酸基而3’端是羟基。

2. 双螺旋的两条链序列互补：

答：腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）配对的结果是使两条相互缠绕的链上的碱基序列呈互补关系并赋予DNA自我编码的特性。 3. 碱基会从双螺旋中翻转出来： 答：有时单个的碱基会从双螺旋中突出，这种值得注意的现象叫做碱基翻出（base flipping）。 4. DNA双链可以分开（变性）和复性：

答：当DNA溶液温度高于生理温度（接近100℃）或者pH较高时，互补的两条链就可分开，这个过程称为变性（denaturation）。DNA双链完全分开的变性过程是可逆的，当变性DNA的热溶液缓慢降温，DNA的互补链又可重新聚合，形成规则的双螺旋。由于变性的DNA分子具有复性的能力，因此来源不同的两条DNA分子链通过缓慢降温也可形成人工杂交分子。在第20章里，两条单链核酸形成杂交分子的能力被称为杂交（hybridiztion）。这是分子生物学中几项不可缺少的技术的基础。例如，Southern印迹杂交（第20章）和DNA芯片分析（第18章，框18-1）。

由于双螺旋DNA的光吸收比单链DNA少40%。当DNA溶液温度升高到接近水的沸点时，光吸收值（absorbance）在260nm处明显增加，这种现象称为增色效应（hyperchromicity）；而减色效应则是因为双螺旋DNA中的碱基堆积降低了对紫外线的吸收能力。

吸光度增加到最大值一半时的温度叫做DNA的熔点（melting point）。 5. 连环数由扭转数和缠绕数共同决定：

答：连环数（linking number）是指要使两条链完全分开时，一条链必须穿过另一条链的次数（用Lk表示）。

连环数是扭转数（twist number，用Tw）和缠绕数（writhe number，用Wr表示）这两个几何数的总和。扭转数仅仅是一条链旋绕另一条链的螺旋数，即一条链完全缠绕另一条链的次数。在三维空间里双螺旋的长轴经常重复地自我交叉，这称为缠绕数。 6. 细胞中DNA呈负超螺旋的意义：

答：负超螺旋含有自由能，可以为打开双链提供能量，使DNA复制和转录这样的解离双链的过程得以顺利完成。因为Lk=Tw+Wr，负超螺旋可以让双螺旋扭转数减少，负超螺旋区域因而有局部解旋倾向。因此，与松弛态DNA相比负超螺旋DNA更易于解链。 7. 拓扑异构酶有2种基本类型： 答：拓扑异构酶（topoisomerase）可以催化DNA产生瞬时单链或双链的断裂而改变连环数。 拓扑异构酶Ⅱ通过两步改变DNA连环数。它们在DNA上产生一瞬时的双链缺口，并在缺口闭合以前使一小段未被切割的双螺旋DNA穿过这一缺口。拓扑异构酶Ⅱ依靠ATP水解提供的能量来催化这一反应。相反，拓扑异构酶Ⅰ一步就可以改变DNA的连环数，其作用是使DNA暂时产生单链切口，让未被切割的另一单链在切口接合之前穿过这一切口。与拓扑异构酶Ⅱ相比，拓扑异构酶Ⅰ不需要ATP。 原核生物还拥有一种特殊的拓扑异构酶Ⅱ，通称为促旋酶，它引入而不是去除负超螺旋。 8. RNA的结构与功能：

答：RNA与DNA的3个不同之处：

第一，RNA骨架含有核糖，而不是2’-脱氧核糖，也就是说在核糖的C2’的位置上带有一个羟基。

第二，RNA中尿嘧啶（uracil）取代了胸腺嘧啶，尿嘧啶有着和胸腺嘧啶相同的单环结构，但是缺乏5’甲基基团。胸腺嘧啶实际上是5’甲基-尿嘧啶。

第三，RNA通常是单多聚核酸链。

从功能上讲，mRNA是从基因到蛋白质合成的媒介，tRNA作为mRNA上密码子与氨

基酸的“适配器”，同时，RNA也是核糖体的组成部分；另外，RNA还是一种调节分子，通过和mRNA互补序列的结合对翻译过程进行调控；最后，还有一些RNA（包括组成核糖体的一种结构RNA）是在细胞中催化一些重要反应的酶。 9. 碱基对也可以发生在不相邻的序列中，形成称为“假结”（pseudoknot）的复杂结构。 10. RNA具有额外的非Watson-Crick配对的碱基，如G：U碱基对，这个特征使RNA更

易于形成双螺旋结构。 11. 一些RNA可以是酶类：

答：RNA酶被称为核酶（ribozyme），具有典型酶的许多特性：催化位点、底物结合位点和辅助因子（如金属离子）结合位点。

最早被发现的核酶是RNaseP，一种核糖核酸酶，参与从大的RNA前体生成tRNA。 mRNA前体、tRNA前体和rRNA前体间插序列即内含子（intron）的切除过程称为RNA的剪接（RNA splicing）。 12. RNA的功能有哪些? 答：（1）有些RNA本身就是一种酶,具有调节功能；

（2）RNA是一种遗传物质（主要为病毒的遗传物质）； （3）RNA可以作为基因和蛋白质合成的中间体； （4）RNA可作识别子（如:mRNA）；

（5）RNA可以作为一种调节分子主要通过序列互补结合阻止蛋白质的翻译。

第7章 染色体、染色质和核小体

知识点：

1. 一些概念： 答：（1）染色体（chromosome）：在细胞中DNA是和蛋白质结合存在的，每条DNA及其结合的蛋白质构成一条染色体（chromosome）。 （2）核小体（nucleosome）：DNA与组蛋白结合所形成的结构称为核小体（nucleosome）。 （3）染色体是环状或线状的。

（4）基因组密度的简单衡量方法是每Mb基因组DNA上基因的平均数目。 （5）突变基因和基因片段是由于简单的随机突变或在DNA重组过程中的错误所造成的。假基因则是因反转录酶（reverse transcriptase）的作用而形成。 2. 每个细胞都有特定的染色体数目： 答：大多数真核细胞是二倍体（diploid），也就是说，细胞中每条染色体有两个拷贝。同一个染色体的两个拷贝叫做同源染色体（homolog），分别来自父本和母本。但是，一个真核生物中的所有细胞并非都是二倍体，某些细胞是单倍体或多倍体。单倍体（haploid）细胞每条染色体只有一个拷贝，并且参与有性生殖（例如，精子和卵子都是单倍体细胞）。多倍体（polyploid）细胞中每条染色体都超过两个拷贝。 3. 基因组大小与生物体的复杂性相关：

答：基因组的大小（单倍染色体中DNA的长度）在不同的生物种有相当大的变化。由于生物的复杂性越高所需的基因也就越多。因此基因组的大小与生物体的复杂性相关也就不足为奇。

4. 导致真核细胞中基因密度降低的因素：

答：首先，当生物体的复杂性增加时，负责指导和调控转录的DNA区段——调控序列（regulatory sequence）的长度显著增长；其次，在真核生物种编码蛋白质的基因通常是不连续的。这些分散的非蛋白质编码区段称为内含子（intron）。内含子转录后通过RNA剪接（RNA

splicing）的过程从RNA中删除。

5. 人的基因间隔区序列主要由重复DNA构成：

答：几乎一半的人类基因组由在基因组中重复多次的DNA序列组成。重复DNA一般有两种：微卫星DNA和基因组范围的重复序列。微卫星DNA（microsatellite DNA）由非常短的（小于13bp）串联重复序列构成。基因范围的重复序列（genemo-wide repeat）要比微卫星大得多，尽管这些重复有许多种类，但是它们有着共同的特点，即都是转座元件（transposable element）。

转座元件是指能从基因组的一个位置移动到另一个位置的序列，这个过程称为转座（transposition）。

6. 真核染色体在细胞分裂过程中需要着丝粒、端粒和复制起始位点： 答：（1）复制起始位点（origins of replication）是DNA复制机制集合并起始复制的位点。 （2）着丝粒（centromere）是DNA复制后染色体正确分离所必需的。与复制起始位点相似，着丝粒指导一个精细的蛋白质复合体的形成，此结构也称为动粒（kinetochore）。 （3）端粒（telomere）位于线性染色体的两端。端粒通过一种特殊的DNA聚合酶——端粒酶（telomerase）来完成线性染色体末端的复制。 7. 细胞周期及有丝分裂：

答：细胞完成一轮分裂所需要的过程称为细胞周期（cell cycle）。大多数真核细胞的分裂会使子代细胞维持与父本细胞一致的染色体数目。这种分裂类型称为细胞的有丝分裂（mitotic cell division）。

有丝分裂的细胞周期可以分为4期：G1、S、G2和M。

DNA合成发生在细胞周期的合成期或S期（synthesis或S phase），导致每条染色体的复制。复制后配对的每条染色体叫做一条染色单体（chromatid），配对的两条染色单体称为姐妹染色单体（sister chromatid）。复制后的姐妹染色单体通过一个叫做黏粒（cohesin）的分子聚在一起，这一过程称为姐妹染色单体的聚集（sister chromatid cohesion），这种状态一直维持到染色体的相互分离。

染色体分离发生在细胞周期的有丝分裂期或M期（mitosis，M phase）。 8. 有丝分裂及减数分裂的具体过程： 答：见书P151图7-15和P153图7-16。 9. 核小体是染色体的结构单位： 答：在真核细胞中大多数DNA被包装进核小体。核小体由8个组蛋白所形成的核组成，DNA缠绕在组蛋白核上。每个核小体之间的DNA（“念珠”上的“线”）叫做连接DNA（linker DNA）。

与核小体结合最紧密的DNA叫做核心DNA（core DNA），它像缠绕线轴一样盘绕组蛋白八聚体约1.65圈。

10. 组蛋白是带正电荷的小分子蛋白质：

答：组蛋白是目前所知的与真核DNA相关的丰度最高的蛋白质。真核细胞一般包括5种组蛋白：H1、H2A、H2B、H3和H4。

在每种核心组蛋白中都存在一个保守区域，称为组蛋白折叠域（histone-fold domain），调节这些组蛋白中间体的组装。

一个核小体的组装涉及这些结构单位与DNA有序地结合。首先，H3·H4四聚体与DNA结合；然后两个H2A·H2B二聚体结合到H3·H4-DNA复合体，形成最后的核小体。

每个核心组蛋白有一个N端延伸，称为“尾巴”，这是因为它没有一个确定的结构，而且是完整的核小体中易接近的部分。

11. 许多不依赖于DNA序列的接触介导核心组蛋白与DNA间的相互作用。

12. 组蛋白的N端尾可稳定盘绕在八聚体上的DNA。 13. 染色质的高级结构：

答：组蛋白H1与核小体间的连接DNA结合。

核小体束能形成更复杂的结构：30nm的纤丝。 DNA的进一步压缩涉及到核小体DNA的大环。 组蛋白的变构体影响核小体功能。

14. DNA与组蛋白八聚体的相互作用是一动态的过程。 15. 核小体重塑复合体有助于核小体的移动：

答：组蛋白八聚体与DNA相互作用的稳定性受到大的蛋白复合体——核小体重塑复合体（nucleosome remodeling complex）的影响。这些多蛋白复合体利用ATP水解释放的能量，便于核小体改变位置或与DNA相互作用。这些变化有3中方式：①组蛋白八聚体沿DNA“滑动”（sliding）；②组蛋白八聚体从一个DNA分子到另一DNA分子的完全“转移”（transfer）；③核小体“重塑”（remodeling），增加DNA的易接近性。 16. 某些核小体在体内处于特定的位置：核小体的定位： 答：由于核小体与DNA的动态相互作用，大多数核小体的位置是不固定的。但在有些情况，对核小体的位置，或称为核小体的定位（positioning），进行限制是有利的。 17. 组蛋白N端尾的修饰可改变染色质的易接近性：

答：当组蛋白从细胞中分离出来，其N端尾通常被许多种小分子修饰。在尾部的赖氨酸经常被乙酰基或甲基修饰，而丝氨酸主要受磷酸化修饰。一般来说，乙酰化的核小体与染色体上转录活跃的区域结合，而脱乙酰化的核小体与染色质上转录受抑制的区域结合。与乙酰化不同，N端尾不同部位上的甲基化使核小体可以与抑制的和活化的染色质都能结合，这取决于组蛋白尾上被修饰的特定的氨基酸。 18. DNA复制后核小体立即被组装：

答：当复制叉经过时，核小体解体为亚组装部件。H3·H4四聚体似乎仍随机地与两个子代双螺旋之一结合，并不从DNA上释放而成为游离的成分。相反，H2A·H2B二聚体被释放且进入局部的环境，参与新的核小体的组装。 19. 核小体的组装需要组蛋白“伴侣”：

答：在生理盐浓度下对核小体组装的研究鉴定出一些能指导组蛋白在DNA上组装的因子。这些因子是带负电荷的蛋白质，与H3·H4四聚体或H2A·H2B二聚体形成复合体，并护送它们到核小体组装的位点。由于这些因子可以避免组蛋白与DNA发生无效的相互作用，因此被称为组蛋白伴侣（histone chaperone）。

PCNA形成一个环绕着DNA双螺旋的环，在DNA合成过程中将DNA聚合酶固定在DNA上。当聚合酶作用完成后，PCNA由DNA聚合酶上释放，但仍与DNA相连。在这种情况下，PCNA能与其他蛋白质发生作用。CAF-1与释放的PCNA结合，优先将H3·H4四聚体组装到与PCNA结合的DNA上。 20. 简述染色体的组装过程。

答：在DNA的复制过程中，核小体暂时解体，组蛋白H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体被随机分配到任一子代分子中，在DNA复制后，核小体立即被组装，这涉及到特定的组蛋白伴侣的功能，这些组蛋白伴侣护送H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体到达复制叉。随后，在旧蛋白的“种子”作用下，发生相似修饰，一旦DNA包装成核小体，它有能力借助组蛋白的H1来进行进一步压缩DNA，开成染色质形式（30nm纤丝），在细胞分裂间期，染色质进一步浓缩成染色体。

第8章 DNA的复制

知识点：

1. DNA合成的化学基础：

答：DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物-模板接头。

DNA通过引物3’端的延伸进行合成。 焦磷酸水解是DNA合成的驱动力。 2. DNA聚合酶的作用机制： 答：（1）DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的合成：DNA聚合酶催化核苷酸添加需要正确配对的碱基，空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP。 （2）DNA聚合酶像手一样握住引物：模板接头。

聚合酶的3个结构域被称为拇指、手指和手掌。

手掌域由一个β折叠片构成，含有催化位点的基本元件，尤其是DNA聚合酶的这一区域结合2个二价金属离子（镁离子和锌离子），可以改变正确剪辑配对的dNTP和引物3’-OH周围的化学环境。除了催化作用外，手掌域还负责检查最新加入的核苷酸碱基配对的准确性。

功能：1）有两个催化位点，一个延长链，别一个是把错误的dNTP排除掉，起校对功能；

2）聚合位点有两个金属离子，它们有利于催化的进行； 3）检测配对的准确性。

手指域中的几个残基可与引入的dNTP结合。一旦引入的dNTP与模板之间形成正确的碱基配对，手指域即发生移动，包围住dNTP。

功能：1）结合运进来的dNTP，并带到正确的位子； 2）弯曲模板，让模板碱基与dNTP正确配对； 3）稳定PPi的功能。

拇指域与催化的关联不紧密，而是与最新近合成的DNA相互作用。还有两个目的：第一，维持引物以及活性部位的正确位置；第二，帮助维持DNA聚合酶与其底物之间的紧密连接。

功能：不直接参与催化，但是可保持引物和活性位点处在正确的位置，还可帮助维持DNA聚合酶与其底物紧密连接，有助于添加许多dNTP的能力。 （3）DNA聚合酶是一种延伸酶：

DNA聚合酶的催化是快速的。DNA聚合酶能在引物链上每秒添加1000个核苷酸。DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力。延伸能力（processivity）是酶处理多聚体底物时的一种特性。对于DNA聚合酶，其延伸能力定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数。

（4）外切核酸酶校正新合成出的DNA：

DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸实现的。最初这种类型的酶被认作是DNA聚合酶的同一类多肽，现在则称为校正外切核酸酶（proofreading exonuclease）。这类酶可以从DNA的3’端，即从新DNA链的生长端开始降解DNA。 3. 复制叉上DNA的两条链同时合成：

答：刚分开的模板链与未复制的双链DNA之间的连接区称为复制叉（replication fork），复制叉向着未复制的DNA双链区域连续运动，其身后留下指导两个子代DNA双链形成的两条单链DNA模板。

在此条模板链上，DNA聚合酶简单地尾随着复制叉。此模板指导下新合成的DNA链称为前导链（leading strand）。

另一条单链DNA模板指导下的新DNA链合成遇到的问题较多，此模板指导DNA聚合酶在与复制叉相反的方向上运动。此模板指导的新DNA链称为后随链（lagging strand）。

在后随链上形成的新链DNA短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment），其在细菌中的长度变化为1000~2000个核苷酸，在真核生物中为100~400个核苷酸。 4. DNA新链的起始需要一条RNA引物：

答：引物酶（primase）是一种能在单链DNA模板上制造短RNA引物（5~10个核苷酸长度）的特殊的RNA聚合酶。

5. 完成DNA复制必须除去RNA引物：

答：为了用DNA取代RNA引物，RNA酶H（RNase H）识别并除去各条RNA引物的大部分。

最后一个核糖核苷酸是由从5’端降解RNA或DNA的外切核酸酶除去的。 DNA上的“切口”被称为DNA连接酶（DNA ligase）的酶修复。 6. DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋：

答：DNA聚合酶解离双链DNA的两条碱基配对链的能力很差。因此，在复制叉上，由称为DNA解旋酶（DNA helicase）的另一组酶催化双链DNA两条链的分离。

每个DNA解旋酶在单链DNA上都沿着一定的方向运动。这是所有DNA解旋酶都具有的特性，称作极性（polarity）。

7. 复制前单链结合蛋白使单链DNA稳定：

答：一个SSB的结合会促进另一个SSB与其紧邻的单链DNA结合。这称为协同结合（cooperative binding），其发生是因为与紧邻的单链DNA区域结合SSB分子之间也能够结合。

8. 拓扑异构酶除去DNA解螺旋时在复制叉上产生的超螺旋。 9. 复制叉酶扩大了DNA聚合酶底物的范围。

10. 细胞中DNA聚合酶为行使不同的功能而被特化：

答：E. coli中至少有5种DNA聚合酶，这些酶依据其酶学特性、亚基组成和丰度而划分。DNA聚合酶Ⅲ（DNA Pol Ⅲ）是染色体复制中所涉及的最主要的酶。

DNA聚合酶Ⅰ（DNA Pol Ⅰ）专门用于除去起始DNA合成所需的RNA引物。 E. coli中的另外3种DNA聚合酶特别用于DNA的修复，它们无校正活性。

真核细胞中也有多种DNA聚合酶，通常细胞中有15种以上。其中，对于基因组的复制至关重要的有3种：DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε以及DNA聚合酶α/引物酶。

引物酶合成RNA引物后，所产生的RNA引物-模板接头立即与DNA聚合酶α结合以启动DNA的合成。

因为DNA Pol α/引物酶的延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代。聚合酶δ或聚合酶ε取代DNA Pol α/引物酶的过程称作聚合酶的切换（polymerase switching），这导致在真核细胞复制叉上有3种不同的DNA聚合酶在工作。如同在细菌细胞中那样，真核细胞中其他的DNA聚合酶大多参与DNA的修复。 11. 滑动夹极大地增加了DNA聚合酶的延伸能力：

答：DNA聚合酶在复制叉上具有高延伸能力的关键原因在于它们与被称为滑动DNA夹（sliding DNA clamp）的蛋白质间的结合。

12. 滑动夹通过滑动夹装载器打开并安置在DNA上：

答：一类称为滑动夹装载器（sliding clamp loader）的特殊的蛋白复合体催化滑动夹的打开并将其安放在DNA上。这些酶通过结合ATP并将其水解而将滑动夹置于DNA的引物-模板接头上。

13. 复制叉上的DNA合成： 答：E. coli中，这些聚合酶的协同作用是通过它们连接成一个巨大的多蛋白复合体而实现的。此复合体被称为DNA聚合酶Ⅲ全酶。全酶是对一个具有核心酶并结合有增强其功能的其他

