猪链球菌的分离鉴定

目 录

中文摘要??????????????????????????1 英文摘要??????????????????????????2 前言 ???????????????????????????3 1.材料与方法????????????????????????4 1.1 实验材料????????????????????????4 1.1.1 病料?????????????????????????4 1.1.2 仪器?????????????????????????4 1.1.3 试剂及药品??????????????????????5 1.1.4 培养基的制备?????????????????????5 1.1.5 试验动物???????????????????????6 1.2 试验方法????????????????????????6 1.2.1 细菌涂片、染色、镜检?????????????????6 1.2.2 细菌分离培养?????????????????????6 1.2.3 生化试验???????????????????????6 1.2.4 血清学鉴定??????????????????????7 1.2.5 动物致病性试验????????????????????7 1.2.6 药敏试验???????????????????????8 2 结果与分析????????????????????????8 2.1 染色结果????????????????????????8 2.2 分离培养结果??????????????????????9 2.3 生化试验结果??????????????????????9 2.4 血清学试验结果?????????????????????10 2.5 动物致病性试验结果???????????????????10 2.6 药敏试验结果??????????????????????10 2.7 防治??????????????????????????10 3.结论与讨论????????????????????????11 3.1 关于猪链球菌致病机理??????????????????11 3.2 关于猪链球菌病诊断???????????????????12 3.3 关于猪链球菌病防制???????????????????13 3.4 结 论?????????????????????????14 参考文献??????????????????????????15 致谢????????????????????????????16

摘 要

猪链球菌病是猪链球菌（Streptococcosis suis）引起的猪的一种重要的疾病，猪只不分品种和年龄阶段均容易感染，并且能够感染给人，可导致人和猪的死亡。猪链球菌主要感染3-12周龄的仔猪。近些年来，在美国、英国、荷兰、日本、加拿大、丹麦等许多国家均有猪链球菌病发生的报道，并在世界范围内造成了巨大的经济损失。在我国南方几省也曾经一度广泛流行，给我国也带来了很大的经济损失。目前已经鉴定出了35种血清型的猪链球菌，其中以2型最重要、最为常见。2004年4月，沈阳市某种猪繁育场大范围的发生仔猪的关节炎和败血症。本次试验以无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份作为病料，并对这16份病料进行了病原菌分离试验、血清学鉴定、药敏试验、致病力试验。试验结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，而且引起关节炎症状的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素等高度敏感，而对土霉素、链霉素等具有较强的耐药性。

关键词：猪；链球菌；分离鉴定

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Absract

Streptococcosis suis disease is an important disease of pigs ,witch is caused by Streptococcosis suis.All breeds and ages are susceptible. It can infect people and may lead to the death of people or pigs. Streptococcosis suis infect piglets of the ages witch is from 3 weeks to 12 weeks usually.In the recent years ,the disease has been reported occuring in many countries such as American,England,Japan,Holand,Canada and Danmark ect. And it caused a lot of economic losses in all over the world.In some provinces in south of China the disease spread widely and caused a lot of losses too.By now 35 kinds of serum types have been appraised and the 2 serum type is most important and most common.In Shenyang the arthritis and blood pionsioning occurred in piglets widely in some hogger in May 4th,2004.As the pathological material of disease we took eight shares each of the liquid of arthrotis from the piglets sickening arthritis and liver,lungs,spleen,mesentery lymth nodes shares,and on these sixteen shares the separation experiment,the appraisal to serology ,the agile experiment of medicine and the capacity of causing disease were carried on. The result makes it known :it is the 2 serum type causing to the disease and it is lower capacity of causing to the arthritis than that of the blood poisioning; Streptococcosis suis is highly sentitive to Cephalosporin and Penicillin, but the medicine enduring of witch is greater to some such as Terramycin and Streptomycin.

