牛脂联素基因真核表达载体的构建及鉴定

脂联素

H nij n ln cn eeo g aA ig ic il am eS4

a d VeeayMei ie n it r rcn dn

N 2 0 9 o1 2 0

脂牛素基因联真核表达体载构建的及鉴定黄海龙 王，哲 于健国孙，,佳 (吉.大学林畜牧兽医学院，1吉长林春10;.63022林吉农业大学动科学技物术院，学吉林长春10 1 3)18 图分中号类 8: 32￥文献标识码： 文章编A号：40 04—2 02— )0—43 10 73 0(9 1 000

关键词：;牛脂联素基因；真核表达载摘体：要了构建脂联牛素基真核表达载体因，为试验采用 RT— P方法扩增R牛脂联素 o(iae iC b vd— n pcnB vnD 基N因 o,e t oA, P i)将其克隆到p 1 M D一8T体载中，正序的质确粒经 Eo I和 N测 ctR Io双酶 ,切回收目基的片因将段定其向克隆到pIZ tC o A载体P中，建重质粒组p Z￣I oA P结果表。构 P C Bo vDN A明：克隆基因的序与 G n列 ka Be n布的公序有 10列 0%同源性的；目的基因向正插入，阅读框正确无误 ,说牛明脂联素基因真核表达载体构建功成。Co s ric n d ieat c o fe tkr oi xr s nvi c obfvn d pnc i ee nutt nd ni ai n o a yut ep se o eroto iea oi e t n g oif cH n AG H oig, N h Y u— i e U Na a— l AWG Z e, U G jo n t l, n a .( lCg fi aS i c nee r Menni,nUii ir, hnc u36 C a2 ieooe a S i i nceh go, 1 oeeo m l ec a eV tdia dc eJ iv syn Cag hn 012,h;n. C glf m celea d cnlT y l A n n r yi l e t An l n o iJ gi l rUlie i, hn uc 3 1 8C ia n A i rt a uvnr t C agh n 1 0, h n l) c u s 1Kye r sBoi ;ed pn i c e; u ea ty xr s inv c o yow: vd n ai eo g t

n e kr o i e eps o e t r n eA t abt T o r s cu a t y xrs in v c o bfvn dp nc ei et ef lnlt DAN no i AgPDN oo i ew a pm i e ys r c: o c tnt kr i e op es o t eo ro i e i o aet g n,h u l e g h cue cn e dcn fb vn sal d b ifTR—CRP w hi p cfcp m e .h nt e g n f t t e se i r r T e h e e o hi si ADPN wa ln d t i v eoc s co e not e rtTI . sw bs nl id th u a ty x s r i n c vo h at u c e noo te ek ri eo pe so e rt cpI Z t at rte s qec si e te y d ul e it tn e d nc e s sd g is na d q es cn n lss Th eu t os dt a h CP Ac e h ef u ne w d na i bd o b e r sr i n uo ale i te o ne u n gi aa y i. re sl h w e tthe if ocsg n am ns oe 0%i ett y PA DN hc a en d p se neG n t k adt ae i tn dr c if h b e tee ef ge th w d1 0 r dn i D N Acw hih d b e e o i i d h e B n a as,l a i i t n o oejci t o t b go o e tvg rg n n scr et n is e gme twt o r ce d n r m e Is do t u aa y tx r s i n v o c PI c—A Bve e f me tawa or c dwa ane nic ert ra i gf r ah a t . hew ht ker o i pe es o e t rp CZL c AoDP N h d e b o s rce u scf l .a e nc n t d stc eusl u y研究发现，脂肪织除组存储三酰甘油，外具有 活跃还的内分泌功能… 分，泌的多种激素与细胞 其因

入母基酵因组

、导分泌达表重组牛脂联素定奠了基 础诱。 1材料和方法子参与神经、内泌分与免网疫络调的节，是对其能尤量谢代调的节具 重要有的作 用其中的脂。细胞肪特异因性子——抵素抗e( ii r) s和t脂素联 (pd n sc an ioe .

