以乳糖为诱导剂的高密度发酵 - 褚仲梅

中国医药工业杂志　ChineseJournalofPharmaceuticals2001,32(11)

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文章编号:

1001-8255(2001)-0491-03

以乳糖为诱导剂的高密度发酵

褚仲梅1,　申秀云1,　刘现杰2,　屈贤铭1

(1.上海生物工程研究中心,上海200233;2.珠海亚利生物工程有限公司,珠海519000)

摘要:以重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(rETIa)为目的产物,用摇瓶比较了以异丙基-半乳糖苷和乳糖诱导表达的差β-D-异,并在15L发酵罐中,以乳糖为诱导剂进行高密度发酵,摸索了诱导后碳、氮补加工艺对产物表达的影响,成功地使菌体密度达到61(A600),表达量达到菌体总蛋白的33%,为乳糖替代IPTG在工业生产中应用提供了借鉴。关键词:乳糖诱导;高密度发酵;重组刺桐胰蛋白酶抑制剂中图分类号:TQ925　　　文献标识码:A

随着生物技术的发展,许多基因工程重组蛋白

在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。lac及其衍生的启动子被广泛地应用在该领域中,通常这类启动子都用异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,进行诱导外源蛋白的表达,但IPTG成本高并污染环境,不适于工业生产。国外有以乳糖替代IPTG发酵的文献报道

[1～4]

1.4　培养基

LB固体平板培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,氨苄青霉素0.1,琼脂粉20;pH7.0。

LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,氨苄青霉素0.1;pH7.0。

发酵罐培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉10,NaCl4,NH4Cl15,KH2PO42.67,Na2HPO4·12H2O5.3,氨苄青霉素0.1;消泡剂0.2ml;pH7.0。

发酵罐补料:

补氮培养基(g/L):蛋白胨200,酵母粉100。补糖培养基(g/L):葡萄糖500,MgSO4·7H2O3。诱导乳糖培养基(g/L):乳糖333,MgSO4·7H2O1.5。

,我们在长期中试工作的基础上,

以重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(rETIa)为目的产物,用乳糖诱导lac启动子表达T7mRNA聚合酶,再

由T7mRNA聚合酶诱导T7启动子表达rETIa,摸索了以乳糖代替IPTG诱导重组蛋白的发酵工艺。通过努力,基本能用乳糖完全代替IPTG,并达到相当的效果,已成功地应用于本研究室和公司的协作项目中。1　材料与方法1.1　菌种

重组大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和质粒PET-22b,由日本Kyushu大学YoshiakKouzuma博士惠赠。

[5]

1.5　摇瓶及发酵罐培养方法1.5.1　摇瓶培养

取于-70°C保存的甘油菌种,于LB平板上划

出单菌落,将单菌落接种于LB试管中,37°、250Cr/min培养过夜,1%接种于摇瓶(LB装量为50ml/250ml瓶),37°C、250r/min培养约2h至A600约为0.5,共作四份,分标示A、B、C、D。A瓶加1mmol/LIPTG诱导,B瓶加1mmol/LIPTG和1%葡萄糖诱导,C瓶加2%乳糖诱导,D瓶为对照品。其后不同时间取样进行电泳,测定其表达量。1.5.2　发酵罐培养

将试管培养过夜菌1%接种于LB三角瓶(LB装量为100ml/500ml瓶)中,37°、250r/min培养C9h,5%接种于发酵罐。发酵罐起始装料6L。在乳糖诱导前期,流加葡萄糖,发酵6h之后,停止流加,待溶氧量迅速上升后开始乳糖诱导,方法1～3的各罐工艺如表1所示,在不同的时间补加乳糖和氮源,整个过程用2mol/LHCl和2mol/LNaOH控制pH7.0左右。