Keywords: Pig；Streptococcus；Separation and Identification

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前言

猪链球菌（Streptococcosis suis）在1956年～1963年间Demoor，首次通过生化和血清学方法，对猪的败血性感染的新的a溶血性链球菌进行了鉴定，它属于兰氏R、S、RS和T群在英国Elliott(1966)建议Demoor的S群与纯化的PM链球菌相似，两者都归属于兰氏D群，他命名该链球菌相似，两者都归属于兰氏D群，他命名为猪链球菌荚膜2型，1型与仔猪脑膜炎有关，而2型菌株可感染任何日龄的猪，与1型和2型抗血清均有反应的菌株为荚膜1/2，1983年～1995年描述了35个菌株，共分成32个新的荚型，荚膜2型菌株，在所在国家发病猪中都是主导菌株，某些不常见的荚膜型的菌株，可以引起严重感染，如9型与断奶仔猪的败血症脑膜炎，肺炎暴发有关。

猪链球菌病是猪的一种重要疾病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。猪链球菌截止到目

[1]

前已发现的荚膜型已超过30多种,其中以2型最重要、最为常见。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌在我国的存在 [2]。猪链球菌可致2～6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等{3～7}。本病在猪群暴发流行时,与猪经常接触的牛犬和禽类不见发病.在猪中仔猪,架子猪和怀孕母猪的发病率高。人工感染家兔最敏感,次为仓鼠,小鼠,鸽和鸡。

病原 链球菌系链球菌科(Streptococcaceae)链球菌属(Streptcoccus)的细菌,种类繁多,在自然界中分布很广,是一种呈球状细菌,沿一个方向进行分裂繁殖,因而呈菌数不等和长短不一的链状排列。不形成芽胞,有的在病料中或含血清的培养基内能形成荚膜,为革兰氏阳性菌,一般为兼性厌氧菌[5]

。该菌在粪便、灰尘和死尸中存活很长时间,但对去污剂和普通消毒剂敏感[6]。此菌抵抗力不强, 对干燥、湿热敏感,60℃30min即可被杀死。

按Lancefield血清学分群方法,链球菌分为20个菌群,与其有关的血清群是A、B、C、D、E(P.U.V)、Q、G、L、N、M、P、R(D)、S(D)14个菌群,

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目前,A、B、C、D、E、L等6个是引起发病的主要菌群。

根据链球菌菌体荚膜抗原特性的不同,D群又分成35个血清型,即1～34型和1/2型,其中以2型流行最广,对猪的致死性亦最强,其次是1型,其他有致病性的3～5,7～9和11,1/2型等[3]。国外多由D群的某些血清型特别是2型引起猪的败血型和脑炎型链球菌病,而在国内以C群的兽疫链球菌为主,D群较少,E群则引起慢性链球菌的关节炎和淋巴结炎(脓肿)。一般的猪场都

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有2～3个致病菌混合感染,1头猪可以同时感染2～3个菌群。

诊断 根据临床症状，年龄和肉眼病理变化及镜检即可确诊。特征性临床症状有磨牙、跛行、排干粪、空嚼，淋巴结肿大，皮肤、耳、四肢末稍有出血斑。肉眼可见急性死猪全身皮肤淤血，呈暗紫色，肺充血，肺广泛散在

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小叶性肺炎，心包积液，心内膜出血，关节内有胶样的液体或纤维素性、脓性分泌物，淋巴结脓肿出血，心二尖瓣有菜花状增生物。结合涂片、染色、镜检，分离培养，生化试验，动物接种等细菌学检查即可确诊链球菌病。

防制 首先严格检疫不从疫区购入病猪和带菌猪,对病猪隔离,病死猪无

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害化处理,深埋。加强饲养管理，注意环境卫生和经常性可能污染的环境、用具消毒。为根除本病在猪群中发生最好淘汰病猪。