11菌株和质粒、及要主试剂 .酶

酵母达载体 p表IZ x自购 vrgIn公司； PC A,(n oi et限性制内切酶Eo / o I、 Xac I NR tE Tq酶 a, a公 a司 T KRtn AE可通自分泌过 i、, D ) No旁分泌、分内泌方等式 胞参与机体多种的生理程过，特是对糖别和脂肪代谢 的调节脂联。素是肪脂织组泌分的类肽激之素一，具有增胰强岛素感敏、性血糖高、脂肪节代谢作用的，抗 调是体机脂质谢代血和糖稳态调控网络的中要重调

生产节；D5 L态受细菌、胶回试剂收盒、有寡 H o感凝所核苷酸和引等物，由上生海工生物工技术服务有程 均限司公供提； D一20 0 LMre,春 宝泰公克司生 0 kar长产；大肝肠 D菌 5由￣林吉大学农学部畜牧兽医学 H,c院营代养谢病实验室保存。 12 . R—PTR增扩的目基因C根据已发表的基因序列设 1对计特异性脂联牛素基扩因增引物，义正引物为 5一 C AT C G . A GAr G AG ACA GA G T一3,义 物引为 5 ACTGA反 A一C CG . G C A G垒！垒垒！::’ A AI’ 一3。 ::: ’ A AI Ic I :” I !c’’。 I G A正义引物下划线分部 E为 o酶位切点，义引物 cR I反划下线部分分别为 N t o切位点和肠激酶酶 位切 I酶点。该引物定义全长7 1 b0 p的联素基脂因。 RP反 C条件：4应o i;4 4℃ 9℃,1 nm7℃ 9 C 3 r n 9a 5 5 S i,2 1 m共 n 3 i,O个 环；循 2o1 。i PR产物经 C 70m Cn

因子。围以期产能负量衡平为病理学基 的础酮病和肪脂等肝能量代谢障碍性疾病是 牛奶重 要群的发性常见病。在但这些疾病中，肪细胞特异因子对脂性脂肪员动的控调作用前目还不清楚 _。研究成功

构 2 J建了脂牛联素基因真核表载达，体为进步一其将化

转收稿日期：0— 59—8修回日期0: 9— 21 2 0 0 0;20 0~7金项基目国家：然科学自金项基目 (0 7 5 3:35 16 )吉林农大业学年青动基启项金目

作者介简：海黄龙(9一)3男， 17 ,师讲，博研士生究.讯作通者：王哲 (9一)男 0授，,士 . 15 教，硕

《

脂联素

江龙畜牧 医兽技》版黑科08 .%琼脂凝胶糖电泳检测，D A收回剂试盒回收 用N增产扩物 。 M

2 0 09年1 2月 ( ) 上5

31基 因隆与克酶鉴定切.将回产收物与 Dp8 i 线p性粒按照质 M1一TS l m 4:e比1例混，合 1的于 6℃进连接反应行过夜。以连接物产化转 Ec J 0 l在含苄氨西林琼脂的平板 oi .1M9, 进上行蓝白斑选。挑筛取阳性落菌经P R扩后增进 C行鉴定，时小 量抽提质粒 p同MD 1一8TB v— N,D oAP 以 E eo IR N和t 对po I M D18 T一—B DvN重组质 oA P

21

M .L 0一r e;. C D 20 0 Mar1P Rk增扩物产。

进行粒酶双切，琼糖脂凝胶电泳鉴定将鉴。定正确用重的组粒质送海生上工生 工程技物术 服务限公司有测序。

图2阳性落菌P扩R结增果 CF i Th g2 ePCR I eo t o i e i cln r s I p ft s ooy l v

14真 核达表载的体建与鉴构定 .测正序确的 pM D18 T—B一vD重组N质 粒用 A oE P o和 Nt双酶切后回收目片的，段同酶切样 cR IIo 与M

