实验三 酵母核糖核酸的提取及测定（预习报告）

生物化学实验预习报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

一、研究背景

RNA（核糖核酸）普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，属酸性高分子化合物，参与蛋白质生物合成，调控基因表达，作为核酶催化生化反应活性，对维持生物体的正常发育有着重要作用。此外，由于RNA还具有较强的保湿性、抗氧化性、强烈的紫外光吸收性、天然助长性以及抗皱防衰、防病治癌等特殊功能，[1]人们在研究基础理论的同时逐渐开始对RNA制剂的开发及应用进行探索。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。目前，人们已经开始逐渐接受含RNA制剂的各种产品，需求量日益攀升，RNA制剂已广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等方面，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。但不管是理论研究还是实际应用，都面临一个问题：RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，离体之后稳定性差、含量低，采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA显得至关重要。当然，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。另外，近年来RNA试剂盒的出现使方便、快速提取纯度高、完整性好的RNA分子也实现了可能。

二、研究目标

1.了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路； 2.掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节； 3.学习酵母RNA提取和测定的操作方法。

三、研究策略

1.选材

即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料。

2.提取

提取RNA的方法有很多种，如浓盐法、稀碱法、混合盐法、苯酚法、表面活性剂法等

[2]，但在工业生产上应用最多的还是稀碱法和浓盐法。两种方法的原理不同，浓盐法是原理

是在加热条件下，高浓度NaCl改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来；稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解，释放RNA。两种方法各有特点，浓盐法的破壁率低，但提取的RNA纯度比稀碱法要高；稀碱法的破壁效果好，消耗时间短，能耗低，但提取RNA纯度较低，适于工业化生产。在实际中应根据具体情况及要求选择合适的方法。

3.提纯

提纯过程中常需要去除的杂质是蛋白质。通常采用等电沉淀法使RNA沉淀出来，使其与杂质分离，但有资料显示该法不能有效分离RNA和蛋白质，且RNA损失率较高。另外，也可使用盐析法、等电沉淀法析出蛋白质或蛋白酶降解法除去蛋白质。

4.含量测定

测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法，定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。定磷比色法准确、微量、快速，是测定RNA含量的最好方法；戊糖测定法通过糖的颜色反应测定RNA，简单、快速，当样品中有粘多糖和蛋白质存在时会有干扰；紫外吸收法简单、快速、微量，但易受到蛋白质及含有共轭双键物质的干扰。

四、研究方案及可行性分析

本实验以食品用干酵母粉为材料，采用浓盐法提取核糖核酸并用紫外分光光度法测定制品中RNA的含量。方案合理，实验材料及器具实验室均可提供，时间上也允许，故本方案具有可行性。

五、具体实验设计

1.实验仪器及试剂

仪器：UV9600紫外分光光度计、JP-100架盘药物天平、恒温水浴锅、TDL-40B低速离心机；

器具：微量可调手动移液器、普通大试管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研钵； 试剂：10%NaCl溶液、6M HCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀剂、蒸馏水； 材料：食品用干酵母粉。

2.实验步骤

（1）酵母核糖核酸的提取（7h）

称取7g酵母粉→研磨至面粉状→转移至三提取 分离 沉淀RNA 角瓶，加50ml10%NaCl溶液→彻底悬浮浸润→沸水浴浸提40min→提取液。 提取液→冰浴冷却至少10min→3500r/min离心30min→上清液 上清液→小烧杯中冰浴冷却至10℃以下→搅拌下6M HCl调节pH至2.0~2.5→冰浴4h。 冰浴后悬浮液→3500r/min离心15min→RNA沉淀→约15ml95%乙醇彻底悬浮搅拌洗涤→3000r/min离心10min→RNA沉淀（重复洗涤、离心三次）。 硫酸纸于80℃烘箱干燥→称重→边缘折叠成框→转移RNA沉淀涂布于硫酸纸上→80℃烘箱干燥5min→称重→转移大部分RNA制品于玻璃匀浆器内→称重剩余样品及硫酸纸洗涤纯化 干燥 →记录数据，计算纯度及产率。 （2）核糖核酸含量的测定（紫外分光光度法）（1h）

1匀浆液制备（15min） ○

玻璃匀浆器内加入5ml蒸馏水→匀浆至均一的胶体溶液→转入小烧杯（10ml左右蒸馏

水分次清洗并入）→混匀，2%氨水调pH7.0→转入25ml容量瓶，定容，混匀

2含量测定（40min） ○

取两支试管，按下表操作

管号 A RNA液 5ml H2O 5ml 沉淀剂 — B 5ml — 5ml A、B管混匀→冰浴20min→3500r/min离心10min→取上清液于两支试管→各0.5ml至两个50ml容量瓶，定容，混匀→测定样品OD260值。

（3）原始数据记录处 硫酸纸的重量（g） （4）结果计算公式 1制品纯度（%）=○

RNA和硫酸纸的总重量（g） 样品OD260比消光系数

剩余RNA样品及硫酸纸的总重量（g） 1

A管的OD260值 B管的OD260值 ×定量样品稀释倍数×制品纯度×总制品重

7g

定量样品重

×100%

2产率：RNA提取率（%）=○×100%

3.实验所需时间预计 本实验共需时间约8h。 4.某些试剂与操作的作用

（1）10%NaCl溶液破除酵母菌细胞壁，释放RNA。查阅资料显示NaCl浓度为8%~10%时RNA溶液的纯度及提取率较高。 （2）沸水浴浸提对破除酵母菌细胞壁起促进作用。破壁时的温度对RNA提取率有很大的影响，温度越高，越有利于细胞壁的破坏，胞内物质（包括蛋白质和核酸）释放的也越多。考虑到生产应用的方便性及可操作性，温度不超过100 ℃。