元件的多蛋白复合体的总称。

当解旋酶在复制叉处解开DNA螺旋时，前导链被迅速地复制，同时后随链以单链DNA的形式伸出，并被SSB迅速地结合。新RNA引物在后随链模板上进行不连续的合成。当后随链上的DNA聚合酶完成前面的冈崎片段时，即从模板上释放出来。因为这个聚合酶与前导链上的DNA聚合酶保持着连接，所以它将与距复制叉最近的并且由后随链上最新合成出的RNA引物所形成的引物-模板接头结合。通过与此RNA引物的结合，后随链上的聚合酶形成一个新的环并启动下一轮冈崎片段的合成。这个模型被称作“长号模型”，以比喻由后随链模板所形成的DNA环状结构大小的变化。

14. 复制叉蛋白之间的相互作用形成E. coli的复制体:

答：DNA解旋酶与DNA聚合酶Ⅲ全酶之间的相互作用。这个由全酶的夹子装载器元件介导的相互作用将解旋酶和DNA聚合酶Ⅲ全酶连到一起。

DNA解旋酶与引物酶之间，在约1秒一次的间隔中，引物酶与解旋酶以及SSB覆盖的单链DNA结合并合成新的RNA引物。

复制叉上作用的全部蛋白质的总和称为复制体（replisome）。

15. DNA解旋和复制起始发生的特殊位点称作复制起始位点（origin of replication）。 16. 复制起始的复制子模型：

答：定义所有的DNA均从称为复制子（replicon）的特定的起始位点开始复制。

复制子模型提出了控制复制起始的两个元件：复制器和起始子。复制器（replicator）是指足够指导DNA复制起始的整套顺式作用的DNA序列。

复制子模型的第二个元件是起始子（initiator）蛋白。此蛋白质特异性地识别复制器中的一个DNA元件并激活复制的起始。

17. 复制器序列包括起始子结合位点和容易解旋的DNA：

答：复制器的DNA序列有2个共同的特性。第一，它们含有起始子蛋白质结合位点，此位点是组装复制起始机器的核心；第二，它们含有一段富含AT的DNA，此段DNA容易解旋但并不自发进行。

18. 结合和解旋：起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活：

答：起始子蛋白在复制起始过程中一般执行3种不同的功能。第一，这些蛋白质与复制器中的特异DNA序列结合；第二，一旦与DNA结合，它们就扭曲或解旋其结合位点附近的DNA区域；第三，起始子蛋白与复制起始所需的其他因子相互作用，使它们聚集到复制器上。

以E. coli起始子蛋白DnaA为例。DnaA与oriC中重复的9核苷酸单位元件结合并受ATP的调控。

DnaA还会在复制器所形成的单链DNA上聚集其他的包括DNA解旋酶的复制蛋白。 真核细胞中，起始子时一个被称为起始位点识别复合体（origin recognition complex，ORC）的六蛋白复合体。ORC可识别酵母复制器上称为A元件的保守序列，以及次保守的B1元件。ORC可将其他复制蛋白全部召集到复制器上。所以，ORC具有起始子三项常见功能中的两项：与复制子结合并将其他复制蛋白召集到复制器上。 19. 蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用指导起始过程：

答：起始子（DnaA）结合到oriC并使13核苷酸单位的DNA解旋后，单链DNA和DnaA共同召集双蛋白复合体：DNA解旋酶、DnaB以及解旋酶装载器DnaC。

解旋酶与上面所说的复制叉其他元件之间的蛋白质相互作用指导复制机器其他部分的组装。

20. 前复制复合体的形成指导真核细胞中的复制起始：

答：复制器选择是对指导复制起始的序列进行识别的过程，发生于G1期（早于S期）。此过程导致基因组中每个复制器上都组装一个多蛋白复合体。起始位点激活只在细胞进入S期

后发生，使复制器结合的蛋白复合体启动DNA的解旋和DNA聚合酶的募集。

复制器选择是由前复制复合体（pre-RC）的形成介导的。

pre-RC被两种蛋白激酶（Cdk和Ddk）激活，使复制得以启动。所有的激酶都在G1期失活，只有在细胞进入S期以后才能被激活。

21. 对pre-RC形成和激活的调控使每个细胞周期中仅有一轮复制发生：

答：Cdk对于pre-RC功能的调控有两个似乎矛盾的作用：第一，它们是激活pre-RC以启动DNA复制所必需的；第二，Cdk的活性会抑制新pre-RC的形成。

在G1期内没有有活性的Cdk，但是细胞周期的其他期内（S、G2和M期）一直存在高水平的Cdk。因此，在每个细胞周期内，pre-RC仅仅有一次形成的机会（G1期内），而且这些pre-RC被激活的机会也仅有一次（在S、G2和M期虽然实际上所有的pre-RC都被S期的复制叉激活或破坏）。

22. 子代DNA分子的分离需要拓扑异构酶Ⅱ。 23. 后随链的合成不能复制线性染色体的最末端：

答：所有新的DNA合成启动都需要一条RNA引物，这使线性染色体末端的复制成为难题。这种情况被称为末端复制问题（end replication problem）。

细胞解决末端复制问题有各种各样的方法。一种解决方法是用蛋白质代替RNA作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物。

多数真核细胞使用完全不同的方法来复制其染色体末端。真核生物染色体的末端称为端粒，它们通常由首尾相连的富含TG的重复DNA序列构成。这种独特的结构可作为新的复制起始位点以弥补末端复制问题。

24. 端粒酶是一种新型的DNA聚合酶，它不需要外源模板：

答：端粒酶是一种特殊的酶，它既含有蛋白质成分也含有RNA成分（所以这是一个核糖核蛋白的例子）。与其他所有DNA聚合酶相同的是，端粒酶用于延伸其DNA底物的3’端。但与大多数DNA聚合酶不同的是，端粒酶不需要外源性DNA模板来指导新dNTP的添加，而是利用其RNA成分作为模板，将端粒序列添加到染色体末端的3’端。端粒酶利用其自身的RNA作为模板，特异性地延伸特定单链DNA序列的3’-OH。新合成的DNA为单链DNA。

25. 为什么真核生物染色体在一个周期中只能复制一次？

答：真核细胞分裂所需的事件发生在细胞周期的不同时期。染色体DNA复制仅发生在细胞周期的S期。在此期间，细胞中的所有DNA都必须精确地复制一次。染色体任何部分复制的不完整都可造成染色体之间不适当的连接。互联染色体的分离会引起染色体的断裂或缺失。DNA的重复制也会造成严重后果，使基因组中特殊区域的拷贝数增加。重要调控基因的拷贝数即使增加一个或两个也会导致基因表达、细胞分裂或对环境信号应答的灾难性缺陷。所以，真核细胞每分裂一次，每条染色体中每个碱基对复制且只能复制一次，使极其重要的。

26. 端粒酶如何实现端粒的复制？ 答：端粒酶用其RNA成分与端粒单链DNA区域的3`端退火，随后用其反转录活性合成DNA至RNA模板末端。这时端粒酶将RNA从DNA产物上移去，并重新结合到端粒的末端，重复上面的过程。

第9章 DNA的突变和修复

知识点：

1.突变的本质：

答：最简单的突变是一种碱基变成另一种碱基，有两种类型，转换（transition），即嘧啶到嘧啶和嘌呤到嘌呤的替换，如T到C和A到G；颠换（transversion），即嘧啶到嘌呤和嘌呤到嘧啶的替换，如T到G或A以及A到C或T。另一种简单的突变是一个核苷酸或少量核苷酸的插入或缺失。改变单个核苷酸的突变被称为点突变（point mutation）。

其他类型的突变引起DNA的改变较大，如大范围的插入和缺失以及染色体结构的整体重排。

2.有些复制错误能逃脱校正读码：

答：有些错误插入的核苷酸逃脱检测并在新合成的链与模板链之间形成错误配对。 3.错配修复能将逃脱校正读码的错误去除：

答：保证DNA复制忠实性的最后负责由错配修复系统（mismatch repair system）承担，它将DNA合成精确性又提高了2~3个数量级。

在大肠杆菌中，错配是由错配修复蛋白MutS的二聚体来检测的。MutS扫描DNA，从错配引起DNA骨架的扭曲变形上识别出它们。

E. coli的Dam甲基化酶（DAM methylase）使两条链上的5’-GATC-3’序列中的A残基都甲基化。当复制叉经过两条链的GATC都甲基化（全甲基化）的DNA时，产生的子代DNA双链就是半甲基化的（只有母链是甲基化的）。

甲基化使在复制发生错误的时候，使E. coli修复系统能够从母链上找回正确序列的“记忆”设备。

真核细胞也能修复错误配对，它们使用MutS（MutS类似物称为MSH蛋白）和MutL（MutL类似物称为MLH的PMS）的类似物完成这一功能。 4.DNA的水解和脱氨基作用可自发产生损伤： 答：最频繁和最重要类型的水解损伤时胞嘧啶碱基的脱氨基。胞嘧啶可自发进行脱氨基作用，从而产生非天然的（在DNA中）碱基尿嘧啶。腺嘌呤和鸟嘌呤也易于自发脱氨基，脱氨基将腺嘌呤转变成次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤。DNA还通过N-糖苷键的自发水解进行去嘌呤化（depurination），并在DNA中形成脱碱基位点（即脱氧核糖上没有碱基）。 5’-甲基胞嘧啶脱氨基产生胸腺嘧啶，不能明显被识别为异常碱基。 5.DNA的烷化反应、氧化反应和辐射损害：

答：DNA易于受烷化反应、氧化反应和辐射损害。在烷化反应中，甲基或乙基基团被转移到碱基的反应位点以及DNA骨架的磷酸上。

·

DNA还易受到活性氧簇的攻击（如O2-、H2O2和OH）。这些强烈的氧化剂由致电离辐射和产生自由基的化学试剂产生。

另一种碱基损伤时紫外线造成的。260nm左右波长的辐射被碱基强烈吸收，其后果之一是在同一多核苷酸链相邻位置上的两个嘧啶之间发生光化学融合。

γ辐射和X射线（电离辐射）有很高的危险性，因为它们可使DNA双链断裂，这很难被修复。某些抗癌药物，如争光霉素也能引起DNA的断裂。电离辐射和像争光霉素那样的试剂，因能导致DNA断裂，所以被认为具有诱裂性（clastogenic）。 6.突变还可由碱基类似物和嵌入剂引起：

答：突变还可由可替换正常碱基的化合物（碱基类似物，base analog）或能插入碱基间的化合物（嵌入剂，intercalating agent）导致复制错误而引起。 7.DNA损伤的修复：

答：如我们所看到的那样，DNA的损伤有两种后果。有些类型的损伤，如胸腺嘧啶二聚体或DNA骨架的切口和断裂，使得复制或者转录受阻。其他类型的损伤产生改变了的碱基，在复制上没有立即产生结构性后果，但是引起了错配，这可在复制之后导致DNA序列上永久性的改变。

DNA损伤修复的系统。这些系统最直接的方式是（指真正的修复）修复酶简单地将损伤逆转（撤销）。一个更精致的步骤涉及剪切修复系统（excision repair system），此处受损的核苷酸没有被修复，而是从DNA上被除去。有两种剪切修复，一种仅仅将受损的核苷酸去除，另一种将包含损伤的一小段单链DNA去除。

但是，更精致的系统是重组修复（recombinational repair），当DNA两条链都受损（断裂）时采用这种修复。在重组修复[也叫双链断裂修复（double-strand break repair）]中，序列信息从染色体第二条未受损的拷贝上找回。最后，当DNA聚合酶的复制进程被受损碱基阻碍的时候，一个特殊的移损（translesion）聚合酶以一种不依靠模板和新合成DNA链之间碱基配对的方式经过受损位点进行拷贝。因为移损合成不可避免地具有很高的错误易发性（诱变性），所以细胞在迫不得已的情况下才采用此机制。 8.DNA损伤的直接逆转：

答：损伤简单逆转修复的一个例子是光复活作用（photoreactivation），光复活作用直接逆转紫外辐射造成的嘧啶二聚体结构。

直接逆转的另一个例子是甲基化碱基O6-甲基鸟嘌呤上的甲基被去除。 9.碱基切除修复酶通过碱基弹出机制除去受损碱基：

答：DNA清除受损碱基最普遍的方法是通过修复系统将已变化的碱基除去并替换掉。两种主要的修复系统是碱基切除修复（base excision repair）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）。在碱基切除修复中，一种称为糖基化酶（glycosylate）的酶识别并通过水解糖苷键除去受损碱基。在随后的核酸内切步骤中，产生的脱碱基戊糖从DNA骨架上去除。

在倾向于和A发生错配的oxoG例子中存在一种防故障机制。一种专门的糖基化酶可识别模板链上oxoG配对位置错误掺入A产生的oxoG：A碱基对。然而在这种情况下，糖基化酶会除去A。因此，修复酶把与oxoG配对的A认作突变，并除去虽没有受损但是却不正确的碱基A。

另一个防故障系统的例子是除去与G配对的T的糖基化酶。 10.核苷酸切除修复酶在损伤两侧切割受损的DNA：

答：与碱基切除修复不同，核苷酸切除修复酶不能区分各种不同的损伤，而是识别双螺旋形状上的扭曲。这种扭曲引发一连串的事件，导致含有损伤的一小段单链片段（或小区）被去除。去除修复在DNA上产生的单链缺口由DNA聚合酶用未受损的链为模板进行填补，从而恢复原始的核苷酸序列。

核苷酸切除修复不仅能修复整个基因组中的损伤，而且当RNA聚合酶的转录过程被某个基因中发生的转录（模板）链的损伤所终止时，它还能拯救RNA聚合酶。此现象叫做转录偶联修复（transcription-coupled repair），包括将核苷酸切除修复蛋白募集到受阻的RNA聚合酶上。

11.重组修复通过从未受损DNA中找回序列信息来修复DNA断裂：

答：切除修复用未受损的DNA链作为模板来代替另一条链上已受损的DNA片段。细胞如何修复DNA中双螺旋两条链都断裂的双链断裂呢？这是由双链断裂修复（DSB）途径

[double-strand break（DSB） repair pathway]进行的。此途径从姐妹染色体中取回序列信息。

DNA重组还帮助修复DNA复制中的错误。

异源末端连接（NHEJ）的防故障系统发挥作用。NHEJ不涉及同源重组。取而代之的是，通过断裂末端突出的单链之间错排配对，断裂DNA的两个末端直接相互连接。此错排配对是通过小段（可以短至一个碱基对）互补碱基之间的匹配完成的。 12.移损DNA合成使复制通过DNA损伤继续进行：

答：细胞不能修复损伤，也有防故障机制使复制机器绕过受损的部位。这种机制就叫做移损合成（translesion synthesis）。

移损合成时被一类特化的DNA聚合酶催化的，此酶越过损伤部位直接合成DNA。 这些聚合酶一个重要的性质就是，虽然它们是模板依赖性的，但是它们掺入核苷酸的方式不依赖于碱基配对。

第10章 分子水平上的同源重组

知识点：

1. 同源重组的“模式”都包括以下几个关键步骤： 答：①同源DNA分子的联会。

②引入DNA断裂。

③在两条重组DNA分子之间，形成碱基互补的短片段起始区。当来自于亲本分子的DNA分子单链区域与同源双链DNA分子互补链配对结合时，发生该配对过程，称为链侵入（strand invasion）。链侵入的结果是，两个DNA分子被相互交叉的DNA链联系在一起。这个交叉结构被称为Holliday联结体（Holliday junction）。

④Holliday联结体的剪切。在Holliday联结体处切断DNA重新生成两个分开的双螺旋DNA，从而完成遗传物质的交换过程。这个过程叫做拆分（resolution）。 2. Holliday模型揭示了同源重组的关键步骤：

答：Holliday模型很好地解释了DNA链侵入、分支移位和Holliday联结体拆分等同源重组的核心过程。

3. 双链断裂修复模型更加准确地描绘了许多重组事件：

答：同源重组经常因DNA双链断裂而启动。描述这种遗传交换反应的常用模型是双链断裂修复途径（double-stranded break-repair pathway）。始发事件是两条DNA分子中的一条发生了双链断裂（double-stranded break，DSB），而另外一条保持完整。 在双链断裂模式下，这种单向的遗传物质交流有时会留下一个遗传标记——引发基因转换（gene conversion）事件。

4. DNA双链断裂来自于多事件并启动同源重组：

答：同源重组除了能修复染色体DNA双链断裂外，还能促进细菌间的遗传物质交换。 同源重组是真核细胞中修复DNA断裂和复制叉停滞的关键步骤。 5. RecBCD解旋酶/核酸酶加工用于重组的DNA分子断端：

答：RecBCD酶作用于断裂的DNA分子以产生单链DNA区域，RecBCD也可协助链交换蛋白质RecA结合到单链DNA末端。另外，RecBCD所拥有的多种酶活性提供给细胞一种“选择”，或是与进入细胞的DNA分子发生重组，或是降解它。

RecBCD蛋白的激活受控于一段特殊的chi（cross-over hotspot instigator）DNA序列。 遇到chi位点后，RecBCD的核酸酶活性发生变化。随着RecBCD移入chi位点之外的远端序列，它不再依3’→5’方向剪切DNA，而是以更高的频率剪切另一条5’→3’方向的DNA链。这种变化的结果使一条双螺旋DNA变成有一条凸出的，chi位点位于3’端单链的DNA。这种结构适于RecA蛋白的组装，并引发链交换。

为了让RecA而不是SSB结合到DNA上，RecBCD直接与RecA结合以利于该蛋白质的组装。

6. RecA蛋白在单链DNA上组装并促进链侵入。 7. 在RecA蛋白丝的基础上建立新的配对DNA：

答：RecA催化链交换过程可以分为不同阶段。首先RecA蛋白丝必须组装在其中一个参与的DNA分子上，组装发生在具有单链DNA区域（如单链DNA末端）的DNA分子上。

RecA可促进寻找同源序列，这是因为蛋白丝结构具有两个不同的DNA结合部位：主要位点（结合第一个DNA分子）与次要位点。

当一个碱基互补的区域被定位后，RecA促进这两个DNA分子形成一个稳定的复合体。这个与RecA结合的三链结构被称为连接分子（joint molecule），通常包含杂交数百个碱基对的DNA，实际的链交换就发生在连接分子内。

8. RuvAB复合体特异性地识别Holliday联结体并促进分支移位。 9. RuvC剪切位于Holliday联结体的特定DNA链从而结束重组：

答：尽管RuvC靠识别结构而非特定序列以行使其功能，但RuvC剪切DNA还是有一定程度的序列特异性。

10. 真核细胞的同源重组具有额外的功能：

答：在减数分裂过程中，同源重组确保染色体正确配对，从而保持基因组的完整性。

染色体的不恰当分离，被称之为不分离（non disjunction）。

这种在减数分裂过程中发生的同源重组被称为减数分裂重组（meiotic recombination）。 11. 减数分裂中程序化生成的DNA双链断裂：

答：Spo11蛋白可以在很多染色体位置上切断DNA，它对序列没什么选择性，但却必须发生在减数分裂的一特定时期。

12. MRX蛋白作用于被切开的DNA末端，以组装类RecA的链交换蛋白：

答：3’端DNA链不被降解，所以此DNA处理反应称之为5’→3’端切除。MRX正是通过5’→3’的反应，从而生成长3’端单链DNA，通常可达1kb或更长。MRX酶复合物还被认为能去除与DNA相连的Spo11。

13. Dmc是专一在减数分裂重组中行使功能的类RecA蛋白：

答：真核生物编码两种被充分阐明的、与细菌RecA蛋白同源的蛋白质：Rad51和Dmc1。 14. 多种蛋白质共同促进减数分裂重组：

答：Rad52是另外一个与Rad51相互作用的必要重组蛋白。Rad52启动Rad51 DNA蛋白丝（Rad51的活性形态）的组装。

在真核生物中高度保守的Mus81蛋白，也为减数分裂所必需，或许具有Holliday联结体拆分酶的作用。

15. 交配型转换始于特定位点的双链DNA的断裂： 答：交配型转换始于MAT基因座的双链断裂，这个反应由特异的DNA切割酶——HO内切核酸酶（HO endonuclease）来完成。