1.2　试剂

酵母粉为Oxoid产品,蛋白胨由日本制药株式会社提供,IPTG购自上海皓嘉科技发展有限公司。

1.3　主要设备仪器

G25-KC旋转式摇床(美国NewBranswickScientificCo.Inc.);DU7500分光光度计(美国Beckman公司);Mod-el200/2.0电泳仪(美国Bio-RAD公司);UltroscanXLEn-hancedLaserDensitometer电泳扫描仪(美国Pharmacia公司);15L发酵罐(德国BBraun公司)。

收稿日期:2001-04-03

作者简介:褚仲梅(1964),女,高级工程师,主要从事发酵工艺研究工作。

Tel:021-64700892*353

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中国医药工业杂志　ChineseJournalofPharmaceuticals2001,32(11)

表1　发酵罐诱导后的3种工艺控制方法(ml)

补料时间(h)*

方法

物料

6h

1

乳糖氮源乳糖氮源乳糖氮源

300200300200300200

300300

600200600200

600

600300

7.5h300

9h600

10h

12h

2

3

图2　摇瓶诱导后的产物表达

— —A瓶,—■—B瓶,—*—C瓶

*发酵罐接种后,发酵开始为0h。

1.6　分析测定

分光光度计A600测定菌体密度;摇瓶及发酵罐样品经15%SDS-PEG电泳后,用电泳扫描仪扫描,rETIa的表达量为其对应的扫描面积占整个图谱面积的百分比。2　结果与讨论

2.1　在摇瓶中比较IPTG与乳糖诱导的差异

如图1、2所示,A瓶用ITPG诱导后,相对于未诱导的对照D瓶,其生长马上受到阻碍,并伴随着rETIa20%左右的表达,而以乳糖诱导的C瓶,则在诱导初期,生长几乎很少受到影响,以后随着产物的表达,代谢负担的加重而受到阻碍,B瓶因诱导时同时加IPTG和1%葡萄糖,其生长在诱导初期优于A瓶,但因IPTG迅速诱导产物表达,而逊于C瓶。由此可见,乳糖诱导后,菌体有一个表达滞后、代谢调整的阶段,虽然LB培养基成分较复杂,但并未影响细菌对乳糖的吸收利用,仍能成功地进行乳糖诱导。

[6]

诱导后工艺的控制尤为重要。诱导前后的总和构成了产品经济效益的一部分。

我们在发酵生长期后期,停止流加葡萄糖,待其耗尽,溶氧迅速上升时,开始加乳糖诱导。如表2,在方法1中,所用的有机氮较少,菌体密度低,表达量也低,方法2中,我们增加了有机氮,菌体密度大幅上升,表达量也提高了近一倍,但在发酵后期,溶氧上升,显示乳糖加量不足,所以在方法3中,我们再增加乳糖用量,终于使菌体密度(A600)达到61,表达量达到菌体总蛋白的30%以上(如图3、4所示)。同以IPTG诱导的发酵一样,乳糖诱导后的控制,尤其是碳、氮的控制非常重要,与IPTG不同的是,乳糖在其中既是碳源又是诱导剂,只要方法得当,是可以替代IPTG,应用于工业生产的。

[7]

图3　方法3的菌体生长与表达

— —A600,—■—rETIa表达量(%)

图1　摇瓶培养的生长情况

— —A瓶,—■—B瓶—*—C瓶,—▲—D瓶

2.2　发酵罐中乳糖诱导后工艺的研究

整个发酵过程以诱导剂的加入为分界线,分为菌体生长期和产物合成期。我们认为,在菌体生长期,应尽可能在短时间里使菌体达到一定的量,且这些菌体具有较高的产物合成能力;而在产物合成期,

图4　方法3的发酵产物电泳图

1—诱导前发酵样品;

2～9—分别为诱导后1～8h的样品;10—分子量标准。

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表2　3种控制方法的发酵结果

方法123

A600测定值0.70480.60370.6097

稀释倍数

50100100

菌体密度A600356061

rETIa表达量(%)

132533

inEscherichiacoliunderfed-batchfermentationcondi-tions[J].FEMSMicrobiolRew,1994,14(99)∶99-102.