其次可用预防接种防治此病目前国产的疫苗主要有猪链球菌多价灭活苗、氢氧化铝甲醛苗、弱毒冻干苗,按瓶签说明使用,免疫期6个月,可达到预期效果。

再者对患病猪群要作到及时发现,尽早治疗,可通过药敏试验，确定高效药物，连续用药,加强巩固疗效是治疗本病的关键。

2004年4月，沈阳市某种猪繁育场仔猪，多为2～6周龄仔猪。出现体温时高时低,精神食欲时好时坏,一肢或多肢关节肿大,跛行或不能站应,消瘦,衰弱或突然恶化而死亡等症状。病死猪和放血致死猪均呈衰竭状，后肢皮下有淡灰色胶冻样渗出物，腹股沟、掖下淋巴结肿大，多数关节部肌肉组织化脓，脓肿局限于单块肌肉中，切开后内容物有的就较干燥，有的呈半流体状，均呈淡黄色，脓肿周围有包膜，与周围健康组织界限明确，无粘连；脓肿内容物均呈半流体或豆腐渣样。肝脾包膜稍厚无明显坏死灶，肠系膜淋巴结肿大，质度坚实，表面及切面呈黄白色。小肠及结肠的浆膜有个别小出血点，小肠粘膜有轻微渗出性。肺脏心叶和间叶出现融合，小叶性肺炎，关节和皮下脓肿。疑为猪链球菌病，为作进一步诊断，无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1 病料

无菌采取患关节炎病猪的关节液8份，编号为1～8号，无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，编号为9～16号。 1.1.2 仪器

电热恒温培养箱 型号 HG303-3K 南京电器三厂制造 电热鼓风干燥箱 型号 HG101-1 南京电器三厂制造

电热手提高压蒸汽消毒器YXQ.SG41.280上海医用核子仪器厂 显微镜双筒 型号 JENA

Anke TDL80-2B 离心机 上海浦江科学仪器厂 1.1.3 试剂及药品

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40％KOH；肌酐（Creatine）蛋白胨琼脂；氯化钠胆盐；葡萄糖；KH2PO4 ；0.2％酚红；0.2％溴麝香草酚蓝；纯乙醇；浓盐酸；１０％硫代硫酸钠；１０％醋酸铅

微量糖发酵管（上海化学试剂二厂）分别为：蔗糖；山梨醇；棉实糖；葡萄糖；甘露糖；蕈糖；乳糖；菊糖；水杨苷；马尿酸钠

药敏纸片（上海伊华医学科技有限公司生产）分别为：

头孢菌素；庆大霉素；洁霉素；青霉素；卡那霉素；链霉素；土霉素；复方新诺明；万古霉素；红霉素；利福平；氯霉素；恩诺沙星；痢特灵

猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原（中国兽药鉴察所） 1.1.4 培养基的制备

兔鲜血平板：将灭菌的营养琼脂加热融化，冷至45～50℃时，加入无菌鲜血达5%（即每100毫升营养琼脂中加入鲜血5～6毫升）倾注于平皿，待凝固后，置37℃培养1～2日，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。

牛血清肉汤：向灭菌的营养肉汤中加入牛血清，每100毫升加20毫升牛血清，分装试管，置37℃培养1～2日，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。

麦康凯培养基：取成品50克加入1000毫升冷蒸馏水，混合放置20分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸至全部溶解，高压灭菌（115℃）15分钟后冷却至50℃左右，倾入无菌平皿内，凝固后冷藏备用。

营养琼脂： 取成品41克加入1000毫升冷蒸馏水混合放置20分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸，至全部溶解，分装入适当容器中高压灭菌（121℃）15分钟，凝固后冷藏备用。

Christenrsen氏培养基：1升含蛋白胨1克，葡萄糖1克，氯化钠5克，KH2PO4 2克0.2％酚红溶液6ml，琼脂20克，调整pH至6.9。在121℃高压灭菌15分钟，使冷到55℃时加入十分之一的20％尿素液（经滤过法除菌的）使尿素含量为2％（即每1000ml中有20克），做成短斜面。

邓亨氏蛋白胨溶液：蛋白胨水溶液（蛋白胨1克，氯化钠0.5克，水100ml,pH7.6）按0.5％～1％的比例加入葡萄糖（或其他各种糖），每100ml加入1.2ml的0.2%溴麝香草酚蓝（或用1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。

甲基红试验培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5克，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。

欧立希氏吲哚试剂： 对位二甲基苯甲醛1克，纯乙醇95ml，浓盐酸25ml,

[21]