HO引起的断裂，其5’→3’的DNA切除反应与减数分裂重组的机制一样。所以，切除依赖于MRX蛋白复合体，并对5’端的DNA链具有特异性，而3’端DNA链保持稳定。一旦生成长3’单链DNA尾巴，它们就结合Rad51和Rad52蛋白（和其他帮助组装重组蛋白-DNA复合体的蛋白质）

交配型的转换是单向性的，即序列信息（尽管并不是真正的DNA片段）从HMR和HML移动到MAT基因座，但是绝对不会从反方向进行。 16. 交配型转换是一种基因转变事件，与交换无关：

答：为解释缺少交换事件的基因转变的机制，提出了一种新的重组模型，称之为依赖合成的链退火（synthesis-dependent strand annealing，SDSA）。首先在重组位点引入DSB，经过链侵入之后，侵入的3’端作为引物启动新的DNA合成。值得注意的是，与DSB修复途径所不同的是，一个完整的复制叉在该处形成。前导链和后随链可同时进行DNA复制，但是与普通的DNA复制不同，新合成的链自模板上置换下来，其结果是新的双链DNA片段被合成，再连接到最初被HO内切酶切断的DNA位点上，并被MRX切除。

新合成的DNA——其亲本DNA分子信息的完全拷贝，替代原有的DNA信息。

17. 重组大致上独立于序列的事实导致一个结论，即任何两个基因间的重组频率和这些基因间的距离成正比。

18. 重组时被修复的DNA可产生基因转变。

第11章 位点特异性重组和DNA转座

知识点：

1. DNA重排的原因：

答：很多重要的DNA重排都是由两类重要的遗传重组造成的：保守性位点特异性重组（conservative site-specific recombination，CSSR）和转座重组（一般称作转座）（transpositional recombination）。

2. 发生在靶DNA上特定DNA序列的位点特异性重组：

答：保守重组的一个关键特性使发生移动的DNA片段都带有短而特殊的序列因子，叫做重组位点（recombination site），在这里可发生DNA交换。

CSSR能够产生3中不同类型的DNA重排：①一个DNA片段在特定位点的插入（如λ噬菌体DNA插入细菌染色体）；②DNA片段的丢失；③DNA片段的到位。

每个重组位点由一对对称排列的重组酶识别序列（recombinase recognition sequence）构成，识别序列中间所包围的是一个短的不对称序列，称为交换区（crossover region），DNA的断裂和重新连接就是在这里发生。

由于交换区是不对称的，所以每个重组位点都带有特定的极性。单个DNA分子上的两个位点所呈现的方向相关性为两者以反向重复（inverted repeat）或同向重复（direct repeat）的方式排列。在一对反向位点间的重组将使这两个位点间的DNA发生倒位；相反，以同样的机制发生在由两个同向重复位点间的重组将会去掉这两个位点间的DNA片段；最后，插入的情况特异性发生在当两个不同分子的重组位点在一起时所发生的DNA交换情况下。在对重组酶进行一个大概地讨论后，将介绍这3中重排类型的几个实例。

3. 位点特异性重组酶通过一个蛋白质－DNA的共价中间体对DNA进行切断和重新连接： 答：保守的位点特异性重组酶共有两个家族：丝氨酸重组酶（serine recombinase）和酪氨酸重组酶（tyrosine recombinase）。

保守性位点特异性重组（CSSR）名称中“保守”的意义：被称为“保守”是因为反应中被断开的每个DNA键都被重组酶重新连接起来，而DNA在被重组酶断开并重新连接的过程中不需要其他的能量，如ATP水解的能量。

丝氨酸重组酶诱导DNA双链断裂及链交换，促成重组。 酪氨酸重组酶每次断裂和结合一对DNA单链。 4. Cre的功能与应用：

答：Cre是P1噬菌体编码的一种酶，其功能是在浸染过程中环化线性的噬菌体基因组。Cre作用于DNA上的重组位点叫lox，Cre-lox是一个由酪氨酸重组酶家族催化重组的简单例子，整个重组仅需Cre蛋白和lox位点。Cre也是在遗传工程中被广泛使用的一个工具。 5. 位点特异性重组的生物学作用：

答：很多噬菌体的感染就是使用这种重组机制将自己的DNA插入到宿主染色体中。还有些时候，位点特异性重组被用来改变基因的表达。

所有反应的关键是重组酶与DNA的结合，即使两个重组位点聚合在一起。对于一些重组反应来说，这个结合过程很简单，仅需要重组酶和它的DNA识别序列，这与Cre的情况一样。与此相反，另外一些重组反应则需要辅助蛋白。这些辅助蛋白包括一些所谓的构筑蛋白（architectural protein），它们结合到特定DNA序列上并使其弯曲，使之成为有利于重组过程进行的特异形状。

6. λ整合酶催化病毒基因组在宿主细胞染色体上的整合和切除： 答：当λ噬菌体侵染宿主细菌时，一系列的调节活动或者导致形成静止的溶原状态（lysogenic

state），或者导致噬菌体的增殖，即进入裂解性生长（lytic growth）过程。

为实现整合，整合酶蛋白（λInt）在两个特定位点之间催化重组的进行，这两个位点叫做att位点，或者附着位点。attP位点在噬菌体上（P代表噬菌体），attB位点在细菌染色体上（B代表细菌）。λInt是一个酪氨酸重组酶，所催化的单链交换机制遵循前面介绍的Cre蛋白的催化过程。然而，与Cre重组不同的是，λ整合需要辅助蛋白的帮助来组装所需的蛋白质－DNA复合体。

整合过程要求attB、attP、λInt，以及一个叫做整合宿主因子（integration host factor，IHF）的构筑蛋白的参与。

7. λ噬菌体的切除需要一个新的折叠DNA蛋白质：

答：一个由噬菌体编码的构筑蛋白对切除重组至关重要，这个蛋白质叫做Xis（即切除），它结合到特定的DNA序列上并造成DNA的弯曲。

除了促进切除过程（attL和attR之间的重组）以外，Xis结合到DNA上也抑制了整合过程（attP和attB之间的重组）。

8. Hin重组酶颠倒一段DNA片段，使得特定基因开始表达： 答：Hin重组是一类重组反应的代表，这些重组在细菌中是相当普遍的，被称为程序性重排。它的功能通常是让一部分细菌能够对周围环境的突然变化获得“预适应”。 9. Hin重组过程需要一个DNA增强子：

答：Hin重组过程除了需要hix位点外，还需要一段序列。这截短短的序列（约60bp）是一个增强子，它能将重组率提高1000倍左右。

增强子-Fis蛋白的复合体激活了重组的催化步骤。Hin可以在没有Fis-增强子复合体存在的情况下与hix重组位点结合、配对，形成联合复合体。 10. 重组酶将多聚环形DNA分子转换成单体：

答：位点特异性重组对细胞中环状DNA分子的维护起到关键作用。

Xer重组酶催化了细菌染色体以及很多细菌质粒的单体化过程。Xer是酪氨酸重组酶家族的一个成员，它的重组机制与前面讲过的Cre蛋白很相似。Xer是一个异源四聚体，包含两个XerC蛋白亚基和两个XerD蛋白亚基。Xer催化的重组位点必须要包含这两种识别序列。该位点在细菌染色体上叫做dif位点。

当FtsK蛋白存在并与XerCD复合体发生相互作用后，复合体的构象发生改变，XerD蛋白被激活。这时，XerD催化第一对单链的重组，产生Holliday联结体；反应完成后，XerC催化第二对单链的交换反应，产生重组后的DNA产物。

FtsK是一个膜结合蛋白，它被定位于细胞中发生细胞分裂的地方，其作用是在细胞分裂前将DNA从细胞中央移开，使细胞可以正常分裂。 11. 转座：

答：转座是一种特殊的遗传重组，它是将特定的遗传因子从DNA上的一个地方移位到另一个地方。这些可以移动的遗传因子叫做转座因子（transposable element）或转座子（transposon）。

三类基本的转座因子：

根据转座子的结构及其转座机制，可将其分为以下3个家族： 1. DNA转座子。

2. 类病毒反转录转座子，包括反转录病毒。这些因子又称为LTR反转录转座子。 3. 聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子。这类因子又称为非病毒反转录转座子。 12. DNA转座子上带有一个转座酶基因，两端是重组位点：

答：转座因子两端的重组位点以反向重复序列排布，这些末端反向重复序列的长度从25到几百碱基对不等。催化转座的重组酶通常叫做转座酶（transposase）[有时也叫整合酶

（integrase）]。

DNA转座子带有编码自己的转座酶的基因，也可能会携带一些其他基因，这些基因编码的蛋白质可能调节转座，也可能为转座因子或宿主细胞提供一些有益的功能。 13. 转座子包括自主转座子和非自主转座子：

答：带有一对末端反向重复序列和一个转座酶基因的DNA转座子，本身具备了催化自身转座的所有条件，这类因子叫做自主转座因子（autonomous transposon）。然而，在基因组上还有很多比较简单的可移位DNA片段，叫做非自主转座子（nonautonomous transposon），它们仅有末端反向重复序列，即转座所需的cis-acting序列。细胞中自主转座子表达的转座酶会识别这些末端反向重复序列，从而帮助非自主转座因子发生移位。

14. 类病毒反转录转座子和反转录病毒带有末端重复序列和两个对重组很重要的基因： 答：类病毒反转录转座子和反转录病毒也带有反向末端重复序列，它们是重组酶结合和作用的位点。类病毒反转录转座编码联众移位所需的蛋白质：整合酶（转座酶）和反转录酶。 15. 像基因的聚腺苷酸反转录转座子：

答：聚腺苷酸反转录转座子没有其他转座子所带的末端反向重复序列，反而，它的两端含有完全不同的序列成分。一端称为5’UTR（非翻译区），另一端是3’UTR，它带有一串叫做聚腺苷酸序列（poly-A sequence）的A-T碱基对。 反转录转座子带有两个基因，ORF1和ORF2。 16. DNA转座的剪切－粘贴机制：

答：DNA转座子非复制性移位的机制。这个重组过程包括转座子从DNA上初始位置的切除以及将这个切下来的转座子整合到一个新的DNA位点，因此把这个机制叫做剪切－粘贴转座（cut-and-paste transposition）。

一旦转座酶识别了这些序列，它就将这两端聚集在一起形成一个稳定的蛋白质-DNA复合体，这个复合体被称为联合复合体（synaptic complex）或转座体（transpososome）。

下一步是将转座子DNA从基因组的原始位置上切除。转座子上的转座酶亚基先断裂转座子两端的一条单链。转座酶切断DNA后，转座因子DNA末端带有游离的3’羟基基团。两端的另一条DNA单链也需要被切断，而不同的转座子断裂这第二条单链的机制各不相同。

转座子被切除后，被转座酶首先释放的3’端羟基对新插入位点的DNA磷酸二酯键进行攻击，被攻击的DNA片段叫靶DNA（target DNA）。

剪切－粘贴转座中的中间体由缺口修复来完成。

不同的转座子催化第二条单链断裂反应的机制这里介绍3种方法： 非转座酶可用来断裂非转移单链。

断裂非转移链的其他方法由转座酶自身完成，它用一种不常见的DNA酯基转移机制，其过程与DNA单链转移相似。例如，在Tn5和Tn10转座子断裂非转移链时就产生一个“DNA发卡”结构。

然后发卡DNA的末端被转座酶断裂（打开），产生一个标准的双链DNA断裂，打开反应在转座子DNA两端同时进行。

转座子两端DNA的断裂也可以通过一个酯基转移反应完成，这是转座子断裂非转移链的第三种机制。在这种断裂中，一个断裂的3’端攻击转座因子上同一单链的另一端，产生的DNA中间体进一步反应得到切除的转座子。 17. DNA的复制性转座：

答：复制性转座的第一步是转座酶蛋白和转座子DNA两端装配成一个转座体。

第二步是转座子末端DNA的断裂。

然后，转座子DNA的3’－OH末端通过DNA单链的转移反应被连接到靶DNA位点上。但是，这里产生的中间体是双交叉的DNA分子。在此中间体中，转座子的3’端被共

价连接到新的靶位点，而5’端仍连在原处。

中间产物的两个DNA交叉成为一个复制叉结构。以断开的靶DNA 3’端为引物进行DNA合成，复制过程一直进行到第二个交叉处，此复制反应产生2个拷贝的转座子DNA，复制产物两端是短小的正向排列靶位点重复序列。

复制性转座常常会造成染色体的倒位和丢失。

18. 类病毒反转录转座子和反转录病毒通过一个RNA中间体实现移位：

答：类病毒反转录转座子和反转录病毒插入到宿主细胞基因组的新位点，所用的DNA断裂及DNA单链转移步骤与前面讲的DNA转座相同。但不同的地方时，这些反转录因子的重组需要一个RNA中间体的参与。

转座周期开始于反转录转座子（或反转录病毒）DNA序列在细胞内的RNA聚合酶的催化下转录得到RNA。转录起始于LTR中的一个启动子序列，一直穿过整个因子得到转座因子的一个几乎全长的RNA拷贝，然后RNA反转录成一个双链DNA分子，这个DNA分子叫做cDNA（复制的DNA），它游离于宿主DNA序列之外。

这个cDNA能够被整合酶（与DNA因子的转座酶高度相关的一种蛋白质，下面将会看到）识别并被重组到一个新的靶DNA位点。整合酶结合到cDNA的一端，然后从每条单链的3’端切下几个核苷酸，这个断裂反应与DNA转座子的DNA断裂步骤相同。

DNA转座酶和反转录整合酶同属于一个蛋白超家族。

19. 聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子通过一种“反向剪切”机制进行移位：

答：聚腺苷酸反转录转座子，如人的LINE因子的移位需要一个RNA中间体，但其转座机制与类病毒转座因子有所不同，它的机制叫做靶位点引导反转录（target site primed reverse transcription）。首先是细胞内RNA聚合酶对整合因子的转录。尽管启动子在5’UTR内，这是它能指导RNA合成起始于转座因子序列的第一个核苷酸。

新合成的RNA被转运到细胞质中翻译成ORF1和ORF2两个蛋白质。这些蛋白质保持与编码它们的RNA相结合。

这个蛋白质-RNA复合体重新进入核内并与细胞DNA结合。 20. 转座子及其调节的实例：

答：IS4家族的紧密型转座因子通过多种机制实现对拷贝数的控制。

Tn10的转座伴随着细胞DNA的复制。

Mu噬菌体通过靶位点免疫来避免其转座到自身DNA上。 Tc1/mariner因子是真核细胞中极其成功的DNA转座因子。 酵母Ty因子转座到基因组的安全港。

LINE因子能够推动自身转座，还能转座细胞RNA。

21. V（D）J重组中的早期活动是通过一种类似于转座子切除的机制实现的。

第3篇 基因组的表达 第12章 转录机制

知识点：

1. 转录机制与复制机制的区别： 答：（1）转录得到的新链是由核糖核苷酸组成的，而不是脱氧核糖核苷酸。

（2）RNA聚合酶（RNA polymerase，催化RNA合成的酶）不需要引物，它能够从头起始转录（尽管，如我们将要讨论的，细胞内的转录必须在特定的序列上才能起始）。

（3）RNA产物不与模板DNA链的碱基保持互补状态。

（4）转录尽管是非常精确的（每添加10 000个核苷酸会发生一次错误），但还是不如复制更为精确（每10 000 000个核苷酸发生一次错误）。 （5）转录仅是有选择性地复制基因组的特定部分，并从任何特定的部分产生一个到几百个，或者甚至上千个拷贝。

（6）转录区域的选择并不是随机的；每个转录区域通常包括一个或多个基因，而且在每个转录区域的首端和尾端都存在特定的DNA序列指导转录的起始和终止。 2. RNA聚合酶具有不同形式：

答：细菌只有一种RNA聚合酶，而真核细胞中则有3中：RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）是负责转录大多数基因的酶——实际上，是转录几乎所有蛋白质编码基因的酶。聚合酶Ⅰ（Pol Ⅰ）和聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）分别参与转录专门的RNA编码基因。具体来说，Pol Ⅰ转录的是大核糖体RNA前体基因，而Pol Ⅲ转录的是tRNA的基因、一些小的核RNA的基因和5S rRNA的基因。

3. 为转录一个基因，RNA聚合酶要进行一系列定义明确的步骤，这些步骤分为3个阶段

（phase）： 答：（1）起始（initiation）：启动子（promoter）是最初结合RNA聚合酶的DNA序列（在很多情况下是与转录起始因子一起结合的）。启动子-聚合酶复合体一旦形成就发生结构改变，以使起始过程继续进行。 （2）延伸（elongation）：一旦RNA聚合酶已经合成了一小段RNA（10个碱基左右），转录便进入了延伸阶段。这一转变需要聚合酶构象的进一步改变，以使其能够更牢固地与模板结合。在延伸阶段，RNA聚合酶除催化RNA的合成外，还执行着多项重要任务。它解开前方的DNA，又使后方的DNA重新复性；在移动的同时，逐步分开正在延长的RNA链与模板的配对；而且还执行校正的功能。 （3）终止（termination）：一旦RNA聚合酶转录了整个基因（或整组基因），它必须停下来并释放RNA产物。这一步骤称为终止。在某些细胞中，存在着特定的、已研究清楚的引发终止的序列；而在其他一些细胞中，是什么使聚合酶停止转录并从模板上分离，还不十分清楚。

4. 转录起始包括三个定义明确的步骤：

答：转录周期（transcription cycle）的第一个阶段——起始又可以分为一系列定义明确的步骤。

第一步是聚合酶与启动子初步结合形成所谓的闭合式复合体（closed complex），这时DNA还保持着双链状态，聚合酶结合在螺旋的一个面上。

第二步是闭合式复合体经过转变而成为开放式复合体（open complex），DNA双链在起始位点周围大约14bp的距离内分开以形成转录泡。

第三步，最初的大约10个左右的核糖核苷酸的结合是一个效率相当低的过程，在这一阶段，聚合酶经常释放出很短的转录物（每一个都短于10个左右的核苷酸），然后再重新开始合成。一旦某个聚合酶超过了10bp，就可以说它逃离了启动子。这时，它已经形成了一个稳定的三重复合体（stable ternary complex），包括酶、DNA和RNA。 5. 细菌的启动子在强度和序列上是多样的，但是具有某些明确的特征：

答：一个称为ζ的起始因子的添加，使得核心酶转变为只在启动子处起始转录的形式。该酶的这种形式称为RNA聚合酶的全酶（holoenzyme）。

在大肠杆菌中，最常见的ζ因子称为ζ70。含有ζ70的聚合酶识别的启动子具有以下共同的特征性结构：两段6个核苷酸长的保守序列，被长为17~19个核苷酸的非特异序列所分割。这两段序列称为﹣35和﹣10区域（region）或元件（element）。

具有与共有序列更近似的序列的启动子通常要比那些匹配较差的启动子“更强”。所谓启动子的强度，我们是指一个启动子在一定的时间内可以起始多少个转录物。

在一些较强的启动子中，如在指导核糖体RNA（rRNA）基因表达的启动子中，发现了一个额外的与RNA聚合酶结合的DNA元件，称为UP元件（UP-element）。它可以通过提供额外的特异性相互作用而增强聚合酶与DNA的结合。

另一类型的ζ70启动子缺乏﹣35区域，而是由一个所谓的“延长的﹣10区域”元件。 6. σ因子介导聚合酶与启动子的结合：

答：ζ70因子可以分为4个区域，称为ζ区域1~ζ区域4。

区域4内的两个螺旋形成一个常见的DNA结合基序，称为螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix）。其中一个螺旋插入到﹣35区域的大沟（major groove）中并与该区的碱基相互作用；另一个则从大沟的顶部横过，与DNA骨架接触。

﹣10区域也被一个α螺旋所识别。但是其相互作用尚未彻底研究清楚而且更为复杂。 延长的﹣10元件，如果存在的话，被ζ区域3中的一个α螺旋所识别，此螺旋与组成这一元件的两个特异性的碱基对接触。

与启动子内的其他元件不同，UP元件并不被ζ因子所识别，而是由α亚基的羧基末端域（αCTD）来识别。

7. 向开放式复合体的转变过程涉及RNA聚合酶和启动子DNA的结构变化：

答：从闭合式复合体到开放式复合体的转变过程涉及聚合酶的结构变化，以及DNA双链的打开，从而暴露出模板链和非模板链。相对于转录起始位点而言，这一“融化”发生在﹣11和﹢3之间的区域。

