心肌肌钙蛋白I的一些生化特点及其影响测定的因素 - 潘柏申

　中国临床医学　2001年6月　第8卷　第3期　　ClinicalMedicalJournalofChina,2001.Vol.8,No.3

309□综述□

心肌肌钙蛋白I的一些生化特点及其影响测定的因素

潘柏申(复旦大学附属中山医院检验科,上海　200032)

FactorsInfluencingtheMeasurementandSomeBiochemicalCharacteristicsofCardiacTroponinI

PanBaishen(ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai　200032)

急性心肌缺血损伤的实验室检测项目较多。随着临床研究和应用的发展,心肌肌钙蛋白(cTn),包括心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌钙蛋白T(cTnT),已被公认为临床诊断心肌损伤的确定标志物[1,2]。对cTn的应用评价也引起世界各国临床医师和实验室专家的广泛关注。目前美国国家药品和食品管理局(FDA)至少已批准16种cTnI检测试剂[3]。临床应用中发现,这些cTnI检测试剂测定值之间存在着差异,不同的cTnI分析方法对同一份标本的检测值最大可相差30余倍[4],这使得各种cTnI检测方法的参考范围、分析干扰、分析变异、诊断窗口期以及诊断和预后的临界值等都出现不同程度的差别,给临床应用和评价带来困扰。了解cTn特别是cTnI的一些生化特点和影响分析测定的因素,将有助于临床上正确使用cTnI检测和评价心肌缺血损伤。1　心肌肌钙蛋白细胞内结构、分布和释放

1.1　结构　cTn由三种亚基组成,参与调节心肌收缩活动。其中肌钙蛋白C(TnC)是Ca2+结合亚基,分子量18kDa,等电点4.1;cTnI为抑制亚基,分子量23kDa,等电点9.87;cT-nT为原肌球蛋白结合亚基,分子量34kDa,等电点5.1[5]。　　cTnI相对两种肌钙蛋白骨骼肌亚型(sTnI)约有40%不同源性[6];人的cTnI氨基末端比sTnI多31个氨基酸残基[7]。这种独特的氨基酸顺序使之具有较高的心肌特异性。

在Ca2+存在的情况下,TnC与Ca2+结合后构型发生变

[5]

化,与cTnI的结合增强(Ka约为1.5x10-8M-1);TnT与TnC-cTnI结合,但较TnC-cTnI之间的结合弱。反之,Ca2+浓度低或TnC未与Ca2+结合时,TnC和cTnI之间的结合比较松散。cTnI-cTnT的结合相对较弱(Ka约为4.4

[5]x10-5M-1)。1.2　组织含量　心肌内cTnI的含量约为5mg g湿重组织(相比之下,cTnT约为10.8mg g湿重组织,CK-MB仅1.[8]4mg g湿重组织);cTn主要结合于心肌肌纤维中,少量(cTnI的2.8%～4.1%;cTnT的6%～8%)在细胞浆中以游离形式存在[9]。这与心肌细胞缺血损伤后的释放方式密切

第二个峰;由于细胞液中的含量较少,cTnI释放通常只有一个峰[10]。cTn一般在心肌损伤后5～8h外周血中出现增高,最高值在12～24h,增高可持续7～10d(cTnI)或10～14d

[10]

(cTnT)。1.4　外周血中存在形式　外周血中的cTn究竟是以复合物还是游离形式存在,曾有过许多研究结果不同的报道。现在多认为,cTn释放主要是以TnC-cTnI-cTnT复合物形式,随后降解[11]。外周血中的cTnI既有游离形式,又有不同复合物的形式(cTnI-TnC、cTnI-cTnT以及cTnT-cTnI-[12]TnC)。在AMI病人中以cTnI-TnC复合物形式居多数

[4,12]

(90%以上),cTnI-cTnT复合物仅在不到50%病人的血中被发现,而且其中的cTnI仅占总cTnI的5%以下[13],因此检测重要性远不如cTnI-TnC复合物。其他形式的cTnI较少[12];cTnT游离形式较多见[11]。1.5　半衰期　cTnI在循环血中半衰期的研究结果报道不同(2h～5d),由肾脏排出体外[14]。2　心肌肌钙蛋白I释放后的稳定性