先以乙醇溶液试剂后加盐酸，要避光保存。 1.1.5 试验动物

健康小白鼠（30～35g）10只，购自沈阳医科大学实验动物中心。

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1.2 试验方法

1.2.1 染色镜检

将所采病料分别涂片，用革兰氏染色镜检抹片的制备及染色：先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量菌落在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。让其然干燥。固定用火焰固定法。将干燥好的抹片使涂面向上，以其背面在洒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手为度）进行固定。染色用革兰氏染色法。

革兰氏染色法： （1） 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2分钟，

水洗。

（2） 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3分钟，水洗。 （3） 加95%酒精于抹片上脱色，约30秒至1分钟，水洗。

（4） 加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10-30秒钟，水洗。 （5） 吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝色，革兰氏阴性菌呈红色。 1.2.2 细菌分离培养

将所采病料，分别接种鲜血琼脂平板，麦康凯平板，营养琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于改良马丁肉汤，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。 1.2.3生化试验

随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别作以下生化试验。

糖发酵试验：用灭菌接种针将待检菌分别接种于微量糖发酵管中（分别为蔗糖 山梨醇 棉实糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨苷 马尿酸钠），然后将其倒置于烧杯中，在恒温箱中37℃培养，24小后观察。凡发酵管中有变色者表示此菌产酸，凡培养基变色并产气者为此糖产酸产气，凡培养基不变色者表示该菌不发酵此糖。

维培（V-P）二氏试验：

原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetyethyl carbinol）→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol）,在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。

方法：（O′Mearaa′s试剂法） 40％KOH 5ml、肌酐1小刀尖加入于5ml（即与培养基等量）的培养物中，猛烈摇振混合。37℃培养24～48小时，加数滴试剂，略加摇匀半分钟，待试剂上浮液面，试剂呈红色为阳性反应。

硫化氢产生试验：

方法：用接种针将待试菌穿刺接种于醋酸铅培养基或硫酸亚铁培养基

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中。37℃卵育1～4天，每天检查，沿穿刺线或其周围变为黑色为阳性反应。

甲基红（M.R）试验：

方法：接种细菌于培养液中，在37℃培养2～7天后。于培养物中加入

几滴试剂，变红者为阳性反应，（从葡萄糖产酸，培养液的pH低于4.2）。

吲哚（靛基质）试验：

原理：细菌能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，后者与对位二甲基氨基

苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。

方法：以接种环接种待检细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液

中，在37℃培养24～48小时（可延长4～5天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3ml,摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2ml。在戊醇或甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。

枸橼酸盐利用试验：

方法：用灭菌的接种针蘸取待检液，在枸橼酸盐培养基的斜面上划线接

种，再穿刺接种。在37℃培养2～3天，观察培养基上是否有细菌生长，并观察颜色变化。如果有细菌生长，并且颜色变为天蓝色，则为阳性反应，说明此菌能利用枸橼酸盐。

硫化氢试验：

原理：细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S）者，其所产生的H2S

会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成黑色的硫化氢或硫化铁。

方法：在融化的琼脂内加入硫代硫酸钠溶液（先煮沸灭菌），待凉至

60℃，再加入醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装灭菌试管达三指高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺，孵育于37℃经１～２天后观察，必要可延长５～７天。培养基变为黑者为阳性[6]。

1.2.4血清学鉴定

将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用pH7.2 的0.01mol/L PBS制成1/10000～1/20000细菌悬液[11]。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。 1.2.5动物致病性试验

小白鼠感染实验：用5只20克左右重的小白鼠腹腔接种分离菌血清肉汤培养物0.2毫升，另设5只分别腹腔注射0.2毫升血清肉汤作对照。对注射后的小白鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡的小白鼠立即解剖，无菌采取肝脏，脾脏病料，涂片，革兰氏染色，镜检。并在鲜血琼脂平板上

[12]

划线分离培养。 1.2.6药敏试验

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采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20～24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药[13]。结果评定参照表1。