对于含有ζ70因子的细菌聚合酶，这一转变常被称为异构化作用（isomerization）。 首先，位于聚合酶前部的钳子牢固地钳压在下游DNA上；第二，ζ的N端区域（区域1.1）的位置有一个重要的移动，在未结合DNA时，ζ区域1.1处于全酶的活性中心裂隙内部，阻断着开放式复合体中模板DNA链经过的路线。在开放式复合体中，区域1.1移动了大约50?的距离，出现在酶的外部，使得DNA可以进到裂隙中。 8. 转录由RNA聚合酶起始，不需要引物：

答：聚合酶必须与起始核苷酸建立特异性的相互作用，严格控制其处于正确的方向，使其可以对引入的核苷三磷酸开始进行化学反应。此相互作用对A是特异的，因而只有以A开始的链才能以适于高效起始的方式固定。

9. RNA聚合酶在进入延伸阶段之前会先合成几段短的RNA：

答：一旦核苷酸进入了活性中心裂隙并且RNA开始合成，接下来就进入了称为流产性起始（abortive initiation）的时期。在这一阶段，聚合酶会合成一些长度小于10个核苷酸的RNA分子。

ζ因子的一个区域再一次作为一个分子模拟物参与了此过程。这一次是区域3.2，模拟的是RNA。ζ的这一区域位于开放式复合体的RNA出口通道的中部，为了使合成长度超过大约10个核苷酸的RNA链，ζ的这一区域必须从此位置上被逐出，这个过程需要聚合酶尝试几次才能成功。

10. 延伸聚合酶是一个边合成边校对RNA的向前行进的机器：

答：DNA通过延伸酶的形式与通过开放式复合体相似，双链DNA在两个钳子之间进入酶的前部。在催化裂隙的开口处，两条链分别沿着不同的路径穿过酶，然后从各自的通道离开酶，并在延伸聚合酶（elongation polymerase）的后面重新形成双螺旋结构。核苷酸通过其固定的通道进入活性位点，并在模板DNA链的引导下添加到增长中的RNA链上。

除了所有这些功能外，RNA聚合酶还执行着两项校对（proofreading）功能。第一个称为焦磷酸化编辑（pyrophosphorolytic editing）。在这一情况下，聚合酶利用它的活性位点，

的表达。如：Rb就通过上述方式抑制哺乳动物转录活化子E2F；而Rb的磷酸化可释放E2F，激活目标基因的表达。

（2）活化子被运输到细胞核去发挥作用： 没有被活化时，许多活化子和抑制子停留在细胞质中，信号刺激使它们进入细胞核去发挥调控作用。

（3）激酶级联放大（A cascade of kinase）过程最终引起核内调节子的磷酸化。 （4）活化的受体被蛋白酶切割，受体的c-末端部分进入细胞核并激活调控子。 24. “共抑制子”和“共活化子”： 答：“共抑制子”和“共活化子”通常指任何辅助性蛋白，既非转录机器的一部分，其自身也不是与DNA结合的调节子，但是却参与基因的转录调节。此概念也指其他对核小体具有修饰功能的复合物。

25. DNA修饰导致的基因“沉默”： 答：转录可以通过DNA甲基化而被沉默。DNA甲基化是由DNA甲基化酶（DNA methylase）所催化。DNA序列的甲基化能抑制（DNA序列与）蛋白质结合，包括转录机器，因而阻断基因的表达。但是甲基化也可以通过其他途径抑制表达：有些序列只有在被甲基化后才能被特异的抑制子识别，这种识别随后关闭附近的基因，通常由募集组蛋白脱乙酰酶来实现。 3个编码沉默调节蛋白的基因，即SIR2、SIR3和SIR4（SIR代表silent information regulator）。这3个基因所编码的蛋白质形成一个复合物，与沉默状态的染色质结合，其中Sir2是一种组蛋白脱乙酰酶。

26. 组蛋白修饰和组蛋白密码子假说：

答：有人提出存在组蛋白密码子（histone code）。依照这种意见，组蛋白尾部不同形式的修饰可以被“阅读”，因为具有不同的内涵。这些“内涵”在部分程度上是由染色质密度及形式被修饰后的直接效应所导致的。此外，某一特定位点的独特形式的修饰，将会募集特异的蛋白质。

27. 在哺乳动物中，DNA甲基化与沉默状态的基因有关。

28. 即使起始信号已不存在，基因表达的某些状态仍随着细胞分裂遗传： 答：一个细胞在发育过程中释放的信号引起邻近细胞中某些特异的基因的开启。这些基因在细胞中有可能要保持开启状态，至很多细胞代，即使诱导这些事件的信号仅仅出现很短一段时间。在缺乏突变和起始信号的情况下，这种基因表达模式的遗传叫做表观调节（epigenetic regulation）。

核小体与DNA修饰是表观遗传的基础。以某基因由于局部组蛋白甲基化而关闭为例。当该区域的染色体在细胞分裂时背复制，源于亲代DNA分子的甲基化的组蛋白被均分至两个子代的双链DNA中。因此，每个子代分子携带有一些甲基化的和非甲基化的核小体。甲基化的核小体募集携带有染色质域的蛋白质，包括组蛋白甲基化酶本身。而后者随后可以甲基化邻近尚未被修饰的核小体。完全缺乏甲基化组蛋白的子链（即来源于未甲基化的亲代DNA）不能募集甲基化酶。这样，染色质修饰状态可以世代得以维持。

DNA甲基化可以更可靠地遗传。因此，某些DNA甲基化酶，可以以比较低的频率甲基化先前未被修饰的DNA，所谓的维持性甲基化酶（maintenance methylase）修饰半甲基化的DNA这种结构来自于完全甲基化的DNA的复制。 29. 真核转录起始后的基因调控：

答：有些活化子调控转录延伸过程，而不是转录起始过程。 真核细胞也有转录延伸因子（elongation factor），调控蛋白可通过控制延伸因子而进行转录延伸调控。

30. 可变剪接调控可以使一个基因在不同细胞内产生不同的蛋白质产物：可变剪接调控与个

体发育紧密相关： 答：果蝇的性别决定：

果蝇性别由X染色体与常染色体（A）的比决定：

X染色体编码2个转录活化子：SisA和SisB，它们控制Sxl（Sex-lethal，性别致死）基因的表达。

雌性（2X：2A）产生2X SisA和SisB。 雄性（1X：2A）产生1X SisA和SisB。 Dpn（Deadpan，冷漠），Sxl基因的抑制子，由一个体染色体编码。 Sxl是一个剪接调控蛋白，它控制自身和一个下游蛋白Tra的剪接。

Tra也是一个剪接调控蛋白，它调节Dsx（double sex）pre-mRNA的剪接。

在Tra存在与不存在时，Dsx不同的剪接异构体编码2种不同的调节蛋白，它们分别控制雌、雄特异的基因表达。

性染色体和常染色体的基因共同决定果蝇的性别分化： Dpn由常染色体编码，是Sxl基因的抑制子。活性受控于X染色体编码2个转录活化子：SisA和SisB→（转录调控）Sxl→（剪接调控）Tra→（剪接调控）Dsx不同的剪接异构体，分别控制雌、雄特异的基因表达。

31. 真核基因调控也可以发生在翻译水平：

答：Gcn4是一种转录活化子，它调节编码有关氨基酸生物合成相关酶的基因表达。

在低水平氨基酸时，Gcn4 mRNA得到翻译（因而合成有关氨基酸生物合成的酶）；而在高水平氨基酸时，Gcn4 mRNA不能得到翻译。

酵母活化子Gcn4的可读框上游包含4个其他可读框（uORF）。最上游的一个ORF先翻译。当氨基酸缺乏时（饥饿状态），重新启动翻译机器需要更长的时间，因而它更容易到达Gcn4的ORF完成翻译过程。当氨基酸充足时（非饥饿状态）重新启动翻译机器的过程在中间的ORF完成，然后与RNA脱离，Gcn4得不到翻译。 32. RNAi: 答：（1）RNAi的概念：

RNAi（RNA interference，RNAi）：双链RNA抑制其同源序列基因的表达。 （2）RNAi机制：

从双链RNA产生的小干扰RNA（Short interfering RNA，siRNA）可以指导细胞机器以不同的方式关闭基因的表达。 （3）RNAi沉默机制： ①降解靶标mRNA；

②抑制靶标mRNA的翻译； ③引起靶标启动子的转录沉默。 （4）RNAi机制的核心成分：

①Dicer：一种类似RNaseⅢ的核糖核酸酶，它首先将进入细胞内的dsRNA降解为小的片段，成为短的干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）或微小RNA（microRNA，miRNA）。Dicer还可协助这些小的RNA分子与RISC的结合。

②RISC（RNA induced silencing complexes，RNA诱导的沉默复合体）：一种大的多亚基蛋白复合物，引导与其结合的siRNA或miRNA跟靶标结合并抑制基因表达。 33. siRNA在哺乳动物中的应用：

答：将外源siRNA转染到细胞内（瞬时表达）：

（1）化学合成：昂贵；

（2）用T7启动子体外转录pre-miRNA；

（3）体外转录长的dsRNA后再用E. coli RNase Ⅲ或RNase Ⅲ-like DICER切割成siRNA，在培养细胞或动物模型中的表达；

（4）通过pol Ⅲ启动子体内转录质粒上的siRNA。 34. pol Ⅲ启动子表达发夹RNA（hairpin RNA，shRNA）： 答：（1）从U6到H1 RNAP Ⅲ启动子处的转录已经很清楚，RNAPⅢ转录终止信号很确定（TTTTT）且转录产物无多余的无关序列。

（2）这些启动子在各种组织中的转录效率非常高。 35. 在培养细胞或动物模型中表达siRNA： 答：（1）构建可以长时间观察的可诱导表型。

（2）构建稳定表达的工程细胞，用于体内外的检测，如异种移植模型（xenograft model）中肿瘤细胞血管生成或转移的潜在因素研究。

（3）在转基因鼠中快速地制造亚等位基因（hypomorphic allele）。

（4）将shRNA与高效的基因传递载体结合，产生基于RNAi的治疗，如特异地沉默引起的基因突变。

36. RNAi的研究应用：反向遗传学的新策略及基因敲除的新方法：

答：在反向遗传学（reverse genetics）中用于鉴定基因的细胞学或生物学功能。

与基因组学（genomics）相结合，进行基因组的筛选，发现新的功能基因。 37. RNAi在治疗上的应用：发明新药和进行基因治疗的新策略：

答：siRNA可通过摧毁病毒特异性的mRNA而起到抗病毒的目的。如HIV和HBV的治疗。 siRNA可通过下调癌症相关基因的表达而抵御癌症。 38. 微小RNA及其加工：

答：微小RNA（MicroRNA，miRNA）：一类非编码的小分子RNA（~21-23nt），茎环结构的RNA前体（~70-90nt）经Dicer加工剪切而成。miRNA在动植物细胞中以RNA蛋白质复合物的形式广泛存在，被称为miRISC。因为miRNA可导致与其同源的靶标mRNA的降解和翻译抑制，表明它在表达调控中有重要作用。

miRNA加工：Pri-miRNA（miRNA初级转录产物——Pri-miRNAs含有5’帽子和3’poly（A）尾，都含有茎环结构）→经过Drosha加工得到pre-miRNA（miRNA前体）→经过Dicer加工得到miRNA。

人Drosha和Dicer有相同的RNaseⅢ结构域和dsRNA结合域。 39.

在一个简单的逆向反应中，通过加入PPi，催化错误插入的核糖核苷酸的去除。在第二种称为水解编辑（hydrolytic editing）的校对机制中，聚合酶倒退一个或更多的核苷酸并切开RNA产物，去除掉错误的序列。

11. 转录是由RNA序列内部的信号终止的：

答：称为终止子（terminator）的序列引发延伸聚合酶从DNA上脱离并且释放出它已经合成的RNA链。在细菌中，终止子有两种类型：Rho-非依赖型（Rho-independent）和Rho-依赖型（Rho-dependent）；第一种类型不需要其他因子的参与就可以引发聚合酶的终止反应（termination）；第二种类型，顾名思义，需要一个称为Rho的额外的蛋白质来诱发终止反应，我们将依次讨论者两种类型的终止子。

Rho-非依赖型终止子也称为固有终止子（intrinsic terminator），由两个序列元件组成：一段短的反向重复序列（大约20个核苷酸），其后是一段大约8个A：T碱基对的序列。

Rho是一个具有6个相同亚基的环状蛋白质，在单链RNA离开聚合酶时与之结合。此蛋白质还具有三磷酸腺苷水解酶（ATPase）的活性：一旦与转录物结合，它就利用ATP水解产生的能量将RNA从模板和聚合酶上拽下来。

首先，Rho结合的位点有某种特异性（所谓的rut位点，即Rho utilization）。特异性的第二层次是Rho无法与任何正在被翻译的转录物（也就是被核糖体结合的转录物）结合。 12. 真核生物的转录：

答：真核生物有三个不同的聚合酶（Pol Ⅰ、Pol Ⅱ和Pol Ⅲ），而细菌只有一个。还有，细菌只需要一个额外的起始因子（ζ），而真核生物中有效的和启动子特异的起始则需要几个起始因子。这些起始因子称为通用转录因子（general transcription factor，GTF）。

在体内，真核细胞内的DNA模板是整合在核小体内的。在这种环境下，通用转录因子就无法启动有意义的表达，而是需要额外的因子参与，包括所谓的“中介蛋白复合体”（mediator complex）和DNA结合调节蛋白，并常常包括染色质修饰酶。 13. RNA聚合酶Ⅱ的核心启动子是由4个不同序列的元件组合而成的：

答：真核细胞的核心启动子（core promoter）是指在体外检测时，Pol Ⅱ机器精确地起始转录所需要的最少的一组序列元件。在Pol Ⅱ核心启动子中发现的4个元件分别是TFⅡB识别元件（TFⅡB recognition element，BRE）、TATA元件（或盒子）、起始密码子（initiator，Inr）和下游启动子元件（downstream promoter element，DPE）。 在核心启动子之外（而且通常是在其上游）存在一些在体内进行有效转录所需的其他序列元件。这些元件包括：启动子最近元件（promoter proximal element），上游激活物序列（upstream activator sequence，UAS），增强子（enhancer），以及一系列的称为沉默子（silencer）、边界元件（boundary element）和绝缘子（insulator）的抑制元件。 14. RNA聚合酶Ⅱ在启动子上和通用转录因子形成前起始复合体： 答：许多Pol Ⅱ启动子包含一个所谓的TATA元件（大约在转录起始位点上游30个碱基对）这是前起始复合体开始形成的位置。TATA元件是由叫做TFⅡD的通用转录因子所识别的。TFⅡD中与TATA序列结合的成分称为TBP（TATA binding protein）。此复合体中的其他亚基称为TAF，即TBP关联因子（TBP-associated factor）。

形成的TBP-DNA复合体提供了一个平台，把其他通用转录因子和聚合酶本身招募到启动子上。在体外，这些蛋白质按照下列顺序在启动子处组装：TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF与聚合酶一起，然后是TFⅡE和TFⅡH，它们将结合在Pol Ⅱ上游。包含这些成分的前起始复合体形成后，启动子就开始解旋。与细菌中的情形相反，真核细胞中的启动子解旋需要ATP的水解并由TFⅡH介导，是该因子的类解旋酶活性刺激了启动子DNA的解开。

在真核细胞中，逃离启动子包含一个在细菌中所没有见到的步骤：聚合酶的磷酸化作用：Pol Ⅱ的大亚基有一个C端域（CTD），延伸成一个“尾巴”。CTD包含一连串重复的七肽

序列：Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser。每一个重复序列都包含特定蛋白激酶的磷酸化位点，其中一个激酶就是TFⅡH的一个亚基。

15. TBP用一个插入双螺旋小沟的β折叠来结合并扭曲DNA：

答：TBP依赖TATA序列能够经受特殊的结构扭曲的能力而对其进行选择。 A：T碱基对是更有利的，因为它们更易于被扭曲而使小沟开始开放。 16. 其他通用转录因子在起始中也有特殊作用：

答：TAF：TBP与大约10个TAF相关。两个TAF在启动子处结合DNA元件，如起始密码子元件（Inr）和下游启动子元件（DPE）。几个TAF与组蛋白有结构同源性。另一个TAF似乎调节TBP与DNA的结合。

TFⅡB：此蛋白质为一条多肽单链，在TBP之后进入前起始复合体。特殊的TFⅡB-TBP和TFⅡB-DNA联系间的碱基特异性相互作用。TFⅡB在前起始复合体中也与Pol Ⅱ接触。因而，此蛋白质似乎是连接结合了TATA的TBP与聚合酶之间的桥梁。TFⅡB的N端域与细菌中ζ3.2相似的方式插入Pol Ⅱ的RNA出口通道。

TFⅡF：这个双亚基因子与Pol Ⅱ结合并与Pol Ⅱ（以及其他因子）一起被募集到启动子上。Pol Ⅱ与TFⅡF的结合起着稳定DNA-TBP-TFⅡB复合体的作用，并且是TFⅡE和TFⅡH被募集到前起始复合体上的前提条件。

TFⅡE和TFⅡH：TFⅡE与TFⅡF相似，由两个亚基构成，它是下一个结合到前起始复合体上的，并参与TFⅡH的募集以及调节。TFⅡH控制着依赖ATP的从前起始复合体向开放复合体的转变。TFⅡH内有两个亚基具有ATP酶的功能，还有一个亚基是蛋白激酶，参与启动子的解旋和逃离，与其他因子一起，ATP酶亚基还参与核苷酸错误匹配的修复。 17. 体内的转录起始需要其他蛋白质参与，包括中介蛋白复合体：

答：细胞内高水平的、受调节的转录还额外需要中介蛋白复合体和转录调节蛋白，并在很多情况下需要核小体修饰酶（其自身常常是大的蛋白质复合体的组成部分）。 18. 中介蛋白包含很多亚基，其中有些亚基从酵母到人类是保守的：

答：酵母和人的中介蛋白各自包括20个以上的亚基，其中7个在两种生物之间表现出显著的序列同源性。只有一个（Srb4）是几乎所有Pol Ⅱ基因在细胞内转录所必需的。

酵母和人类的中介蛋白都是由一些模块组装而成的。一个由Pol Ⅱ、中介蛋白和一些通用转录因子组成的复合体可以在DNA不存在的情况下座位一个单独的复合体从细胞中分离出来。预先形成的复合体被命名为RNA Pol Ⅱ全酶，也因而能够起始转录。 19. 一组新的因子激发Pol Ⅱ延伸和RNA校对：

答：一旦聚合酶起始了转录，便转入了延伸阶段。这一转变包括Pol Ⅱ酶脱落其大部分起始因子，如通用转录因子和中介蛋白。另一组因子被募集在它们的位置上。其中的一些（如TFⅡS和hSPT5）是延伸因子（elongation factor），也就是激发延伸的因子，其他的是RNA加工所需要的。

激酶P-TEFb，它是由转录激活因子募集到聚合酶上的。一旦与Pol Ⅱ结合，此蛋白质就将CTD重复序列中位置2处的丝氨酸残基磷酸化。P-TEFb磷酸化并因此激活另一个称为hSPT5的蛋白质。还有一个延伸因子，TAT-SF1，被P-TEFb募集。

另一个不影响起始但激发延伸的因子是TFⅡS。此因子促进延伸的总体速度，这是通过在遭遇到趋向于减缓聚合酶进程的序列时限制其暂停时间而实现的。

TFⅡS还有另外一个功能：它有助于由聚合酶进行的校对。

20. 延伸聚合酶与各种RNA加工所需要的一组新的蛋白质因子相互作用： 答：这些加工事件包括下面几个：RNA的5’端加帽（capping）、剪接（splicing）和RNA的3’端的多聚腺苷酸化（polyadenylation）。转录的延伸、终止和RNA加工似乎是相互联系的。

第一个RNA加工事件是加帽，即在RNA的5’端添加一个修饰过的鸟嘌呤碱基。加帽之后，尾部序列重复中的Ser5发生去磷酸化而导致加帽机器的脱离，而进一步的磷酸化（这次是尾部重复中的Ser2）又导致RNA剪接所需要的机器的募集。