（3）6M HCl调节pH至2.0~2.5 在核酸的等电点下使其尽可能多的沉淀，达到与杂质分离的目的。

（4）2%氨水调pH7.0 中性pH条件下使RNA尽可能多的溶解，从而使RNA含量测定更准确。

（5）测定OD260值之前将上清液稀释100倍高浓度有可能超出朗伯-比尔范围，使测定结果偏差较大，稀释后测定反而更准确。

5.误差分析

（1）整个实验中搅拌过程一定要缓慢，否则会使RNA机械破碎，影响含量测定。 （2）调节等电点时应严格控制pH。因为pH过低会使核酸发生酸性水解，过高则核酸沉淀不完全，且会使杂质（DNA或蛋白质等）沉淀较多。

（3）紫外法测定RNA含量时，第一次定容要格外小心，切勿超过总体积（容量瓶量程小，只有25ml）。

六、质疑及相关思考

1.查阅资料了解到酵母的浓度以及水浴浸提时间都会对RNA的提取率有一定的影响，大部分人得出的最适酵母浓度为10%左右（与本实验相差不大），而浸提时间则从2~5h不等（与本实验40min差距较大），[3]本实验浸提时间的设置是出于什么考虑？

2.等电沉淀法析出RNA时蛋白质及DNA等杂质有多少没有被除去（一起留在了沉淀里）？我们知道，RNA的等电点为2.0~2.5，DNA等电点为4~4.5，蛋白质等电点就变化很大了，我们在保证RNA析出量最多的前提下，肯定会有部分的DNA及蛋白质杂质析出，从而对RNA含量测定造成干扰。既然如此，这些杂质对RNA含量测定的影响有多大？是否可以忽略？

3.本实验测定的是变性之后的RNA含量。我们知道，核酸变性后氢键和碱基堆积力受到破坏，使紫外吸收值升高，该现象称为增色效应。既然如此，我们在260nm波长下测定的就不是酵母菌细胞RNA分子的含量。

4.经酸性乙醇沉淀的RNA，离心之后，沉积在离心杯的底部。由于沉淀较多，用95%乙醇洗涤时肯定会不充分，很多杂蛋白不易除去，形成很多粘团，使得下面的干燥也不易操作。如果充分洗涤杂蛋白必须搅拌，这样会使RNA 被机械破碎，影响含量测定。有实验显示用苯酚-氯仿抽提法具有较好的效果，[4]由于酚-氯仿在水溶液中抽提蛋白，作用充分，又不用剧烈振荡，避免了RNA被机械切割，蛋白质又能充分去除，分离得到的RNA样品纯度较高。

5.关于紫外法测定RNA含量时的空白组设置。测定RNA含量时设置了A、B两个管，分别加入蒸馏水及等量的沉淀剂，B管的作用是沉淀RNA，作为对照。应该以蒸馏水作为空白组，分别测定A、B两个管的OD260值，B管测定值表示除RNA以外物质的吸光度值，A管测定值表示RNA及其他物质的总吸光度值，以二者之差作为RNA的吸光度值。

七、思考题

1.作为商品开发，我们更多的是应该考虑市场需求的共性还是个性？为什么？相应的，如何完成相关欲开发产品的定位？

更多考虑的是市场需求的共性。共性商品面向大众，存在广阔的市场需求，具有商业前景，一旦该产品成功投入市场就可以从中挖掘出巨大的经济效益；相反，个性产品只适用于小部分人群，需求量少。若要完成相关与开发产品的定位，就需要进行市场调查，分以下几个方面：（1）调查该产品的市场需求量和供应量，分析确定该产品目前有没有空余市场，以合理设计该产品的产量；（2）调查该产品的具体应用领域甚至该领域的哪一个部分，定位该产品的科技含量；（3）调查目前市场上类似的产品及其生产流程、成本、市场价格，要么降低成本，要么研究类似产品中所不具备的特性，分析开发新产品。

2.基于生物制品的产业开发，探讨实验室的科学研究和大工业生产之间的关系和异同处？

实验室研究往往是工业化生产的前体或者说基础。生物制品的产业开发，首先是在实验室对某种的物质或代谢途径等进行大量的研究之后，对其理化性质、生物学功能等有了非常清楚的认识，然后试着去寻求该物质的应用价值，在实验室进行小规模生产，最后再考虑大工业生产。

相同点：都需要从原料开始去探索相关的生产流程，以得到最终的产品。不同点：实验室研究设备的容量很小，很难对大型工业设备中必然出现的许多工程因素（如传热、传质、流动与混合等）作充分考察；此外，在连续运转的工业化生产上，还要保证设备的稳定和工艺的重现性；最后，工业化生产还要考虑成本、市场需求等客观存在的实际问题，因为工业化生产追求的还是经济效益。

八、参考文献

[1]应国清，石陆娥，唐振兴.核苷酸类物质的应用研究进展[J].广州食品工业科技，2004，20（02）：126~128.

[2]乔宾福.实用微生物技术[M].上海:上海科学技术文献出版社，1994.

[3]王战勇，孔俊豪.浓盐法和稀碱法提取啤酒废酵母核糖核酸的比较[J].化学与生物工程，2007，24（02）:60~62.

[4]王琪琳.酵母核糖核酸的分离实验改进及其综合利用[J].生物学通报，2002，37（01）：53.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/wado.html