表 1 各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

抗菌药物名称

青霉素 土霉素 洁霉素 链霉素 庆大霉素 卡那霉素 头孢菌素 万古霉素 红霉素 利福平 呋喃妥因 氟哌酸 复合磺胺 氯霉素

抑菌圈直径（mm） 耐药 <10 <10 <10 <10 <12 <12 <10 <10 <14 <16 <15 <13 <11 <13

中度敏感 10～12 10～14 10～14 10～14 13～14 13～14 10～15 10～11

14～22 16～20 15～17

13～17 11～16 13～18

高度敏感 >13 >15 >15 >15 >15 >15 >15 >12 >22 >20 >17 >17 >16 >18

2 结果与分析

2.1涂片、染色、镜检结果

关节液、鲜血琼脂、改良马丁肉汤及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在改良马丁肉汤及血清肉汤培养物中多呈长链状。

2.2分离培养结果

37℃培养24h后，所采的16份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。在麦康凯琼脂平板上不生长。在营养琼脂上生长不好。该菌在改良马丁肉汤中底部有沉淀，在血清肉汤中

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先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

2.3生化试验结果（见表2、表3）

表2 糖发酵试验结果

菌号 项 目

蔗糖 山梨醇 棉实糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨苷 马尿酸钠

3# + - - + + + + + + - 8# + - - + + + + + + - 13# + - - + + + + + + - 15# + - - + + + + + + -

表3 其它生化试验结果

项目 菌 号

3# 8# 13# 15#

维培（V-P）二氏试验 - - - - 靛基质（吲哚）试验 - - - - 甲基红（M.R）试验 - - - - 枸橼酸盐利用试验 - - - - 硫化氢试验 - - - -

判定标准：“+”表示大多数（90%～100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%～100%）菌株为阴性。

表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。

2.4 血清学鉴定结果

将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。

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2.5动物致病性试验结果

分离菌对小白鼠致病性：小白鼠于感染后5小时开始死亡，至24小时全部死亡。死亡后解剖小数可见肝、脾、肾肿大，膀胱高度充血，胸腔集液，用心血及胸腔积液涂片，革兰氏染色镜检，发现有大量单个、成对或4-20个左右的短链革兰氏阳性球菌。对照组小白鼠未见异常。

2.6药敏试验结果（见表4、表5）

表4 药敏试验结果

菌号 3# 8# 13# 15# 平均值

抑菌环直径（mm）

头孢菌素 青霉素 洁霉素 卡那霉素 土霉素 链霉素 庆大霉素

19 18 19 19 18.75

15 16 16 15 15.5

14 13 14 13 13.5

13 13 13 14 13.25

8 8 7 8 7.75

7 6 7 8 7.0

7 7 8 8 7.5

表5药敏试验结果

菌号 3# 8# 13# 15# 平均值

抑菌环直径（mm）

万古霉素

10 10.5 11 10 10.37

利福平 红霉素 复合磺胺 氟哌酸 氯霉素 恩诺沙星 9 7

14 13

16 15 16 17 16.0

8 8 7 8 7.75

15 16 16 17 16.0

21 20 20 20 20.25

8 14 7 13 7.75 13.5

表3表明，结果敏感的药物是：头孢菌素、青霉素、恩诺沙星；中度敏感的是：复合磺胺、氯霉素、红霉素、洁霉素和卡那霉素；而对万古霉素、利福平、氟哌酸、土霉素、链霉素、庆大霉素不敏感。

2.7 防治

通过上述试验结果确定该种猪繁育场发生的猪链球菌病为猪链球菌2型所引起，对头孢菌素、青霉素、恩诺沙星高度敏感，考虑到经济因素选用用青霉素3000～4000单位／公斤体重，每日4次，肌肉注射，连续注射3～5日病猪病情得到好转。同时对所有的未发病仔猪用灭活疫苗免疫接种，并将病猪和健康猪隔离。另外，注意卫生管理，对圈舍、厂区、各种用具进行消毒。目前该病已得到有效的控制。

3 结论与讨论

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3.1 关于猪链球菌致病机理

猪链球菌（Streptoccus suts）是危害养猪业的一种重要病原菌。80年代初，加拿大由猪链球菌引起的疾病开始增加。那时仅检出9种夹膜血清型，到目前为止已经鉴定出了35种血清型的猪链球菌，其中2型是最常见的[1]。我国于1991年在广东省首次证实此菌存在[2]，1998年在江苏的人群和猪群中爆发由2型所致的链球菌病[14]。