最后一个RNA加工事件——mRNA 3’端的多聚腺苷酸化。正如加帽和剪接一样，聚合酶的CTD尾巴也参与募集多聚腺苷酸化所必需的酶。

有些序列一旦转录到RNA中，就会引发这些因子向RNA的转移，这些序列称为poly-A信号。一旦CPSF和CstF结合到RNA上，其他蛋白也就被募集，先引起RNA的切割，然后是多聚腺苷酸化。

已提出两个基本的模型来解释聚腺苷酸化合终止之间的联系：第一个是3’加工酶从聚合酶CTD尾巴到RNA的转移引发了聚合酶内的构象变化，降低了酶的前进能力，导致其后不久就自发终止。第二个模型提出，第二个RNA分子缺少5’端的帽子，这一点被聚合酶感知，因此识别其为不正确的转录物并终止。

21. RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ识别不同的启动子，使用不同组别的转录因子，但还是需要TBP： 答：rRNA基因的启动子包括两个部分：核心元件和UCE（上游控制元件，upstream control element）。除了Pol Ⅰ之外，起始还需要另外两个称为SL1和UBF的因子。

Pol Ⅲ启动子有各种形式，而且绝大部分具有位于转录起始位点下游的不寻常的特征。一些Pol Ⅲ启动子（如tRNA基因的启动子）包含两个区域，称为盒子A和盒子B，二者被一个短的元件分隔开；另一些包含盒子A和盒子C（如5SrRNA基因）；还有一些包含TATA元件，与Pol Ⅱ的启动子相似。

第13章 RNA剪接

知识点：

1. 几个基础概念：

答：许多真核基因是嵌合的：由一段编码区组成，它们被另外一段段非编码区隔开了。编码区称为外显子（exon），它们之间的非编码区称为内含子（intron）。

从pre-mRNA中除去内含子的过程称为RNA剪接（RNA splicing）。 可以除去不同组合的内含子，这称为可变剪接（alternative splicing）。通过这种方式，一个基因可以产生多个多肽产物。

2. RNA序列决定了在哪里进行剪接：

答：最保守的序列是内含子5’剪接位点的GU和3’剪接位点的AG及分支点的A。 3. 当内含子两边的外显子连接时，内含子是以套索结构被除去的：

答：剪接是由两步连续的转酯反应（transesterification）完成的，这样pre-mRNA中原来的一些磷酸二酯键断开，在形成一些新的磷酸二酯键。第一步转酯反应是由分支点保守腺苷酸的2’羟基引发的。它作为亲核基团，攻击5’剪接位点保守鸟苷酸的磷酰基团。结果，外显子3’端的核糖与内含子5’端磷酸之间的磷酸二酯键断开，而游离出来的5’磷酸与分支点保守腺苷酸的2’羟基连接。

在第二步转酯反应中，5’外显子（准确地说，是其新游离出来的3’羟基）反过来作为亲核基团，攻击3’剪接位点的磷酰基团。第二次转酯反应导致两个结果。首先，当然也是最重要的，是把5’和3’外显子连接起来了。其次，使内含子作为离去基团释放出去。 4. 不同的RNA分子的外显子可以通过反式剪接的方式连接起来： 5. RNA剪接是由一个叫做剪接体的大复合体执行的： 答：剪接体中的5种RNA（U1、U2、U4、U5和U6）统称为核内小RNA（small nuclear RNA，snRNA）。每种snRNA长100~300nt，与几种蛋白质形成复合物。这些RNA-蛋白质复合物

称作小核内核糖蛋白（small nuclear ribonuclear protein，snRNP）。剪接体就是由这些snRNP形成的巨型复合体，但是在剪接反应的不同时期具体的成分不尽相同：不同的snRNP在不同时间进出剪接体，每种snRNP执行某些专门的任务。剪接体中还有许多蛋白质不属于snRNP，另外一些蛋白质只能与剪接体松散结合。

snRNP在剪接中的功能有3个方面：识别5’剪接位点和分支点；按需要把这两个位点集结到一起；催化（或协助催化）RNA剪接和连接反应。 6. 剪接体内的组装、重排与催化反应：剪接过程：

答：首先，5’剪接位点被U1 snRNP识别（通过其snRNA与pre-mRNA之间的碱基配对）。U2AF的一个亚基与多聚嘧啶区结合，另一个亚基与3’剪接位点结合，前一个亚基与BBP相互作用，协助其结合到分支点上。以上形成的蛋白质和RNA结合体叫做早期（E）复合体。

随后，在U2AF协助下，U2 snRNP取代BBP结合到分支点，这样形成的结合物叫做A复合体。

下一步是A复合体通过重排把3个剪接位点拉到一起。这个步骤是通过U4、U6及U5 snRNP加入复合体而完成的。这3个snRNP合称三联snRNP（tri-snRNP）颗粒，其中U4和U6 snRNP通过其RNA组分的互补配对相结合，而U5 snRNP通过蛋白质相互作用松散结合。随着tri-snRNP颗粒的加入，A复合体就转变成B复合体。

再下一步，U1离开剪接体，其在5’剪接位点的位置由U6取代。这要求U1 snRNP与pre-mRNA之间的碱基配对断开，以便U6 RNA与同一区域配对（实际上时与一段与之重叠的序列配对），以上就是全部组装过程。后续的重排启动了催化反应，过程如下：U4离开剪接体，以便U6可以与U2发生作用（通过RNA-RNA配对）。重排后的剪接体叫C复合体，产生了活性位点，即重排把构成活性位点的所有组分聚集到剪接体内——据信只是U2和U6的RNA成分参与了催化反应。

活性位点出现后，就把pre-mRNA的5’剪接位点与分支点拉到了一起，加速了第一次转酯反应。5’和3’剪接位点的第二场转酯反应由U5 snRNP协助，把两个外显子连接在一起。最后的步骤是释放出mRNA产物及snRNP。

7. 自剪接内含子的存在表明RNA可以催化RNA剪接： 答： RNA剪接的3种类型

类型 细胞核pre-mRNA 丰度 很常见，适用于大多数真核基因 机制 两步转酯反应，分支点为A 与pre-mRNA相同 催化机器 主要剪接体 内含子编码的核酶 与Ⅱ类自剪接内含子相同 Ⅱ类自剪接内含子 罕见，来自某些细胞器的真核基因及原核基因 罕见，某些真核生物的细两步转酯反应，分支Ⅰ类自剪接内含子 胞核rRNA、细胞器基因，点为G 以及少量原核基因

8. Ⅰ类自剪接内含子释放出线形内含子，而不是一个套索结构：

答：Ⅰ类自剪接内含子剪接机制完全不同。它们使用游离的鸟苷或鸟苷酸，而不是分支点腺苷酸。RNA分子结合该鸟苷或鸟苷酸，并将其3’羟基呈递给5’剪接位点。以前面提到的形成套索结构的同类转酯反应，把游离的鸟苷或鸟苷酸与内含子5’端连接起来。第二步反应与以前讲述的完全相同：游离的外显子3’端攻击3’剪接位点。这个反应把两个外显子连接起来并释放出内含子，尽管在这里内含子是线形的，而不再是套索状。 Ⅰ类自剪接内含子比Ⅱ类小，有一个保守的二级结构。该结构包括一个容纳鸟苷或鸟苷

酸的结合口袋，只要这些鸟苷或鸟苷酸是以核糖的形式出现。除此之外，Ⅰ类自剪接内含子还含有一段“内在指导序列”，与5’剪接位点的序列配对，因而确定了鸟苷亲核攻击的精确位置。

9. 剪接体怎么可靠地确定剪接位点？

答：剪接位点的识别容易犯两种错误：一是遗漏了剪接位点，例如，结合到5’剪接位点的剪接体成分，跳过了正确的3’剪接位点，与结合到下游另一个3’剪接位点的剪接体成分配对。

二是与剪接位点邻近的非法位点被错认为剪接位点。

能够增加剪接位点选择准确性的两种机制如下。其一，在将某个基因转录为RNA时，RNA复制酶Ⅱ携带了多种具有RNA加工功能的蛋白质，其中包括参与剪接的蛋白质。当在新合成的RNA分子上遇到5’剪接位点时，那些蛋白质就从RNA复制酶Ⅱ的C端（剪接相关蛋白质搭乘在RNA复制酶Ⅱ的位置）转移到RNA分子上。剪接体成分一旦结合了5’剪接位点，就会做好准备与那些结合即将转录出来的、下一个3’剪接位点的剪接体成分相互作用。于是在更下游的任何竞争3’剪接位点被转录出来之前，剪接体成分就已经识别出了正确的3’剪接位点。

其二，确保优先识别邻近外显子的剪接位点（因而更有可能是真正的剪接位点），以防止使用错误剪接位点。一种叫做富含丝氨酸和精氨酸的蛋白质（SR蛋白）结合到外显子中的外显子剪接增强子（exonic splicing enhancer，ESE）。结合到这些位点的SR蛋白与剪接机器的组分相作用，将其引导到附近的剪接位点。这样剪接机器就可以更有效地结合到正确的剪接位点，而不会结合到离外显子较远的错误位点。 10. 通过可变剪接一个基因可以得到多个产物：

答：许多高等真核生物编码的RNA可以通过可变剪接，产生两条或多条不同的mRNA，从而翻译出不同的蛋白质。

可变剪接可以组成型的，也可以是受调控的。在前者，同一个基因总是产生多种不同的产物；在后者，不同的产物会在不同的时间、不同的条件，或在不同的细胞或组织类型中产生。

11. 可变剪接受激活因子和抑制因子的调控： 答：剪接调控蛋白结合到称为外显子/内含子剪接增强子（ESS或ISE，exonic/intronic splicing enhancer）或者外显子/内含子剪接减弱子（ESS或ISS，exonic/intronic splicing silencer，ISS）的特殊序列上。前者增强附近的剪接位点的剪接，后者正好相反。

SR蛋白利用某个结构域结合RNA，如熟知的RNA识别基序（RNA-recognition motif，RRM）。每个SR蛋白都含有另一个结构域，富含精氨酸和丝氨酸，称为RS结构域（RS domain）。该结构域位于肽链的C端，介导SR蛋白与剪接体蛋白的相互作用，以便把剪接体募集到附近的剪接位点。

多数减弱子由不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族的成员识别，这些蛋白质能结合RNA但没有RS结构域，所以无法募集剪接体，相反它们可以阻断特定的剪接位点，使之丧失作用。

我们曾强调过可变剪接作为从同一个基因得到多种不同的蛋白质产物的一种途径，这些不同的蛋白质叫做同工型（isoform）。它们可能具有相似或不同的功能，甚至作用相拮抗（一种同工型可能对另一种具有显性的负作用）。甚至有些基因虽然只编码一种功能蛋白，但也存在可变剪接现象。这时可变剪接仅是对该基因的表达起到开关的作用。 12. 少数内含子是由另一组snRNP组成的另一种剪接体来剪接的： 答：低丰度剪接体识别一类很少见的内含子，其共有序列不同于绝大多数pre-mRNA内含子的共有序列。这种新发现的低丰度剪接体称为AT-AC剪接体，因为最初发现其识别的罕见

内含子的5’端是AU，3’端是AC（对应于DNA则为AT和AC）。 13. 外显子通过重组的方式完成改组，从而产生了编码新蛋白质的基因： 答：首先，某个特定基因的外显子和内含子的交界处经常与该基因编码蛋白质的结构域的边界相一致，即每个外显子似乎经常编码蛋白质的一个独立的折叠单位（也经常与一个独立的功能相一致）。

其次，许多基因及其所编码的蛋白质明显是在进化过程中部分地通过外显子复制和变异而产生的。

第三，有时在其他方面并不相关的基因中会发现相关的外显子，即有证据显示有些外显子确实在编码不同蛋白质的基因中被重复使用。 14. RNA编辑是改变mRNA序列的另一种方法：

答：与RNA剪接一样，RNA编辑（RNA editing）可以在RNA转录之后改变其序列，因而翻译出来的蛋白质与根据基因序列所推导出来的不同。介导RNA编辑的机制有两种：位点特异性脱氨基作用和引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除。

位点特异性脱氨基做欧诺个（deamination）的一种形式是，mRNA中某个特异选择的胞嘧啶经过脱氨基变成尿嘧啶。通常，对于一种给定的mRNA，RNA编辑只在特定的组织或细胞发生，而且是受到调控的。

其他酶促脱氨的RNA编辑例子包括腺嘌呤的脱氨基作用。这个反应由作用于RNA的腺苷脱氨酶（adenosine deaminase acting on RNA，ADAR，人类有3种）催化，产生次黄嘌呤。由于次黄嘌呤可以与胞嘧啶配对，所以这种编辑形式很容易改变mRNA编码的蛋白质序列。

在锥虫线粒体中发现了另一种截然不同的RNA编辑形式。在这种情况中，RNA转录后，在pre-mRNA的特定位置插入多个尿嘧啶（有时也可能是删除几个尿嘧啶）。多个尿嘧啶的插入使得mRNA的密码子和可读框发生了改变，从而完全改变了mRNA的“意思”。

尿嘧啶是又引导RNA（guide RNA，gRNA）插入到mRNA中去的。每种gRNA都可以分为3个区，第一区位于5’端，称为“锚”区，负责引gRNA到达它所要编辑的mRNA的目标区域；第二区用于精确定位在被编辑的序列中尿嘧啶将插入的位置；第三区位于3’端，是一段多聚尿嘧啶序列。

gRNA的“锚”区有一段序列，可以与mRNA上将要编辑区域的紧邻位置上（3’端）的一段序列形成碱基配对。随后编辑“指令”发出：gRNA的一段序列与mRNA上的被编辑区互补配对，但有几个多余的腺嘌呤。这些腺嘌呤在gRNA上的位置与将要在mRNA上插入尿嘧啶的位置正好相反。

gRNA与mRNA形成RNA-RNA双链，而在将要插入尿嘧啶的对应位置形成突出的单链环状结构。一种核酸内切酶识别并切开与环状结构相对的mRNA。编辑涉及在mRNA上打开的缺口中加入尿嘧啶，这个过程由3’端尿苷酰转移酶（TUT酶）催化。

尿嘧啶插入后，某种RNA连接酶把两段mRNA连接起来，而gRNA的编辑区则沿mRNA从3’→5’方向继续发挥作用。

15. 一旦完成加工，mRNA会包装好并从细胞核输出到细胞质用于翻译：

答：mRNA一旦全部加工完毕（加帽、去除内含子和多聚腺苷酸化）就会运出细胞核进入细胞质，然后翻译得到蛋白质产物。

典型的成熟mRNA携带着一组蛋白质，正是它们决定了mRNA被转运的命运。

成熟mRNA携带残留的SR蛋白，甚至另外一组专门结合外显子接头的蛋白质（当然只见于完成剪接的RNA）。一组蛋白（或者说是蛋白质组合）而不是任何单独一种蛋白质，决定了RNA是转运出细胞核还是留在细胞核内。

mRNA转运是通过核膜上的一种特殊结构完成的，这就是核孔复合体（nuclear pore

complex）。

一旦进入细胞质，蛋白质组分就会解离下来，并被识别后重新运回细胞核；然后再与另外的mRNA结合，重复下一次循环。

第14章 翻译

知识点：

1. 多肽链是由可读框规定的： 答：蛋白质合成的信息蕴藏在三核苷酸密码子中，每个密码子指定一个氨基酸。每条mRNA的蛋白质编码区由连续的、不交叉的、称作可读框（open-reading frame，ORF）的密码子串组成。每个ORF对应一个蛋白质，其起始和终止点都位于mRNA内部，即ORF的终止点不同于mRNA的终止点。

第一个和最后一个密码子分别称作起始密码子（start codon）和终止密码子（stop codon）。细菌中，起始密码子通常是5’-AUG-3’，但是5’-GUG-3’有时甚至5’-UUG-3’也使用。真核细胞总是使用5’-AUG-3’为起始密码子。这一密码子有两个重要的功能，第一，它指定掺入到增长的多肽链中的第一个氨基酸；第二，它确定了所有后续密码子的可读框。 2. 原核细胞mRNA具有核糖体结合位点，用以募集翻译机器：

答：要使翻译发生，mRNA必须募集核糖体。为了方便与核糖体结合，许多原核细胞的可读框在起始密码子的上游（5’端）含有一小段称为核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）的序列。这一元件也被称作SD序列（Shine-Dalgarno sequence），是以比较了多个mRNA序列后发现它的科学家的名字命名的。核糖体结合位点，典型地位于起始密码子的5’端的3~9个碱基内，与核糖体RNA组分之一的16S核糖体RNA（rRNA）的3’端的一段序列互补。

3. 真核细胞mRNA在5’和3’端被修饰，以促进翻译：

答：真核细胞的mRNA通过位于5’端的称为5’帽子（5’cap）的特殊的化学修饰来募集核糖体。一旦结合到mRNA上，核糖体沿着5’→3’的方向运行直至遇到5’-AUG-3’起始密码子，这一过程称作扫描（scanning）。

真核哺乳动物mRNA有另外两个特征利于翻译。其一是在某些mRNA中，起始密码子的第三个上游碱基为嘌呤并且第一个下游碱基为鸟嘌呤（5’-G/ANNAUGG-3’）。这一序列首先由Marilyn Kozak发现，称为Kozak序列。另一个有利于翻译的特征是3’端的poly-A尾结构。

4. tRNA是密码子和氨基酸之间的转配器：

答：蛋白质合成的核心是将核苷酸序列的信息（以密码子的形式）“翻译”成氨基酸。这是由tRNA分子完成的，它担当密码子及其所指定的氨基酸之间的转配器。tRNA分子有很多种，但每一种仅与一个特定的氨基酸结合并识别mRNA的一个或几个特定的密码子（大多数tRNA识别多于一个密码子）。首先，所有的tRNA在3’端均以5’-CCA-3’序列结束。这就是tRNA和相关的氨基酸通过氨酰tRNA合成酶结合的位点。

tRNA另一个显著的特征就是存在一些特殊的碱基，这些特殊的碱基是多核苷酸链的正常碱基在转录后由酶修饰作用形成的。 5. tRNA都有三叶草型的二级结构：

答：tRNA三叶草型结构主要特征是有一受体臂、3个茎环（分别为ΨU环、D环和反密码子环）和第四个可变环。

6. tRNA具有L状的三维结构：

答：三种相互作用使L状结构得以稳定。第一，三维结构中相互靠近的不同螺旋区域的碱基间的氢键，这些通常是非常规（非Watson-Crick）键；第二，碱基和磷酸核糖骨架之间的相互作用；第三，因形成两个延伸的碱基配对区域而获得的碱基堆积作用。 7. 氨基酸通过高能酰基连接到tRNA 3’端的腺苷酸上使tRNA负载：

答：连接了氨基酸的tRNA分子称为负载的（charged）tRNA，未连接氨基酸的tRNA称为空载的（uncharged）tRNA。

8. 氨基酰tRNA合成酶分两步使tRNA负载： 答：第一步是腺苷酰基化（adenylylation）。其中氨基酸和ATP反应形成氨基酰—腺苷酸，并同时释放出焦磷酸。第二步是tRNA负载（tRNA charging）。氨基酰—腺苷酸（仍然与氨基酰tRNA合成酶紧密结合）与tRNA反应，这一反应导致氨基酸通过2’或3’羟基被转移到tRNA的3’端，同时释放出AMP。

tRNA合成酶分两类。Ⅰ类酶将氨基酸连接到tRNA的2’羟基，并且通常是单聚体；Ⅱ类酶将氨基酸连接到tRNA的3’羟基，并且通常是二聚体或四聚体。 9. 每种氨基酰tRNA合成酶连接一个氨基酸到一个或多个tRNA上： 答：20种氨基酸的每一种都是通过单独专门的tRNA合成酶连接到正确的tRNA上的。由于大多数的氨基酸是由多于一个的密码子决定的，因此由一个合成酶识别多于一个tRNA（称为同工tRNA，isoaccepting tRNA）并使之负载氨基酸。只有一种tRNA合成酶将每个氨基酸连接到所有正确的tRNA上。