的 IZp t质粒 1℃连接过夜 ;化大肠杆菌PC Ao6转 D5 H￣感受态c胞细，含 Z io2 g L的低盐 L 用 cn(5 e m/ ) B平筛板选培养；取阳性重组穿 质梭 p I Z粒￣—提C cP A PAD N进行 R、P酶鉴切，将定鉴定正确重的组 C并双粒送质海上工生物生pbp b p务有限服公司测序 。O pO一0 O /技术b 一0 p工 程一f b lb \ b 72 55O5 O 0Op 2结果30 0b0 p 2 00 b p 0 1 00 bp 0 7 b0 5 p 5

0b p 02 0b p 5 1b 0 0 p7 p01b 2 1 R扩增 P果结 . CM. L一20 M0kr1a酶切产物。 D 0 re;.以 cN为模板进行P R扩增，到 1条 DA约C得 7 1b的特异 DA片 ,段大小与预期 段片理论值 0 p N其相符(图 1。 )见

图 3重组质的粒 E/ oI o切定鉴 RcI N t酶F g 3 i eDt n o eoi g i s rfc mb n lns d b o i at p ami y

c E RI/t I No o见图 4。

M af0 EccR 1—tr oa

2 00 0 10 0 0 70 5 5 o0 0 5 21 007 1 b 0p

M L一20. Makr1 0脂联基因 P素产 R物 D。0 r;. e C

图 1脂联基素因PR扩增果结 CFi The R T—CRP el ufA DNP g1 r sto~

。

22克隆与切酶鉴定结果 .回收目的DA 段，其片克到 p隆 1 N将 MD 8T一 Sml i p载体中e,组质粒用 RP扩增，到 1条约重 C得 7b 01 p的异 D A片段特 (图2 E;o N见 )用 cRI和 N t oI双酶得切到30 0, p20条片 (段图 3与，0 7 1 b见 )均图4重组穿梭质粒 p I Z tPC A—oBv N的构建 DA PFio Co s cr nio e o g n 4 t ut of c mbrn n sld a ti pam pi IP CZAo— oB AD￣ P N

预期 v小相符大。性重阳组质 粒测序结 果也证实目的 基因片段已经插入到 MpD1 8一TmpeS载体E o i lcR I 和 NIt的酶切位点之间。 o 23真核表达体载构的建鉴与定结果 .组重梭质穿粒 Ip Zt PCe A— AP构的建示意图 D

提N取p I Z载A体质粒 , Eo PC￣用 cR和I N otI双 切酶，回酶收切片段同与样用酶切双得到的目基的因段 1片 6连℃接过夜，转化受感态大肠杆 菌D5L筛H o,选阳性落菌，以组重子 p I Zx PCc AA P D N—为模进板行P R扩增可得到约71 bC 0 p的核酸 段片(图5 见 ),H

脂联素

ni n njm l cn

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ad V t n rr dnc n ee aiye iMei№1 2 0 2 0

9o E cI和 N tR oI双切酶到 36得07 1b片段 0、 0p条 (2图 6,预 期片段大小相。阳符性重 质粒组见与) IpZt P cCA— PAD N的测结序果也显示目的因正基向插入，阅读框正确无误，明脂联牛素因真基核表载达说体构成建功。

时又同对表可的蛋达进行翻白后译加工与的修饰，而使表达从出的白蛋具有物生活性 能分；泌源外达表还蛋白到培养液中， 纯于 j化利鉴。此于，验应用酵试母为作表达 系统，用lZtp表为达体载因。应PCo A作此，建构高表达的载体对于提高外源基因表达的量尤为要重，源外因密码基子应尽选用量毕赤母酵偏爱的码密子。为此，目的基因序列与赤酵母毕偏爱密码将子进行了比较 ,结果表明毕赤酵母爱密偏码子在目基的因中的用频率很使高因。此，目基的因原序列不必7 01 l 2

进行改造直，接进行P R扩。为增防止增产扩物可 C产生变，突试在验P扩增时选R用的是 T R公司K Ca a5a 2 O 9O

05 O 5 0

O OO O的高保真qT N Da聚合A。p酶D 8一 M1 T体载克测序隆和 pItZPC c载A体克隆亚测均序上由海生工生物 程工技服术务有限公司成完，果表明该基因序列 结与 nGa k公布序列的的同源性为 1, 0eBn 0 %未产生任何变突。且的目因正基向入插，阅读框确正误。牛脂无联素基因真表核达体的载成功建构，进一为研步究脂 M.一L 0 ak 1~r. D 00 M 2r;e4联脂素引物增产物扩。

bp p b p b bpb p

5图p Z I—AB Dv N粒质P R鉴结定果 PC a o APC F g 5 Ie ti a o f Ip Z—ao BAPDi dn i ct no P C f i vA N p sdb ami y PRC M