毒力因子及其致病机理是猪链球菌病防治的理论基础，国内外均已对猪

[15，16]

链球菌2型溶菌酶释放蛋白进行过大量研究。发现猪链球菌2型溶菌酶释放的蛋白具有诱导上皮细胞融合和凋亡功能，此作用可使本来致密的细胞结构破坏，从而使上皮细胞结构失去其屏障，是猪链球菌2型感染过程中突破扁桃体和大脑血脑屏障的关键机制之一。血脑屏障有两条主要通路：血-脑通路由脑微血管内皮细胞构成，血-脑脊液屏障由脉络从上皮细胞构成。通过曾巧英等人的试验结果推断，脉络丛应该是猪链球菌2型致脑膜炎时突破大脑屏障的通路之一。有报道猪链球菌2型致脑膜炎时，大脑实质并没有发现有病变，而无论是自然感染还是试验感染猪，经长期的菌血症后，均有脉络丛刷状缘的细胞损伤，脑室中也有纤维素和炎性细胞浸润[17]。

猪链球菌2型溶血素是一种溶细胞性蛋白质毒素,其溶血活性受温度、pH值等的影响,具有酶的典型特征。试验用酶学试验方法,对其侧链氨基酸基团进行了化学修饰,探明其活性基团,尚未见报道。尽管猪链球菌2型的溶血素可被巯基等还原剂活化,但本试验显示,PCBM等对该溶血素的溶血活性均无抑制作用,表明巯基等不是该溶血素活性必需基团。猪链球菌2型溶血素经NBS、DEPC和2,3 Ｄiacetyl修饰后,其溶血活性显著降低,表明色氨酸、组氨酸和精氨酸残基才是该溶血素的活性必需基团。二硫键的断裂,使其疏水基团充分暴露,有利于溶血素与细胞膜相结合。作者推测猪链球菌2型溶血素可能是一种磷脂酶,能水解细胞膜上的脂质双分子层,进而达到溶血的功能。ＮＢＳ强烈地抑制了猪链球菌2型溶血素的溶血活性,其原因是在酸性条件下(ｐＨ4 0),ＮＢＳ选择性氧化色氨酸残基侧链吲哚为氧化吲哚,而使其丧失活性,另外,还可能引起肽键断裂,导致溶血活性的丧失。通过ＳＤＳ ＰＡＧＥ,结果为一条带,因此可排除因肽键断裂而引起溶血活性降低的可能性。这一点与嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶的修饰相一致[4]。通过9种蛋白质侧链残基修饰剂对猪链球菌2型溶血素进行化学修饰,初步确定了色氨酸、组氨酸、精氨酸残基及二硫键与其溶血活性相关,但究竟哪个基团或哪些基团参与了溶血作用,或哪些基团参与了其结合作用,还需进一步深入研究[18]。

3.2关于猪链球菌病的诊断

猪链球菌病在兽医临床上可通过临床症状、剖检症状来进行诊断。 3.2.1临床症状

最急性型：无任何前驱症状,突然发病后于次日早晨死亡,或倒地不起,

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口鼻流白沫。触摸时惊叫,全身皮肤蓝紫色, 体温42℃以上,多在12～18h死亡。

急性败血型：此型主要由C、D、L链球菌引起,常为暴发流行。突然发生,全身症状明显,精神沉郁,食欲不振或废绝,体温40.5～43℃,多集中在41.3～41.6℃间,稽留热,眼结膜潮红,有泪迹,鼻盘微红但仍湿润,流鼻液或浆液性鼻漏,有的从口角流出少量黏液;便秘、粪干硬,有的表面上附有黏膜;尿黄或赤褐色。两耳、鼻腔、颈、背部、整个下腹皮肤、四肢内侧呈广泛性充血、潮红或紫斑;数小时内可见后驱软弱,两后肢交叉或并在一起支撑,难以站立,甚至后躯麻痹,四脚运动不协调,运步强拘跛行、后期有的呈犬坐姿势,呼吸短促或困难,可听到喘息声,人为驱赶或触诊尖叫,有的出现抽搐、空嚼或昏睡等神经症状。病程经过急,治疗不及时,2～3d内死亡,死前天然孔流出暗红色血液,病死率达80%～90%。