大多数的生物具有20种不同的tRNA合成酶。

10. tRNA合成酶识别同族tRNA（cognate tRNA）的独特结构：

答：特异性的决定因素集中在tRNA分子的两个不同的位点：受体臂和反密码子环。 11. 氨基酰tRNA的形成时非常精确的。

12. 某些氨基酰tRNA合成酶利用编辑口袋来高精度地负载tRNA。 13. 核糖体不能辨别tRNA的负载是否正确。

14. 核糖体是由一个大亚基和一个小亚基组成的：

答：核糖体是由RNA和蛋白质组成的大亚基和小亚基两个部件组成的。大亚基含有肽基转移酶中心（peptidyl transferase center），负责肽键的形成。小亚基含有解码中心（decoding center），负载氨基酸的tRNA在此阅读或“解码”mRNA的密码子单位。 15. 大、小亚基在翻译的每次循环过程中都经历结合与分离：

答：翻译机制的中心是循环，每一个循环包括大、小亚基之间及其与mRNA的结合，翻译mRNA，然后各自分离。这种结合和分离称为核糖体循环（ribosome cycle）。

虽然一个核糖体一次只能合成一条多肽，但每个mRNA分子却能同时被多个核糖体结合同时进行翻译（简便起见，我们假设mRNA是单顺反子的）。结合多个核糖体的mRNA称为多核糖体（polyribosome或polysome）。 16. 新的氨基酸连接在延伸肽链的C端。

17. 肽键是通过将正在延伸的多肽链从一个tRNA转移到另一个tRNA而形成的。 18. 核糖体RNA是核糖体中的结构和催化决定因子：

答：核糖体RNA并不单单是核糖体的结构成分，相反，它们还直接负责核糖体的关键功能。 大多数的核糖体蛋白质位于核糖体的周边，而非其内部。 19. 核糖体有3个tRNA结合位点：

答：核糖体含有3个tRNA结合位点，分别为A、P和E位点。A位点（A site）是氨基酰tRNA的结合位点，P位点（P site）是肽基酰tRNA的结合位点，E位点（E site）是延伸的多肽链转移到氨基酰-tRNA后释放的tRNA的结合位点（E指exit，退出）。 20. 穿过核糖体的通道可以使mRNA和多肽链进出核糖体：

答：mRNA通过小亚基的两个狭窄的通道进出解码中心。mRNA的两个密码子之间存在明显的扭结（kink），有利于维持正确的可读框。这个扭结使核糖体易位后留在空着的A位点的密码子处于一个独特的位置，阻止随后的氨基酰-tRNA结合于毗邻该密码子的碱基上。 大亚基上的另一个通道提供了新合成的多肽链离开（核糖体）的途径。与mRNA的通道一样，这个通道的大小限制了多肽链的折叠。 21. 翻译起始：

答：翻译要成功地起始，必须有3个事件发生。第一，核糖体必须被募集到mRNA上；第二，负载tRNA必须置于核糖体的P位点；第三，核糖体必须精确地定位在起始密码子上。其中第三条是关键的。因为这一步确定了mRNA翻译的可读框。

22. 原核细胞的mRNA最初是通过与rRNA的碱基配对而募集到小亚基上：

答：大、小亚基是一个一个地装配到mRNA上的。首先小亚基和mRNA结合。如前所述，对原核细胞来说，小亚基和mRNA的结合是由（mRNA的）核糖体结合位点和（小亚基的）16S RNA之间的碱基配对作用介导的。大亚基是在起始过程即将结束的时候加入复合体的。 23. 特定的负载着修饰甲硫氨酸的tRNA直接结合到原核细胞的小亚基上：

答：通常，负载tRNA进入核糖体的A位点并在一轮肽键合成后才能到达P位点。但是，在起始阶段，负载tRNA直接进入到P位点。这一过程需要一个称为起始tRNA（initiator tRNA）的特定tRNA，它与起始密码子（通常AUG或GUG）碱基配对。起始tRNA上负载的既非Met亦非Val。相反，它负载的是一种Met的修饰产物：在氨基基团上连着一个甲酸基（N-甲酰甲硫氨酸，N-formyl methionine），负载此氨基酸的起始tRNA称为fMet-tRNAifMet。 24. 三种起始因子知道包含mRNA和起始tRNA的起始复合物的装配： 答：原核细胞的翻译始于小亚基，由3中翻译起始因子（translation initiation factor）——IF1、IF2和IF3所催化，每一个因子催化起始过程的一个关键步骤：

IF1防止tRNA结合到小亚基未来A位点的位置上。 IF2是GTP酶（结合和水解GTP的蛋白质），它与起始过程的3个主要成分（小亚基、IF1和fMet-tRNAifMet）相互作用。通过与这些成分相互作用，IF2催化了fMet-tRNAifMet和小亚基的结合，并阻止其他负载tRNA与小亚基结合。

IF3结合于小亚基并阻止其与大亚基结合，或阻止其与负载tRNA结合。由于翻译起始需要游离的小亚基，因此IF3与小亚基的结合对翻译的每一轮新的循环是十分重要的。IF3在上一轮循环即将结束时开始于小亚基结合，并协助70S核糖体分解为大、小亚基。

随着3个起始因子的加入，小亚基已经准备好结合mRNA和起始tRNA了。这两种RNA能以任何一种方向结合，并且相互独立。（小亚基）结合mRNA通常是（mRNA的）和它结合位点和（小亚基的）16S RNA之间的碱基配对作用介导的。而fMet-tRNAifMet结合小亚基是由结合GTP的IF2催化的，并且（一旦mRNA结合于小亚基上）通过反密码子和mRNA的起始密码子之间的碱基配对作用。

起始的最后步骤涉及大亚基的聚合以形成70S起始复合体（70S initiation complex）。当起始密码子和fMet-tRNAifMet的碱基配对后，小亚基的构象发生变化导致IF3的释放。在IF3离开的情况下，大亚基可以自由地与小亚基及其负载的IF1、IF2、mRNA和fMet-tRNAifMet结合。大亚基的结合激活了IF2-GTP酶活性，引起GTP的水解。水解后的IF2-GDP与核糖体和起始tRNA的亲和力降低，导致IF2-GDP和IF1从核糖体释放出来。这样，起始过程的最后产物是在mRNA的起始位点组装了一个完整的（70S）核糖体，其P位点有fMet-tRNAifMet，而A位点是空的。

25. 真核细胞的mRNA通过5’帽吸引核糖体：

答：在真核细胞中，小亚基在被吸引到mRNA的5’端帽子结构之前，已经与起始tRNA结合。然后以5’→3’方向沿着mRNA“巡视”直到遇见第一个有正确上、下游序列的5’

-AUG-3’，该密码子被识别为起始密码子。

与原核细胞不同的是，真核细胞起始tRNA和小亚基的结合总是发生在和mRNA结合之前。当真核细胞的核糖体完成翻译的一个循环后，通过与原核的IF3和IF1相对应的（分别称为eIF3和eIF1A）因子的作用解离为游离的大、小亚基。两个GTP-结合蛋白——eIF2和eIF5B介导了（小亚基）和负载起始tRNA的结合。对真核细胞来说，起始tRNA负载的是Met，而非N-fMet，称为Met-tRNAiMet。eIF5B-GTP帮助eIF2-GTP和Met-tRNAiMet的复合体结合到小亚基上。通过协同作用，这两个GTP结合蛋白将Met-tRNAiMet安置于小亚基未来的P位点，最后形成43S起始前复合体（43S pre-initiation complex）。

43S起始前复合体对mRNA的识别是从对5’帽结构的识别开始的，这一结构存在于大多数真核细胞的mRNA上。这一识别过程由具有3个亚基的eIF4F介导。其中的一个亚基直接与5’帽结构相结合，其他的两个亚基与RNA非特异性地结合。随后，eIF4B加入到这一复合体上，并激活eIF4F中一个亚基的RNA解旋酶的活性。解旋酶解开mRNA末端的任何二级结构（如发夹结构）。eIF4F/B与展开的mRNA的结合体通过eIF4F和eIF3的相互作用募集43S起始前复合体到mRNA上。

26. 起始密码子是通过核糖体从mRNA的5’端向下游（3’端）“巡视”而找到的： 答：一旦在mRNA的5’端组装好，小亚基和它的结合因子就按照5’→3’方向沿着mRNA移动，这一移动是依赖于ATP的，由eIF4F的RNA解旋酶所驱动。在移动过程中，小亚基寻找mRNA的起始密码子。起始密码子的识别是通过起始tRNA的反密码子和起始密码子之间的碱基配对作用（这就是为什么起始tRNA先与小亚基结合，而后与mRNA结合的原因）。正确的碱基配对引起eIF2和eIF3的释放。eIF2（防止大亚基的结合）和eIF3（结合于起始tRNA）的脱离使得大亚基结合到小亚基上。与原核细胞的情况相同，大亚基的结合刺激了eIF5B-GTP（与原核的IF2相似）的水解，导致剩余的起始因子释放。这些事件的结果是，Met-tRNAiMet被置于新的80S起始复合体（80S initiation complex）的P位点。 27. 翻译起始因子使真核mRNA保持环状：

答：除了与mRNA的5’端结合，起始因子通过poly-A尾与mRNA的3’端紧密结合。这是通过eIF4F和包绕在poly-A尾结合蛋白（poly-A binding protein）之间的相互作用实现的。 28. 翻译延伸：

答：为了使氨基酸能正确加入，有3个关键的事件是必须发生的。首先，在A位点上的密码子的指导下，正确的氨基酰tRNA置于A位点上；第二，A位点的氨基酰tRNA与P位点的肽酰tRNA上的肽链形成肽键，这一肽转移酶（peptidyl transferase）反应导致多肽链从P位点的tRNA上转移到A位点的负载tRNA的氨基酸残基上；第三，形成的A位点的肽酰tRNA和相应的密码子必须易位（translocate）至P位点，以使核糖体为下一循环的密码子识别和肽键形成做好准备。

29. 氨基酰tRNA由延伸因子EF-Tu送达A位点：

答：与起始因子IF2一样，延伸因子EF-Tu结合并水解GTP，并且鸟嘌呤核苷酸的类型决定了EF-Tu的功能。只有当EF-Tu与GTP结合后，EF-Tu才能结合氨基酰tRNA。结合氨基酰tRNA的EF-Tu不能有效地水解GTP。激活EF-Tu GTP水解酶活性的“扳机”是与大亚基加入起始复合体时激活IF2 GTP水解酶的大亚基的同一个结构域。这一结构域称为因子结合中心（factor binding center）。只有当tRNA置于A位点和正确的密码子-反密码子配对后，EF-Tu才能与因子结合中心相互作用。然后，EF-Tu水解结合的GTP，并从核糖体中释放出来。

30. 核糖体利用多种选择机制排斥错误配对的氨基酰tRNA： 答：至少有3中不同的机制促成了翻译的高准确率：

其中一个关于密码子识别忠实性的机制涉及小亚基16SrRNA的两个相连腺嘌呤残基。

这两个腺嘌呤与反密码子和密码子的前两个碱基之间每个正确配对所形成的小沟形成紧密的相互作用。相邻的16SrRNA的A残基不能识别G：C或A：U配对，因而认为任何一对都是正确的。相反，非Watson-Crick碱基配对所形成的小沟就不能被（16SrRNA的）这两个腺嘌呤识别，导致对非正确tRNA的亲和力明显降低。这些作用的净结果是，正确配对的tRNA从核糖体解离的速度要远低于非正确配对的tRNA。

第二个有助于保证正确的反密码子-密码子配对的机制涉及EF-Tu的GTP酶活性。EF-Tu从tRNA的释放需要GTP的水解，这一作用对正确的反密码子-密码子配对是非常敏感的。即使只有一个碱基的不配对也将导致EF-Tu的GTP酶活性的急剧下降。

第三个保证碱基配对正确性的机制是EF-Tu释放后的一个校正机制。当负载tRNA与EF-Tu-GTP的复合体进入A位点时，它的3’端远离肽键形成的位点。为了成功地进行肽转移酶反应，氨基酰tRNA必须旋转进入到大亚基的肽转移酶中心，这一过程称为入位（accommodation）。非正确配对的tRNA在入位过程中经常从核糖体上脱离下来。有假设认为氨基酰tRNA的旋转为密码子和反密码子的作用带来了张力，而只有正确配对的反密码子才能维持这种张力。 31. 核糖体是核酶：

答：这一反应由RNA，尤其是大亚基的23S rRNA组分来催化。23S rRNA与处于A和P位点的tRNA的CCA末端之间的碱基配对，帮助氨基酰tRNA的α氨基基团攻击结合于肽酰-tRNA的多肽的碳基团。

肽转移酶中心的核苷酸接受了氨基酰tRNA的α氨基基团的一个氢原子，使得相连的氮原子变成了极强的亲核基团。

32. 肽键形成和延伸因子EF-G促进了tRNA和mRNA的易位：

一旦肽转移酶反应开始发生，P位点的tRNA就被脱去氨基（不再结合氨基酸），而多肽链则连接到A位点的tRNA上。要使肽链延伸的新一轮循环得以发生，P位点的tRNA必须移至E位点，而A位点的tRNA必须移至P位点。同时，mRNA也必须移动3个核苷酸，以使下一个密码子暴露出来。这些移动是在核糖体内协调进行的，统称为易位（translocation）。

易位的起始步骤是与肽转移酶反应偶联的。一旦多肽链移至A位点的tRNA，这个tRNA的3’端就移到大亚基的P位点上。相反，tRNA的反密码子部分仍然留在A位点内。相似地，这时已脱氨基的P位点的tRNA位于大亚基的E位点和小亚基的P位点上。

易位的完成需要第二个称为EF-G的延伸因子的作用。当EF-G-GTP结合后，它与大亚基的因子结合中心相作用，刺激GTP的水解。GTP的水解改变了EF-G-GDP的构象，允许它进入小亚基并刺激A位点tRNA的易位。当易位完成后，核糖体构象的改变极大地降低了其对EF-G-GDP的亲和力，允许这一延伸因子从核糖体中释放出来。这些事件一起导致A位点的tRNA易位至P位点，P位点的tRNA易位至E位点，以及mRNA正好移动3个核苷酸。

33. EF-G通过取代结合在A位点的tRNA来驱动易位。

34. EF-Tu-GDP和EF-G-GDP在参加新一轮延伸之前必须将GDP换成GTP。 35. 一个循环的肽键形成要消耗两个GTP分子和一个ATP分子。 36. 释放因子在终止密码子的作用下终止翻译：

答：有两类释放因子：Ⅰ类释放因子识别终止密码子，并催化多肽链从P位点的tRNA中水解释放出来。原核细胞有两种Ⅰ类释放因子：RF1和RF2。RF1识别终止密码子UAG，RF2识别终止密码子UGA，两者皆可识别第三个终止密码子UAA。真核细胞只有一种能识别3个终止密码子的Ⅰ类释放因子：eRF1。Ⅱ类释放因子在多肽链释放后刺激Ⅰ类因子从核糖体中解离开来。原核细胞和真核细胞都只有一种Ⅱ类因子，分别是RF3和eRF3。与

EF-G，EF-Tu和其他翻译因子一样，Ⅱ类释放因子也是由GTP调节的。 37. Ⅰ类释放因子的一小段区域识别终止密码子并催化多肽链的释放： 答：3个氨基酸负责识别终止密码子的特异性。这3个氨基酸组成的区域代表着肽反密码子。 所有的Ⅰ类因子共有一段保守的三氨基酸（GGQ）序列，这一序列对多肽链的释放是关键的。

38. GDP/GTP交换和GTP水解调控Ⅱ类释放因子的功能：

答：在Ⅰ类RF刺激多肽释放后，核糖体和Ⅰ类因子的构象改变诱导RF3交换GDP而结合GTP。RF3与GTP的结合导致与核糖体之间的高亲和力相互租用的形成，替代了Ⅰ类分子与核糖体的结合，这一变化还使得RF3与大亚基的因子结合中心结合。与参与翻译的其他GTP结合蛋白一样，这个作用刺激GTP的水解。在（与核糖体结合的）Ⅰ类因子不存在的情况下，RF3-GDP与核糖体的亲和力较弱而很快从核糖体中释放出来。 39. 核糖体循环因子模仿tRNA： 答：为了参与新一轮的多肽合成，tRNA和mRNA必须离开核糖体而核糖体也必须分解为大、小亚基。这几个事件统称为核糖体循环（ribosome recycling）。

在原核细胞中，一种称为核糖体循环因子（ribosome recycling factor，RRF）的蛋白质在多肽释放后与EF-G和IF3共同作用来使核糖体循环。RRF与空位的A位点结合，并模仿tRNA。RRF也募集EF-G到核糖体上，EF-G刺激结合于P位点和E位点的空载tRNA释放出来。一旦tRNA从核糖体中脱离，EF-G和RRF同mRNA一起也从核糖体中释放出来。IF3（起始因子）也可能参与了mRNA的释放，而且它对核糖体分解为大、小亚基是必需的。这些事件的最后结果是形成一个与IF3（而非tRNA或mRNA）结合的小亚基和一个游离的大亚基。

40. 依赖翻译调节mRNA和蛋白质的稳定性：

答：翻译过程可以识别缺陷的mRNA，并予以去除或将其蛋白质产物去除。 41. SsrA RNA援救翻译着断裂mRNA的核糖体：

答：在原核细胞，由于缺失了终止密码子而停止运转的核糖体是由一种嵌合的RNA分子解救的，这种RNA分子部分是tRNA，部分是mRNA，称为tmRNA。

SsrA RNA是一个由457个核苷酸组成的tmRNA，其3’端的区域非常相似于tRNAAla。SsrA RNA结合的最终结果是，当不完全的mRNA从核糖体中释放出来时，不完全的多肽的碳基端融合了一个10个氨基酸的“标签”，而核糖体重新进入翻译的循环过程中。有趣的是，这种10个氨基酸的“标签”被细胞的蛋白水解酶识别，蛋白水解酶很快地将这一标签以及它附着的多肽降解。

42. 真核细胞降解不完整的或终止密码子提前的mRNA： 答：真核细胞的翻译与mRNA的衰减过程紧密相连。

当一个mRNA分子含有提前的终止密码子时（称为无义密码子），这一mRNA很快地被降解，这一过程称为无义密码子介导的mRNA衰减（nonsense mediated mRNA decay）。如果mRNA存在一个提前的终止密码子（源于基因的突变或转录与剪接过程中的错误），那么核糖体就在外显子结合处的复合体被置换之前，从mRNA上脱离出来。在这些情况下，复合体作用于提前终止的核糖体，这样就激活一种去除mRNA的5’端帽结构的酶。由于mRNA通常就是受5’端帽结构保护来防止降解的，因为帽结构的去除就导致mRNA很快地被5’→3’核酸外切酶所降解。

另一种机制拯救翻译缺乏终止密码子的mRNA的核糖体，称为无终止密码子介导的mRNA衰减（nonstop mediated decay）。当缺失终止密码子的mRNA翻译时，核糖体就会翻译多聚A尾（因为没有终止密码子在多聚A尾之前终止翻译）。这就导致了蛋白质的末端添加了多个赖氨酸（AAA是赖氨酸的密码子），并且核糖体停止在mRNA的3’端。停止的

核糖体与Ski7蛋白质（与Ⅱ类释放因子eRF3相关）结合，刺激了核糖体的解离并吸引3’→5’核酸外切酶降解“无终止”mRNA。另外，在碳基末端含有多聚赖氨酸的蛋白质是不稳定的，导致源自无终止密码子的mRNA的蛋白质快速降解。

第15章 遗传密码

知识点：

1. 遗传密码具简并性：

答：很多氨基酸是由超过1种以上的密码子定义的，这种现象称为密码子的简并性（degeneracy）。定义同一种氨基酸的几个密码子称为同义密码子（synonym）。

事实上，当密码子的第1和第2个核苷酸完全相同时，第3个核苷酸无论是胞嘧啶还是尿嘧啶，均编码相同的氨基酸，通常腺嘌呤和鸟嘌呤可以类似地进行互换。

很多生物基因组DNA分子中AT/CG的比例有很大的变异，但它们的蛋白质分子中氨基酸的比例却没有相应的大变化，这一现象可以用密码子的简并性，特别是在密码子第3位单核苷酸的常见的胞嘧啶与尿嘧啶或者腺嘌呤与鸟嘌呤的互换性来解释。 2. 认识密码子组成的规律： 答：考察密码子在遗传密码中的分布，可以得到遗传编码的进化趋向于将突变的有害效应减少到最小的规律。