[4]　GombertAK,KilikianBV.

Recombinantgeneex-pressioninEscherichiacolicultivationusinglactoseas

inducer[J].JBiotechnol,1998,60(1-2)∶47-54.[5]　KouzumaY,YamasakiN,KimuraM.TheTissue-typeplasminogenactivatorinhibitorETIafromEryth-rinavariegata:

Structuralbasisfortheinhibitoryac-tivitybycloning,expression,andmutagenesisofthecDNAencodingETIa[J].JBiochem,1997,121(3)∶456-463.

[6]　T.萨姆布鲁克,E.F.里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆

实验指南[M].第二版,北京:科学出版社,1992.880-886.

[7]　WongHH,KimYC,LeeSY,etal.Effectofpost-inductionnutrientfeedingstrategiesontheproductionofbioadhesiveproteininEscherichiacoli[J].Biotech-nolBioeng,1998,60(3)∶271-276.

参考文献:

[1]　NeubauerP,WolffC,HeckerM,etal.Introduction

ofthelac-promoterbylactoseunderfermentationcon-ditions[J].ActaBiotechnol,1991,11(1)∶23-29.[2]　NeubauerP,HofmannK,HostO,etal.Maximizing

theexpressionofarecombinantgeneinEscherichiacolibymanipulationofinductiontimeusinglactoseasinducer[J].ApplMicrobiolBiotechnol,1992,36(6)∶739-744.

[3]　NeubauerP,HofmannK.Efficientuseoflactosefor

thelacpromoter-controlledoverexpressionofthemainantigenicproteinoffootandmouthdiseasevires

HighDensityFermentationUsingLactoseasInducer

1121

CHUZhong-Mei,　SHENXiu-Yun,　LIUXian-Jie,　QUXian-Ming

(1.ShanghaiResearcherCenterofBiotechnolgy,ChineseAcademyofScience,Shanghai200233;

2.AsiaLionBiotechnologyCo.,Ltd.,Zhuhai519000)

:RecombinantErythrinavariegatatrypsininhibitor(rETIa)wasusedasareporterpro-ABSTRACT

teininthedevelopmentofahigh-densityfermentationprocessinwhichlactosewassubstitutedforIPTGasinducerofT7promoter.ItwasfoundthatlactosewasasefficientasIPTGinshakerflasksandfermen-tors.Throughproperpost-inductionnutrientfeedingstrategy,ahighcelldensityof61(A600)andhighex-pressionlevelofproteinrETIa(33%ofthetotalcellprotein)wereachieved.

KeyWords:lactose;induction;recombinantErthrinavariegatatrypsininhibitor;highdensityfer-mentation

通知

由中国药理学会和中华医学会青岛分会联合主办的“全国第二届临床心脑血管病学术会议”定于2002年5月在昆明或西安召开,现将会议征文有关事项通知如下:(1)征文内容　心脑血管疾病的基础与应用基础研究、临床研究、介入治疗学研究及护理;心脑血管药理的基础与应用基础研究;临床研究方案的设计与统计方法研究等。(2)必须是未公开发表的学术论文,或本人研究工作的综述。声明无一稿多投并加盖单位公章,文责自负。按《中国临床药理学与治疗学》杂志论文格式撰写,每篇交审稿费30元。截稿日期为2002年3月30日。(3)入选论文将以全文、摘要形式分期刊登于《中国临床药理学与治疗学》杂志(CN34-1206/R,ISSN1009-2501)和《青岛医药卫生》杂志(CN37-1249/R,ISSN1006-5571)。

来稿请寄:安徽省芜湖市皖南医学院弋矶山医院内　《中国临床药理学与治疗学》杂志编辑部收。邮编:241001,请于信封上注明“心脑血管病学术会议”。联系电话:0553-5738856*2333,5738350。

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