脑膜脑炎型：主要由R、C群引起,但L、S群等也可引起发病。常见于仔猪因断乳、去势、转群、气候骤变等诱发。体温40.5～42.5℃,不食、便秘、震颤,有浆液性或粘性鼻漏。病猪表现出神经症状,如角弓反张、抽搐、共济失调、失明、耳聋。继而后肢麻痹,前肢爬行,四肢作游泳状或昏迷不醒等。个别病猪出现多发性关节炎,关节肿大,跗关节外侧及上、下方见1～3个鸽蛋大小肿胀。最急性者几小时或1～2d内死亡。病程达3～5d者,有部分猪的头、颈、背等部位出现水肿,指压凹陷。

亚急性或慢性：由上述2、3两型因治疗不及时或药效不足转化而来或在流行的中、后期也会出现亚急性或慢性病例。主要表现为关节炎,心内膜炎、化脓性淋巴结炎、脓肿、子宫炎(流产)、包皮炎、乳房炎、咽喉炎及皮炎等。呈散发性或地方流行性,其特点是病程长(十几天至一个多月),症状比较缓和。

关节及心内膜炎：病猪体温时高时低,精神食欲时好时坏或吃半饱,一肢或多肢关节肿大,跛行或不能站应,逐步消瘦,衰弱或突然恶化而死亡,或逐渐好转而恢复。

化脓性淋巴结炎：以颌下淋巴结化脓性炎症为最常见,咽、耳下、颈部等淋巴结发炎肿胀、硬、热、痛,皮肤坏死。由于局部的压迫或疼痛,可影响采食、咀嚼、吞咽,甚至使呼吸产生障碍。当化脓成熟,破溃之后流出脓汁,全身症状也显著好转,长出肉芽组织,结疤愈合,病程3～5个星期,一般不引起死亡。

3.2.2剖检症状

最急性型：主要病变是脑膜明显充血,脑室不同程度的积水;心包积液增多,淋巴结肿大,充血,血凝固不良,其他脏器无明显变化。

急性败血型：以出血性败血症病变和浆膜炎为主,血凝不良,皮肤有紫斑,黏膜,浆膜下出血。浆膜腔积液含有纤维素。鼻腔有黏液和泡沫,鼻黏膜紫红色、充血及出血。喉头、气管充血,常见大量泡沫。肺充血肿胀,切面出血,

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有的肺表面有散在淤血斑。心包增厚,表面粗糙,心内外膜有出血斑点,心耳及冠状沟脂肪有豌豆大小出血点,心脏色淡。少数心包腔、胸腔、腹腔有淡黄色积液,部分病例有纤维素性渗出。脾多数肿大呈紫黑色、暗红色或紫蓝色,边缘有出血性梗死灶,少数增大1～3倍,柔软而易脆裂。胃和小肠黏膜有不同程度的充血和出血。

肾脏轻度肿大,充血和出血,表面和切面均有小点出血,尤以肾乳头多,在皮质、髓质交界处有黑红色出血点。肝肿大、胆囊充盈,呈深黄色,肝表面有散在的芝麻大、黄豆大和蚕豆大化脓灶,切面外翻,肝实质淤血。膀胱粘膜充血或有点状出血。胰腺充血、浆膜与间质炎性水肿。全身淋巴结有不同程度的肿大、充血和出血,有的肠系膜淋巴结为甚。少数病例在颈、背部等部皮肤潮红,经热水浸泡刮毛后特别清楚,如“刮痧状”。

脑膜脑炎型：脑膜充血、出血,严重者溢血,少数脑膜下充满积液,脑切面可见白质和灰质有明显的小点出血。部分病猪在头颈、背、胃壁、肠系膜及胆囊壁有胶样水肿。其他与败血症型变化差异不大。