遗传密码中另一个显而易见的规律是：在第3个位置上使所有4种核苷酸定义相同的氨基酸可能已逐渐进化为一种安全机制，以便在阅读这种密码时将错误减少到最小。 3. 反密码子的摆动配对： 答：摆动理论指出，反密码子5’端的碱基在空间上不如其他2个位置上的碱基那么受限制，可以和密码子3’端的集中碱基形成氢键。

摆动理论的配对组合：

反密码子中的碱基 G C A U I 密码子中的碱基 U或C G U A或G A、U或C 反密码子的第一个（5’）碱基位于碱基堆叠的末端，其运动也许比其他两个碱基相对自由些，因而，在密码子的第三个（3’）碱基位置上摆动。相反，不仅反密码子的第三个（3’）碱基位于碱基堆叠的中间，而且相邻的碱基总是庞大的修饰嘌呤残基。因此，碱基运动的受限性可能解释了摆动为什么不出现在密码的第一个（5’）位置上。 4. 三个密码子指导链的终止： 答：终止密码子UAA、UAG和UGA不是由特殊的tRNA来阅读，而是由称为释放因子（RF）的特殊蛋白质所阅读（细菌中为RF1和RF2，在真核生物种为eRF1）。 5. 遗传密码是如何破译的？

答：通过人工合成的mRNA刺激氨基酸的掺入。

混合多聚核苷酸使其它密码子的组成得以确定。 tRNA和特定的三联体密码子结合。 重复共聚物确定密码子。 6. 支配遗传密码的三条规律：

答：遗传密码遵循指导密码子在mRNA中的排列和使用的三条规律：

第一条规律是密码子从5’→3’方向阅读。 第二条规律是密码子不重叠，信息之间无缝隙。

最后一条规律是信息在固定的可读框上翻译，这些可读框是由起始密码子设定的。 7. 改变遗传密码的三种点突变： 答：引起编码一种特异氨基酸的密码子成为编码另一种氨基酸的密码子的改变称为错义突变（missense mutation）。

突变导致链终止密码子，称为无义突变（nonsense mutation）或者终止突变（stop mutation）。

第三种点突变是移码突变（frameshift mutation）。它是插入或缺失一个或者几个碱基对，从而改变可读框。

8. 遗传密码是以3个碱基为阅读单位的遗传学证据。 9. 抑制突变可以存在于相同或不同的基因中：

答：通常，有害突变的效应可以被第2个遗传变化逆转。其中某些继发突变易于理解，如简单的逆转突变（reverse mutation），把改变了的核苷酸序列转变回原先的序列。比较难以理解的是突变发生在染色体的不同位置，通过在B位点产生其他遗传变化抑制发生在A位点的突变所带来的变化。这种抑制突变（suppressor mutation）主要有两种类型：一是基因内抑制（intragenic suppressor），即抑制突变和原来的突变位于同一个基因内，但在不同的位置上；二是抑制突变发生在另一个基因上的基因间抑制（intergenic suppressor）。抑制其他基因的突变的基因称为抑制基因（suppressor gene）。在此我们考虑的两种突变抑制作用均通过导致产生好的（或部分好的）蛋白质拷贝而起作用，原有的有害突变则使蛋白质失活。 10. 基因间抑制涉及tRNA：

答：最著名的抑制突变例子之一是突变tRNA基因，它抑制蛋白质编码基因中无疑突变的效应（但也有抑制错义突变，甚至移码突变的突变tRNA）。 11. 无义突变抑制也能识别正常的终止信号：

答：无义抑制行为可以看作是抑制tRNA和释放因子之间的竞争，当一个终止密码子进入核糖体A位点，是读过去还是多肽链终止，取决于这两个中的哪一个优先到达该位置。大肠杆菌可以耐受UAG终止密码子的误读，因为UAG不常用做可读框末端的链终止密码子。因为UAA常常用作链终止密码子，所以被抑制tRNA识别会导致产生很多异常的长肽链。 12. 通用性（universality）：

答：指不论是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的。 13. 密码子通用性的好处： 答：密码子的通用性对于我们了解进化有着重大的影响，因为它使直接比较基因组序列已知的所有生物的蛋白质序列成为可能。

遗传密码的通用性还帮助建立了遗传工程领域，使在代理宿主生物种表达编码有用蛋白质产物的克隆基因成为可能，如在细菌中产生人类胰岛素。

14. 真核细胞线粒体mRNA中的密码子与胞浆中mRNA的密码子有以下三点不同： 答：（1）线粒体中UGA不代表终止密码子，而是编码Trp；

（2）线粒体有4个终止密码子：UAA，UAG，AGA，AGG； （3）肽链内的Met由其中的AUG和AUA编码。

第4篇 调控

第16章 原核生物的基因调控

知识点：

1. 基因表达由调控蛋白控制：

答：调控蛋白可分为两类：正调控蛋白或活化子（activator，又译激活物），负调控蛋白或抑制子（repressor，又译阻遏物）。这些调控蛋白通常都是DNA结合蛋白，它们识别受其控制的基因上的或基因附近的特异位点。活化子增强受控基因的转录，抑制子降低或消除相应基因的转录。

持家基因（Housekeeping gene）：参与西部生长和复制等必需的基本生命过程的基因称为持家基因，这些基因在细胞中组成性地表达（expressed constitutively）。

可诱导基因（Inducible gene）：只有受到诱导子或细胞因子的激活作用时才会表达的基因称为可诱导基因。

2. 很多启动子通过协助RNA聚合酶结合DNA的活化子和阻遏两者结合的抑制子进行调控： 答：当聚合酶结合了启动子时，它会自动地经由封闭复合体到开放复合体的转变从而启动转录。这导致基因的组成型表达（constitutive expression），或称为本底水平（basal level）表达。

抑制子要控制从某一启动子起始的表达，只需结合到与聚合酶结合区相重叠的位点上。抑制子就以阻碍聚合酶结合到启动子上从而阻止转录。DNA上抑制子结合的位点称为操作子（operator）。

活化子以其一个表面结合到启动子附近的某一DNA位点；同时，以另一表面与RNA聚合酶相互作用，将聚合酶带到启动子。这一机制常被称为募集（recruitment），这是一个蛋白质协同结合DNA（cooperative binding of proteins to DNA）的例子。 3. 某些活化子通过变构和调控RNA聚合酶对结合后的转录步骤起作用：

答：活化子与稳定的封闭复合体相互作用诱导发生构象改变引起封闭到开放复合体的转变。 4. 远程激活和DNA环化：

答：有些互作蛋白质的结合位点在DNA上相距较远。在这种情况下，为了使蛋白质相互作用，结合位点之间的DNA就会形成环，让蛋白质结合位点彼此靠近。

使距离很远的DNA位点靠近以便DNA链环化的方式之一是在这些位点之间的DNA序列上再结合其他蛋白质。

5. 协同结合和变构在基因调控中有很多作用：

答：有时RNA pol可与启动子很好地结合，但结合后不能自动转变为开放的起始复合物，照样不能转录或转录很低。

这时需要活化子与闭合复合物结合，诱导RNA pol或DNA promoter的构象变化，使闭合复合物转变为开放复合物。这就是活化子的变构调节（Allostery regulation）。

经常有成组的调控蛋白共同结合到DNA上，即两个或多个活化子和（或）抑制子间彼此互作并与DNA相互作用，彼此协助结合到所调控的基因附近。

（1）敏感地接受外界的变化，快速地启动基因的表达。 （2）整合信号（integrate signal）：有些基因的激活需要多种信号的存在。 6. 抗终止作用及其延续：基因调控并不局限于转录起始调控。 7. 操纵子的概念： 答：操纵子（operon）：原核生物基因表达和调控的单位。操纵子通常由3个部分组成：

（1）结构基因：编码与某一代谢过程相关的酶类，这些基因的表达受到协同控制。

（2）调控元件（control elements），例如操作子（operator）序列。 （3）调节子基因（Regulator gene）：编码与调控元件结合的蛋白质。（调节基因有时不在本身操纵子中编码，而存在其他的操纵子中）。 8. 乳糖操纵子（The lactose Operon）： 答：（1）乳糖操纵子的结构基因：

lacZ：编码水解乳糖的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）。

lacY：编码一种叫乳糖转移酶（lactose permease）的细胞膜蛋白，将乳糖从胞外通过细胞壁运送到胞内。

lacA：编码硫代半乳糖苷转乙酰酶（thiogalactoside transacetylase），可消除同时被lacY转入的硫代半乳糖苷对细胞的毒性。

乳糖操纵子的结构基因受到共同的启动子和操纵子的控制： lacZ、lacY、lacA基因在共同启动子Plac的控制下，被转录在一条多顺反子mRNA上（polycistronic mRNA），被称为lacZYA mRNA。

lacZYA转录单元含有一个操作子位点Olac：操作子（Olac）位于启动子Plac3’端﹣5～﹢21间，与lac抑制子（repressor）结合。

（2）活化子和抑制子共同控制乳糖操纵子的表达： 活化子（activator）：代谢产物激活蛋白（Catabolite Activator Protein，CAP）或称为cAMP受体蛋白（cAMP Receptor，CRP），活化子对培养基中葡萄糖的浓度作出反应。 抑制子（repressor）：lacI基因编码乳糖操纵子的抑制子，它对培养基中乳糖的浓度作出反应。

（3）乳糖抑制子与操作子结合，阻止RNA pol与promoter的结合：

lac operator（Olac）与promoter（Plac）有部分序列重叠，所以抑制子与Olac的结合从空间上阻止了RNA pol与Plac的结合。

（4）Plac是弱启动子，CAP通过募集RNA pol到Plac激活lac转录：

CAP有2个结合位点：一个与位于启动子附近的DNA结合，另一个与RNA pol结合。

（5）lac抑制子和CAP的活性受到它们各自信号的变构调控： 别乳糖（allolactose）：别乳糖与抑制子结合，使抑制子变构失活，操纵子可以表达；别乳糖是乳糖经β-半乳糖苷酶转变而成，乳糖从而间接地灭活抑制子并使操纵子表达。 在缺乏乳糖时，lac抑制子阻止了lacZYA的转录，只有非常低的本底转录活性存在。

当乳糖存在时，本底水平的转移酶将乳糖运进细胞内，β-半乳糖苷酶将乳糖转变为别乳糖（allolactose）。别乳糖作为诱导物，与lac抑制子结合，使抑制子失活，从而操纵子得以表达。

cAMP：cAMP与活化子CAP结合，CAP变构并与DNA结合，募集RNA pol到启动子，激活操纵子的表达；但细胞中的葡萄糖降低cAMP浓度，葡萄糖从而间接地关闭CAP及启动操纵子的表达。

（6）组合调控：CAP也调控其他基因：

CAP作为调节子（regulator）可与不同的抑制子共同作用，对不同的基因进行调节，这就是组合调控（Combinatorial Control）。

CAP在E.coli中与一系列的调控蛋白一起作用于100多种基因。 （7）CAP和lac抑制子以相同的结构模体结合DNA：

蛋白质靠一种保守的二级结构螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix）识别特异的DNA序列。

9. 选择性的σ因子： 答：（1）选择性的ζ因子（alternative ζ factor）：

不同的ζ因子与同一种RNA pol结合，ζ因子决定了RNA pol与启动子结合 特异性（promoter specificity）。

（2）许多细菌可产生一系列ζ因子，分别用于正常和极端生长条件下的转录调控： 热激（Heat shock）反应：

E.coli在温度达37℃以上时，表达大约17中热激特有蛋白。

ζ32是rhoH基因编码的一种选择性的ζ因子，它与RNA pol结合，识别这些热激特有蛋白的启动子，启动表达。 （3）噬菌体编码自己的ζ因子：

许多噬菌体（Bacteriophage）编码自己的ζ因子，利用宿主细菌的RNA pol，选择地识别噬菌体基因启动子并表达这些基因。 10. NtrC和MerR：变构激活： 答：（1）NtrC具有ATPase活性，利用变构作用促使开放起始复合物的形成： NtrC调控与氮代谢有关基因的表达，如glnA基因。 NtrC具有DNA结合和激活两个结构域（domain）。

只有在氮（nitrogen）浓度很低时，激酶NtrB才将NtrC磷酸化，使NtrC构象发生变化，暴露其DNA结合域并与特定启动子前序列结合，再利用ATPase活性水解ATP获取能量，将闭合的复合物转变为开放的复合物，激活转录。 （2）MerR通过扭曲启动子DNA而激活基因的转录： MerR控制抗汞酶基因merT的转录。

merT启动子﹣10与﹣35元件相隔19bp（一般是15~17bp），这种间隔既不是ζ70启动子的最适间隔，也不能使两种元件平行排列，因此RNA pol与启动子结合后也不能形成开放复合物。

当环境中无汞（mercury）时，MerR与merT启动子﹣10～﹣35间的一段DNA结合；聚合酶能与启动子，但无法起始转录。

当汞与MerR结合时，MerR构象变化，使所结合的DNA扭曲，扭曲使merT启动子﹣10～﹣35形成类似强启动子的结构，聚合酶可以起始merT的表达。 （3）变构激活：

多数活化子通过募集RNA pol到启动子位点的方式发挥作用，如CAP和选择性ζ因子。

NtrC和MerR通过变构激活（allosteric activation）的方式发挥作用：即这些转录活化子通过DNA或蛋白质的构象变化，使已经形成的闭合起始复合物转变为开放起始复合物。 没有NtrC和MerR的参与，RNA pol可与启动子结合，但形成没有活性的闭合起始复合物。

NtrC活化子是因为自身的构象变化才能暴露出DNA结合域，与DNA结合，并利用ATPase活性使闭合复合物转变为开放复合物。

MerR活化子导致DNA构象变化，从而使闭合复合物转变为开放复合物。 11. 抑制子以多种方式发挥表达调控作用：

答：通过抑制子（Repressors）结合位点与启动子重叠，阻止RNA pol与启动子的结合，如lac 抑制子。

阻止闭合起始复合物向开放的转变，抑制子结合位点位于启动子旁边，通过与启动子上的pol的互作而阻止转录的起始，如E.coli Gal抑制子。

阻止启动子逃离，噬菌体φ29 P4蛋白与PA2的相互作用。

12. araBAD操纵子： 答：（1）AraC的抗激活作用及其对araBAD操纵子的调控：

E.coli araBAD操纵子的启动子在有阿拉伯糖（arabinose）而无葡萄糖时活化，编码阿拉伯糖代谢的酶类得以表达。 无阿拉伯糖时，AraC与araO2和araI1序列结合，抑制转录；当有阿拉伯糖与AraC结合后，AraC与araI1和araI2结合，在CAP的协助下可激活操纵子的表达。 araBAD操纵子与lac操纵子非常相似。 （2）araBAD启动子常被用于表达载体：

阿拉伯糖对araBAD启动子的诱导活化非常强大，因此，araBAD启动子常被应用于表达载体（expression vector）。

将外源基因克隆在该启动子之后，当受到阿拉伯糖的诱导时，启动外源基因的高效表达。

13. 色氨酸操纵子（the tryptophan operon）： 答：（1）Trp操纵子及其调控：

Trp操纵子编码5个结构基因，用于色氨酸的生物合成。

当细胞内色氨酸浓度很低时，这些结构基因可在调控下高效表达。

表达由2个层次：1）Trp抑制子对转录起始的抑制；2）转录起始后的衰减作用（attenuation）。

（2）Trp抑制子：

①Trp抑制子被另一个操纵子trpR编码。

②Trp抑制子是2聚体蛋白，有一个中央核心（central core）和2个DNA识别头部（DNA-reading head）（2个亚基的C-末端）。

③Trp抑制子必须与色氨酸结合形成复合物后，才可与操纵子结合，所以色氨酸被称为辅抑制子（corepressor）。色氨酸通过终产物抑制（负反馈调节，negative feed-back regulation）的方式抑制了自身的表达。

④Trp抑制子降低转录起始约70倍，而Lac抑制子的抑制活性要强很多。 ⑤在Lac操纵子中乳糖作为诱导物（inducer），使抑制物失活，从而诱导操纵子的表达；Trp操纵子中色氨酸是辅抑制物，从而抑制操纵子的表达。 （3）Trp操纵子的衰减作用（attenuation）：

因为色氨酸浓度降低，抑制子不能得到辅抑制子（即色氨酸）的协助，Trp操纵子的转录得以起始（第一层次的表达调控）；随着色氨酸浓度的升高，Trp操纵子通过提前终止转录的方式抑制转录，这种调控叫衰减作用。 （4）Trp操纵子衰减作用的原理：

①细菌体内的转录和翻译是偶联的。

②Trp操纵子的前导肽含有2个连续的色氨酸残基，如果色氨酸的浓度很低，核糖体将会在这2个密码子处暂停。核糖体的暂停改变了前导RNA的二级结构，消除了此处的终止子结构，因而核糖体可将Trp操纵子成功转录完成。

③如果色氨酸浓度高，核糖体顺利通过了前导RNA中的终止子区，终止子可以形成并提前终止了RNA pol对于操纵子的继续转录。

④Trp操纵子的前导肽序列TrpL中有4个互补序列：通常1：2，3：4区配对，3：4配对形成终止子，2：3配对破坏终止子。

⑤核糖体对Trp操纵子前导肽中2个连续色氨酸残基的翻译与色氨酸的浓度有关，决定是否形成终止子，提前终止已经进行的转录。Trp浓度低时，核糖体停留在第10和11密码子处（1区），妨碍了1：2区配对，则2：3配对，终止子3：4配对不能形成，转录成

功完成。

（5）衰减作用的重要性：

①是一种典型的负反馈调控。

②通过抑制和衰减的共同作用精确调控细胞中色氨酸的浓度。

③单独的衰减作用也可以产生较强的表达调控：其他的氨基酸合成操纵子，如his和leu没有抑制子调控，完全依靠衰减作用进行表达调控。 ④是一种不需要蛋白质就可以进行的表达调控，这种调控通过RNA自身的结构变化实现。

（6）小结：

抑制子是Trp操纵子的主要开关（primary switch），根据环境中色氨酸的有无决定操纵子是否表达；衰减作用是Trp操纵子的精调开关（fine switch），根据环境中色氨酸浓度的高低来决定转录是否进行下去。 14. 核糖核酸开关：

答：核糖核酸开关（Riboswitches）：RNA元件直接作为小分子代谢物的感应器，由RNA元件（如上文提到的衰减子）调控基因的转录或翻译，是一种不需要蛋白质调节子，只通过RNA结构变化进行表达调控的机制。

核糖核酸开关的作用方式：

①核糖核酸开关通过衰减机制在转录终止水平发挥调控作用。

②核糖核酸开关通过调控RNA结构，屏蔽核糖体结合位点，从而在蛋白质翻译水平发挥调控作用。

15. 核糖体蛋白是其自身翻译的抑制子：一种负反馈抑制： 答：（1）核糖体蛋白合成所面临的挑战：

①每个核糖体由约50个不同的蛋白质组成，这些蛋白质必须以相同的速度同时合成。

②核糖体蛋白的合成速度还必须与细胞的生长速度密切联系起来。 （2）核糖体蛋白的合成策略——核糖体蛋白操纵子：

①核糖体蛋白基因形成几个操纵子（operon）来确保这些蛋白同速合成。每个操纵子由多达11个基因组成。

②RNA pol亚基α，β和β’基因也包含在核糖体蛋白操纵子中，因为这些亚基的合成速度也与细胞的生长速度密切关联。

③核糖体蛋白操纵子主要是翻译调控，而不是转录调控。

④对每个核糖体蛋白操纵子来说，一个（或2个）核糖体蛋白结合到mRNA上翻译起始序列附近，从而阻止核糖体的结合和翻译起始。

⑤这种抑制翻译的调控机制是很敏感的。核糖体组装好后剩余的极少量L4蛋白即可与操纵子mRNA结合，关闭自身及该操纵子中其他蛋白的合成。 16. λ噬菌体：

答：细菌噬菌体λ是一种感染E. coli的病毒。它一旦感染细菌，就会以两种方式繁殖：裂解（lytically）或溶原生长（lysogenically）。裂解生长需要噬菌体DNA的复制和新的外壳蛋白的合成。这些组分共同形成新的噬菌体颗粒，通过宿主细胞的裂解释放出来。溶原现象——一种选择性繁殖途径，包括噬菌体DNA整合进入细菌染色体并像细菌基因组的正常组分似的在每次细胞分裂的时候主动复制。 溶原性细菌在正常情况下非常稳定，但其体内处于静止的噬菌体[原噬菌体（prophage）]在细胞DNA遭受破坏时就会有效地转向裂解生长（因此会威胁到宿主细胞的继续生存）。这种从溶原性生长到裂解生长的转变称为溶原性诱导（lysogenic induction）