630 0

联素在奶酮牛病和脂肪 肝能量等代谢障碍性疾 中病所发挥的用作奠定了基础 。20 b0 0 p

参考文献：[] MI J h dEptca n deen

e Jl. A i,c 1N RJI . eaToiy s na f eco[l] n tSie a 2 08( ) 9~591 40,23:3 . 4 7 0

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1酶切物产； M.双DL~200 Mark 0 re。图6 p lZ PtC cABv D— N粒质Eo /oI oA P Rc I t N切酶果结 F i I e tf i ano PC o Z—o BDAPg d 6n it fp I i co tA v N[ J] A EH TE ,DNC L ,t l P ae 0nt—3 U N J L A,H M RI OA JE ea,l f u Gr nitn e p at ml r eai e ee p e os n u c i n i ar i r p rua t sh t gp n x r s nia df n t n dy i oec o

CW a s Ses d b o g t dn t n l pc tb lc rn if gO sas s e yl n i ui a r s r t a d mea o i a i p ol n i

b o I N o yEc /R tI[ P]y eo c i 0,,7 26 4 J.. h s l n mi2 2 0: 9 1—Gos ][ RC 4 O HJERS,E H NJ H G e a,cnro sp t H AA C,A SAM,t Ll Cent ue ap e anin r cds p sp a da l sg r l ig a i gd i lme t t u ee ot rn i p la amh e inr zn a r o n yC W SO A:os be n u on o rn a i oe u e a t rn a e i p s i l eer de l be sf srr cd d sup ie k t“ 3讨

论 hrr S c ee EP于等19 9年5首报先了编码人脂道

联素的 c N其 2由7个氨基酸构成 ,D, 4A包

含 4个结构域：氨基端的信号列序、变可区、样原和区基羧球端 状胶区。联脂素脂是肪组织基因达表最富丰蛋白质的产物之一在，液血循环大中量在。存于由接直从脂并肪织组和液血中提纯脂联素较为困难，此因必有开要展该基因的表达研究。目前 ,工因程中常用的核真达表系统有酵母 表达系统、基哺动乳物 胞表细达 统系及 昆虫细胞表达系

psm nel os J . D i c 0,,7 0】5u p et cw[] r Sa2i09 3:—461 . e y 33 d[] HE ES ILA W, O L A O,Mt1 nAl vem 5C RRPE,LI MSS F G I Ne a. e ors o p e oii rCo pcd ecudie aiony sJ. i r s li 1 r ue xl v il dpct[] B ot m a ntq os y leC e 912 04 )27 6—64 . h m, 5,7 (95:4 6 29 7[6]L ND R,SC I K B . ci R Psrieo gI E S HL AWM, U EG EDr tC cnn f e e Pci p r slsnJ .i htui 19 2 (s 9) 09~ 2 ia a itc e 3[B oe nqe,69, 06 8:h os o c8.[] O H N LE GPCG LI S GN. rdic f m i cnp o 7L E BR , E L S EP outno o bn t r. ro ea tisb elb tipes[ . ut Oi oehB, 9o 7 e n y mt r hc yatJ] Cr n ipcn l19, o o y t85:5 0 5 () 4— 5 . 6[] H GI CE I d cti ociPatr[] 8I GSD R, R NGG JM.r ut nn it p as i J. o o h s o统。在酵母达系表中统甲酵醇母表达系应统用广最

Mtd lM,i,9 1 31 .o eo Bl98 1—: 5 hs o1 0 (0 ) 90

泛，其具对营养要有求、低生长快 培、基廉养、价发酵统系简、单适常合规大模工业化生产等 优点[7;非 6 ,3

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