亚急性或慢性型：心内膜炎时,心瓣膜增厚,表面粗糙,在瓣膜上有菜化样赘生物,常见于二尖瓣或三尖瓣,有时还见于心房、心室和血管内。关节炎时关节红肿,切开关节囊,滑膜充血,有出血点,滑液稍混浊呈红黄色,关节面粗糙。严重者,关节囊内外有黄色胶冻样液体或纤维素性脓性物质[8，9]。 3.2.3类症鉴别

败血症型猪链球菌病易与急性猪丹毒、猪瘟相混淆，应注意区别。 急性猪丹毒：采取脾、肾、血液涂片，染色镜检，可见到革兰氏阳性（呈紫色）小杆菌。

猪瘟：皮肤和肾有密集的小出血点，有脓性结膜炎，无跛行状，病程较长，各种治疗无效。

3.3 关于猪链球菌病防制

病猪和带菌猪是本病的重要传染源。病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体，所以，首先应加强对健康猪的免疫。链球菌是条件性致病菌,加强生猪饲养管理,合理搭配饲料,加强环境卫生管理体制,粪便发酵等,定期消毒,畜舍用消毒药品交替使用,防止细菌的耐药性。如畜舍用“百毒威”高效广谱消毒剂１∶５０００～６０００常饮水消毒,１∶５００～６００喷雾２０毫升／米３,工作服、器皿等１∶５００浸泡洗涤。１%过氧乙酸喷雾消毒,消毒池１∶８００稀释,每２天消毒液换１次,过道用２%氢氧化钠每周消毒１次［20］。另一方面，在发病后，加强病猪和健康猪的隔离，根据实验室所做的药敏试验结果，配合药物治疗，建议用头孢菌素、青霉素、洁霉素等药物治疗。并且可选用中草药治疗也有很好的疗效。如猪群选用:二花、连翅、知母、沙参、陈皮、花粉、云苓、生地、甘草,一剂二煎一次

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灌服,日服一剂,连用二剂[21]。千里光、紫花地丁、金鸡凤尾草、板兰根、枫

[22]

杨、大叶桉、野菊花等对本菌有较强的抑制作用,可选用煎服。

免疫预防:４５日龄苗猪５０头份猪链球菌苗５０ｍＬ生理盐水,每头猪肌肉注射１ｍＬ,间隔２个月再免疫１次,种公猪每年免疫２～３次。对未发病的猪口服0.07～0.1克,服药间隔时间８～１２小时,连服７天为一个疗程。病猪隔离,病死猪无害化处理,深埋[20]。

自家灭活疫苗预防:为了确保种猪场的安全,用本场分离的链球菌菌株制造灭活菌苗进行预防接种。具体方法是用分离的链球菌接种于含牛血清的缓冲肉汤中,培养２４小时,镜检无杂菌,活菌数为１５０～２００亿／ｍＬ,然后按常规制成灭活菌苗,免疫仔猪。经过１５天后,用同源菌攻击,结果能抵抗等量同源菌的攻击。然后猪场用该灭活菌苗进行了预防接种,猪场的猪群再无发病,猪群生长正常[23]。做好生产种公、母猪的链球菌菌苗接种工作。病仔猪的母猪及可疑病猪及时淘汰。

3.4结论

3.4.1 从沈阳市某种猪场发病仔猪中分离出一株链球菌，经细菌学诊断和血清学诊断确诊该链球菌病为猪链球菌2型。

3.4.2 药敏试验结果表明，该分离菌对头孢菌素、青霉素、恩诺沙星敏感，对复合磺胺、氯霉素、红霉素洁霉素和卡那霉素中度敏感，而对万古霉素、利福平、氟哌酸、土霉素、链霉素、庆大霉素不敏感。

3.4.3 对发病的猪用青霉素等敏感药物进行治疗，同时配合应用灭活苗，使病情得到有效的控制。

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致 谢

本论文是在沈国顺副教授的悉心指导下完成的，从选题到资料的收集，实验阶段的指导和论文的写作和修改等个方面给予精心指导。

在实验过程中刘丽霞老师给予了热情的指导和大量的帮助，特此感谢。同时感谢杨墅，周远斌在材料的整理过程中给予了热情的帮助。

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