17. 基因表达的选择性模式控制裂解和溶原性生长： 答：（1）当PR和PL持续开放而PRM关闭时，就发生裂解生长。相反，溶原生长则是PR和PL关闭而PRM打开的结果。

（2）调控蛋白及其结合位点：

①cⅠ基因编码λ抑制子。λ抑制子既可以激活页可以抑制转录。

②Cro（意为抑制子和其他基因的控制，control of repressor and other thing）只抑制转录，类似于Lac抑制子。

③λ抑制子和Cro可以结合6个操作子中的任意一个，每个蛋白质以不同的亲和力识别这些位点，3个位点位于左控制区，3个位于右控制区。 ④λ抑制子与操作子位点协同结合。

⑤λ抑制子结合到OR1和OR2上关闭了从PR开始的转录。结合到OR2的λ抑制子与PM上的RNA聚合酶接触，激活cⅠ（抑制子）基因的表达。OR3在PRM内，结合在那里的Cro抑制了cⅠ的转录。

（3）溶原性诱导需要λ抑制子的蛋白水解切割：

λ抑制子变得类似于LexA，这使得λ抑制子也在RecA的作用下进行自身切割。切割反应除去了抑制子的C端结构域，因此二聚化和协同性马上不复存在。失去协同性使抑制子在这些位点（包括OL1和OL2）上解耦联；失去抑制从而促进了从PR和PL开始的转录，导致了裂解生长。

为了有效诱导，溶原性细胞中的抑制子水平必须严密调控：它激活其自身的表达，这是一例正自我调控（positive autoregulation）。

PRM被抑制子（在OR2处）激活合成更多的抑制子。但如果浓度过高时，抑制子也会结合OR3，从而抑制PRM（以类似于裂解生长中Cro结合OR3而抑制PRM的方式）。这样阻止了新的抑制子的合成，直到其浓度降到释放OR3的水平。 18. 抑制子的负自我调控需远程相互作用和大的DNA环： 答：OR1和OR2上结合的抑制子二聚体与协同结合到OL1和OL2上的抑制子二聚体相互作用，形成一个抑制子八聚体；为利于OR和OL之间的抑制子的相互作用，这些操作子之间的DNA——约3.5kb，包括cⅠ基因本身，必须形成一个环。当环形成时，OR3和OL3靠近，允许另外两个二聚体抑制子协同结合到这两个位点。

19. λcⅡ，一种控制溶原或裂解生长或感染新宿主的活化子： 答：CⅡ是一个转录活化子。它结合到启动子PRE（意为repressor establishment）上游的位点，刺激从该启动子开始cⅠ（抑制子）基因的转录。

E. Coli的生长条件控制CⅡ的稳定性并因而控制裂解/溶原的选择：CⅡ在E. coli中是一个非常稳定的蛋白质，它被一个特异的蛋白酶FtsH（HflB）降解，这个酶由hfl基因编码。

当生长良好时，FtsH活性高，CⅡ被有效破坏，抑制子不能合成，噬菌体倾向于裂解生长；在恶劣条件下则相反，FtsH活性低，CⅡ降解慢，抑制子积累，噬菌体倾向于溶原生长。

第二个CⅡ蛋白依赖的启动子PI，有一类似PRE的序列，位于噬菌体基因int之前。这一基因编码一种酶，该酶催化位点特异性重组，使λDNA整合入细菌染色体形成原噬菌体。第三个CⅡ依赖的启动子PAQ，位于基因Q的中间，其作用是延滞裂解发育从而促进溶原发育。

在无N蛋白和Q蛋白时，由这两个调控蛋白控制的转录也可以很好地起始。但是，除非调控蛋白修饰RNA聚合酶，否则在启动子下游几百到一千核苷酸处转录就会终止。N和Q蛋白因此被称为抗终止蛋白。

20. 逆回调控：RNA合成和稳定性控制相互影响并决定基因表达：

答：负责负调控的位点位于它所影响的基因的下游，同时降解是沿着基因逆向进行的，所以

这一过程称为逆向调控（retroregulation）。

第17章 真核生物的基因调控

知识点：

1. 转录调控的原理：

答：可诱导基因的表达受到胞外信号的调节，这些信号通过调节蛋白（Regulatory Protein）传递给基因。

正调控或活化子（Positive regulator or activator）：增强所控制基因的转录。激活机制包括募集（recruitment）和变构（allostery）。

负调控子或抑制子（Negative regulator or repressor）：降低或消除所控制基因的转录。抑制机制包括：阻止启动子结合、阻止向开放复合物的转变和阻止启动子逃离。 2. 原、真核表达调控的相似点： 答：（1）调控原理是相同的：

外界信号（signal）刺激、胞内活化子（activator）和抑制子（repressor）传递信号、通过募集（recruitment），变构（allostery）和协同结合（cooperative binding）的方式发挥作用。

（2）调控发生的阶段相似，主要发生在转录起始阶段。 3. 原、真核表达调控的不同点： 答：（1）真核生物的调控可发生在Pre-mRNA的剪接阶段，这是原核生物调控所没有的。 （2）真核转录机器更复杂，受到更多样的调控。 （3）核小体及其修饰物影响基因的转录。

（4）许多真核基因有多个的调控蛋白结合位点，因此受到更多调控蛋白的调控。 4. 真核生物的两个特有调控元件：增强子和绝缘子： 答：增强子（Enhancer）：与调节蛋白结合，增强基因表达的序列。在不同信号的刺激下，不同的增强子与不同组的调节蛋白结合，控制同一基因在不同时空的表达。增强子常常远离目标基因达50kb或更远。

绝缘子（Insulator）或称边界元件（boundary elements）位于启动子与增强子之间，绝缘子会屏蔽增强子对相关启动子的激活，从而保证增强子的工作不会产生混乱；绝缘子也可以保证基因沉默有序进行。

转录沉默（Transcriptional Silencing）：是一种可沿着染色质传播的特殊抑制形式，不需要与各自的抑制子结合，多个基因的表达就可被关闭。

绝缘子元件可阻止转录沉默的传播，所以沉默子可防止无序的基因激活和基因抑制。 绝缘子在基因工程中的应用：随机插入到哺乳动物基因组的基因常常会“沉默”，在该基因的上游和下游插入绝缘子可以使该基因不再“沉默”。 5. 真核转录活化子的结构特征： 答：酵母是最易于作遗传和生化分析的单细胞真核生物，对它的研究提供了大量关于真核基因表达调控中抑制子和活化子作用方式的知识。

因为核小体结构和基因转录的相似性，真核基因的表达调控基本特点是相同的。 真核生物活化子（activator）的作用方式基本与细菌的相似。 真核生物抑制子（Repressor）的作用方式多种多样。 （1）活化子的DNA结合区和转录激活区是分开的： 真核活化子——实例：Gal4

已有实验证据表明Gal4的DNA结合区和转录激活区是分开的。

实验介绍1：域交换实验：Gal4的DNA结合区和转录激活区是可以分离开来分别其作用的。

实验介绍2：酵母双杂交检测（two hybrid assay）。

（2）真核调节蛋白DNA结合域的结构特征： 细菌调节蛋白：

多数运用螺旋-转角-螺旋基序（helix-turn-helix motif）与目标DNA结合。多数以二聚体的形式与DNA结合，每个单体以一个α螺旋插入大沟。 真核调节蛋白：

与原核识别DNA的原理相似，但细节上有所不同。 除以同源二聚体（homodimer）与DNA结合外，有些形成异源二聚体（heterodimer），扩大了识别的特异性。

①同型结构域蛋白质（Homeodomain protein）：是一类具有螺旋-转角-螺旋基序（helix-turn-helix motif）DNA结合域的蛋白，其与DNA结合的方式与细菌调节蛋白相同。 ②含锌DNA结合域：有两种形式：

1）C2H2型锌指：一个12个氨基酸的环，通过两个半胱氨酸和两个组氨酸固定，这四个残基与锌离子在空间上形成一个紧密的结构，由二条β链和一个α螺旋组成，α螺旋上的碱性氨基酸与DNA大沟结合。

一般来说必须有3个或更多的C2H2型锌指才能与DNA结合，在转录因子SP1中C2H2锌指重复了3次，在RNA聚合酶Ⅲ转录因子TFⅢA中C2H2锌指重复了9次。 2）C4锌指：锌离子与四个半胱氨酸结合，例如类固醇激素受体转录因子，以同型或异性的二聚体存在，通过锌原子稳定这种更复杂的构型。

（3）亮氨酸拉链基序（leucine zipper motif）：该蛋白同时含有二聚化面和DNA结合面。 亮氨酸拉链的肽链上每隔六个残基就会有一个疏水的亮氨酸残基，这些残基位于DNA结合域的C端上。

亮氨酸拉链的α-螺旋的疏水表面间可以相互作用，形成二聚体。 与对称的DNA识别位点发生作用，最终像一个夹子夹在DNA上。

（4）螺旋-环-螺旋结构域（The helix-loop-helix）：

这一结构在总体上与亮氨酸拉链相似，只是每隔单体蛋白上的二个α-螺旋被一个非螺旋的多肽链分开。

C端α-螺旋一侧的疏水残基可以形成二聚体。 实例：生肌因子MyoD蛋白家族。

碱性HLH蛋白与bZIP蛋白间可以形成异源二聚体： 与亮氨酸拉链一样，HLH结构域常与碱性结构域相邻，并形成DNA结合所需的二聚体。 碱性HLH蛋白与bZIP蛋白可以形成异源二聚体，这种结构的形成增加了转录因子组成的多样性和复杂性。 6. 激活区域不确定性：

答：激活区根据氨基酸组成进行分组：

酸性激活区（Acidic activation region）：酸性氨基酸和疏水氨基酸对于本区的作用非常重要，如Gal4.

富含谷氨酰胺区（Glutamine-rich region）：哺乳动物活化子SP1。 富含脯氨酸区（Proline-rich region）：哺乳动物活化子CTF1。 7. 活化子通过募集和远距激活的方式激活真核转录：

答：像细菌中一样，真核活化子也通过募集RNA pol的方式发挥作用，只是对于多聚酶的募集是间接的：

（1）与转录机器上多聚酶以外的某一部分发生相互作用，从而将转录机器募集到基因。 （2）募集核小体修饰物，改变基因附近的染色质结构，有利于基因的活化。 8. 真核基因表达调控中没有变构激活：

答：对于大多数真核基因而言，转录机器在没有受到激活时并不预先与启动子结合，因此在真核基因表达调控中没有发现变构激活。 9. 活化子将转录机器募集到基因：

答：真核转录机器是多聚酶和多种蛋白的复合物，这些蛋白有：中介蛋白（Mediator）和TFⅡD复合物。活化子与这些蛋白中的一种或几种相互作用，将转录机器募集到基因。

实验介绍1：ChIP染色质免疫共沉淀（Chromatin Immuno-precipitation，ChIP）：ChIP被用于观察调节蛋白与基因组的哪一部分结合。

实验介绍2：活化子旁路实验（Activator Bypass Experiment）：活化子直接将中介蛋白募集到DNA而活化转录。通过中介蛋白与DNA的直接联系来激活转录。将细菌DNA结合蛋白LexA直接与中介蛋白组分Gal1融合，可激活GAL1基因的表达。 10. 活化子也通过募集核小体修饰物的方式来协助机器与启动子的结合： 答：（1）修饰物直接募集转录机器。

（2）修饰物帮助激活包埋在染色质内，难以接近的基因。

两类核小体修饰物（Nucleosome modifier）：在组蛋白尾上加化学基团的修饰物，如组蛋白乙酰转移酶（HATs）；重塑核小体的修饰物，如依赖ATP活性的SWI/SNF。

核小体修饰物协助基因活化的两个基本模型： （1）通过核小体重塑（Remodel），使原来位于核小体内不易于接近的DNA结合位点显露出来。

（2）通过在组蛋白尾部添加乙酰基团，在核小体上产生了新的蛋白结合位点，这些位点可以与具有同源调节域（bromodomain）的蛋白质结合，如TFⅡD复合物的一个组分就具有同源调节域。

11. 活化子的远距离作用：环和绝缘子：

答：许多真核生物，特别是高等真核生物的活化子可在离目标基因很远的地方发挥作用。

（1）某些蛋白质的帮助，如果蝇中Drosophila的Chip蛋白。

（2）染色质的压缩结构使序列上相隔很远的位点可以在空间上相互靠近。 对某些基因群的恰当调控需要位点控制区域的存在：

（1）人和鼠的珠蛋白基因在基因组上成簇排列，在发育的不同阶段表达不同位点的基因。

（2）一组被称为位点控制区域（locus control region，LCR）的调控元件，位于珠蛋白基因簇上游30～50kb处。LCR与调控蛋白结合，引起染色质结构“开放”，允许一系列调控蛋白的接近并控制某个基因按顺序表达。

（3）小鼠的另一组基因HoxD受到广域控制区域（global control region，GCR）的时间空间顺序的调控，作用方式与LCR非常相似，也是一种远距离的调控。 12. 活化子协同工作，共同整合信号：

答：在多细胞生物种，信号整合（signal integration）被广泛地用于基因调控。

某些情况下，一个基因的活化需要多个信号共同作用。而每一个信号分别由不同的调节蛋白传递给基因，因此多个活化子常常共同起作用，而且这种作用是协同的。

协同性是指2个活化子的共同作用效果大于它们各自作用时的效果之和。 在细菌Lac操纵子中，2个信号整合在一起共同调控Lac的表达。 13. 调节蛋白协作的三种方式： 答：（1）多个活化子同时募集转录机器中的某一成分。例如，与中介蛋白中的不同部分解除。

（2）多个活化子分别募集转录机器中的不同成分，而单个活化子的结合是很弱的。 （3）多个活化子相互协助地结合到所调控基因的上游位点。 14. 活化子协同与DNA结合的四种方式： 答：（1）“经典”协同结合。

（2）2种蛋白同时与第三种蛋白结合。

（3）A蛋白募集核小体重塑蛋白，使被屏蔽的B蛋白的结合位点显露出来。

（4）A蛋白与DNA的结合使核小体解旋，使被屏蔽的B蛋白的结合位点显露出来。 15. HO基因受到2种调控蛋白的控制：SWI5募集核小体修饰物；SBF募集中介蛋白： 答：啤酒酵母（S. cerevisiae）HO蛋白与酵母的出芽裂殖特性有关。

HO基因受到2个活化子SWI5和SBF的共同调控，只在母细胞周期的某一时刻才能表达。

SWI5：只在母细胞中才有活性，与远离目标基因的多个位点结合，募集酶类，打开SBF的结合位点。

SBF：只在细胞周期的某个阶段有活性，没有SWI5的协助就不能与DNA结合。 活化子协同与DNA结合方式（3）：SWI5蛋白募集核小体重塑蛋白，使被屏蔽的SBF蛋白的结合位点显露出来。

16. 活化子在人类β-干扰素基因上的协同结合：

答：人的β-干扰素基因在病毒入侵细胞时活化表达，感染激活了3种活化子：NFκB，IRF和Jun/ATF。

这些活化子协同结合到位于启动子上游约1kb的增强子内的几个相邻位点。这些调节蛋白结合在增强子上形成的结构被称作增强体（enhanceosome）。

协同方式：（1）活化子间存在相互作用。

（2）HMG-Ⅰ与增强子结合，弯曲DNA，启动活化子间的协助结合。 活化子协同与DNA结合方式（1）：“经典”协同结合，2中蛋白间的直接互作。 HMG-Ⅰ在细胞中持速活化，并在INF-β基因活化中起着“建筑框架”的作用。 17. 组合控制：

答：组合控制（Combinatory control）：是真核生物复杂性和多样性的核心内容。在组合控制中，激活蛋白和阻遏蛋白共同起作用。

CAP也调控其他基因：

CAP与不同的抑制子一起，共同作用于不同的基因，这就是组合控制的一个例子。 CAP与其他调控蛋白一起，对E. coli 100种以上的基因发挥调控作用。 真核生物种存在着更广泛的组合控制：在复杂的多细胞生物种，组合控制涉及到许多的调节蛋白（活化子和抑制子）。

18. 啤酒酵母交配型基因的组合控制：

答：啤酒酵母（S. cerevisiae）有3种存在形式： 2种交配型单倍体细胞（haploid cell）：a和α。

一种双倍体细胞（diploid cell）：a/α，由一个a和一个α细胞交配、融合而成。 2种交配型细胞是不同的，它们各自表达a特异基因和α特异基因。 a细胞产生调节蛋白a1。

α细胞产生调节蛋白α1和α2。

两类细胞都产生第四个调节蛋白：Mcm1参与交配型特异基因的表达调控。

a细胞中，α细胞特异基因是关闭的，因为没有活化子在那里结合；a细胞特异基因是打开的，因为Mcm1在那里结合并活化这些基因。

在α细胞中，α细胞特异基因是打开的，因为Mcm1在启动子上游结合并活化基因的

表达。这这些基因中，Mcm1结合在弱结合位点而且只能与蛋白α1单体协作发挥作用。Α细胞中a细胞特异基因由于α2抑制子的存在而保持关闭。这些抑制子以二聚体形式结合并且与Mcm1在这些基因中协作发挥作用。α2抑制子的两种特性保证了a细胞特异基因不在这里表达：它覆盖了Mcm1的活化区使这个蛋白质无法表达；它同时还有效地抑制这些基因。

在二倍体细胞中，a细胞特异基因和α细胞特异基因都关闭。其形成如下：a细胞特异基因结合Mcm1和α2，与其在α细胞中一样，这些基因保持关闭。α细胞特异基因保持关闭，因为在a细胞中没有活化子的结合。

两种单倍体细胞（a和α）表达另外一类基因叫做单倍体特异基因（haploid-specific gene）。这些基因在二倍体细胞被α2关闭，后者在基因的上游与a1形成异二聚体与其结合。只有在二倍体中才同时存在这两种调节子。 19. 真核转录的抑制子及其调控：

答：真核生物种，大多数抑制子不是与位于启动子区的结合位点结合而阻止多聚酶的结合，与细菌中的常用方式不一样。

真核转录的抑制子的调控方式： 与活化子相反，真核抑制子通常募集压缩核小体的修饰物或除去能被转录机器识别的组蛋白修饰基团，如组蛋白去乙酰化酶，有些修饰物在组蛋白尾部添加甲基，甲基化常会抑制转录。这些修饰引起转录沉默（transcriptional silencing）。

真核抑制子的作用方式：

（1）与活化子竞争结合位点。 （2）抑制活化子的功能。

（3）与活化子竞争结合多聚酶。 （4）募集核小体修饰物（最常见）。 20. 酵母GAL1基因的抑制：

答：在葡萄糖存在时，Mig1与位于USAG和GAL1间的一个位点结合，通过募集抑制复合物Tup1，抑制GAL1的表达。

21. 信号经常通过信号传导途径被传递到转录调节子： 答：环境信号/信息：

（1）小分子物，如糖、组胺。

（2）由一个细胞释放而被另一个细胞接收的蛋白质。 在真核细胞中，大多数信号通过信号传导途径间接地传递给基因，信号在最初受体位于细胞膜上。

22. 信号传导途径（Signal transduction pathway）： 答：（1）起始信号/配体（ligand）与细胞表面特异受体的胞外区结合。 （2）信号被传递到受体的胞内区（通过受体的变构或二聚化）。 （3）信号接着被接力传递到相关的转录调控子。 （4）转录调控子控制目标基因的表达。

23. 信号通过多种机制控制真核细胞转录调节子的活性：

答：在真核生物种，信号可通过直接或间接的方式传递给转录调节子。其机制有：

（1）活化区的暴露：

①构象的变化使原来被包埋的活化区显露出来。

②释放原来被遮蔽的蛋白。如：活化子Gal4在没有半乳糖时会被Gal80结合并遮蔽起来。

③有些遮蔽蛋白不但封闭活化子的激活区，还会募集去乙酰酶，从而阻止目标基因

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