体外实验研究发现,AMI的心肌坏死组织培养3h后,cTnI的蛋白质一级结构、二级结构和三级结构都出现了程度不等的变化[15]。

2.1　蛋白水解酶作用　研究发现,AMI后若血运未重新建立,心肌细胞在30～60min内坏死,坏死细胞的溶酶体可释放多种蛋白水解酶。cTnI较不稳定,易受蛋白水解酶作用,在体外实验中发现被迅速降解,但其不同部分受影响的程度有差别。cTnI的中心区域(第28位和第110位氨基酸)稳定性明显较高(可能是受TnC的保护作用);氨基端和羧基端则对蛋白水解酶作用敏感,呈现程度不等的降解。氨基端水解后降解形成一个14kDa的片段;羧基端则降解形成一个18kDa的片段。因此,欲提高检测敏感性和可重复性,抗体的识别位点最好位于cTnI的中心区域。2.2　蛋白激酶A磷酸化　cTnI的第22位和第23位的丝氨酸易受蛋白激酶A作用发生磷酸化反应,使cTnI形成四种形式:一种未磷酸化、两种单磷酸化和一种双磷酸化结构[18]。研究发现,病人体内磷酸化形式的cTnI占相当数量。磷酸化可改变cTnI的分子结构形式和抗原性,从而影有关。1.3　释放形式　心肌细胞损伤后,游离cTnT较早释放形成第一个峰,随后结合于肌纤维中的cTnT逐渐释放而出现310

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响某些抗体的识别能力。

2.3　氧化还原形式　cTnI的第79位和第96位是半胱氨

酸,容易发生氧化反应或还原反应。这种氧化或还原反应也可影响cTnI的分子结构形式和抗原性,从而影响某些抗体的识别能力。3　测定校准品

各生产厂商的cTnI校准品内的cTnI结构形式或含量各不相同,使得测定结果大相径庭。甚至使用同一份标定cTnI值的人血清进行校准也未能完全消除不同测定系统之间测定值的差异。因此,有人提议最好采用从人心肌组织提取的cTnI-cTnT-TnC复合物作为校准品。美国临床化学学会(AACC)最近研究分析了10种cTnI候选参考物质,结果表明目前仍未能找到令人满意的cTnI参考物质[16]。4　抗凝剂

为缩短检测周转时间(TAT),许多检测方法要求采用血浆或全血,以避免分离血清所需的时间。这需要合理选择适当的抗凝物。4.1　EDTA　EDTA是Ca2+螯合剂,可使cTnI-TnC复合物易于解离,使游离型cTnI增加,从而影响测定值的真实性。因此,有些专家认为最好避免使用。

[5]

4.2　肝素　cTnI带有较多正电荷(pI9.87),易于和含负电荷的基团形成复合物。肝素带有负电荷,与cTnI结合形成复合物可影响抗原-抗体反应,进而引起cTnI检测值降低。但在不同的cTnI检测试剂中,肝素的干扰程度不等。5　其他影响测定的因素

5.1　不同结构的cTnI影响抗体识别　不同亚基复合物的形式使得一种抗cTnI的抗体不能识别另一结构形式cTnI的抗原决定簇。有的单克隆抗cTnI的抗体识别游离形式cTnI的能力较强;有些则主要以识别TnC-cTnI复合物形

[4]

式为主。这使得采用不同抗体的各种试剂检测同一标本时出现检测结果不同的现象。

5.2　测定方法影响　尽管一般认为cTnI具有较高的特异性,但测定方法的干扰仍不可忽视。例如,采用微粒子酶免疫分析(MEIA)方法时血红蛋白和胆红素会对cTnI测定值产生负干扰;当测定方法采用马单克隆抗体为捕获抗体、羊多克隆抗体为标记抗体时,类风湿因子则可引起cTnI测定值假性增高。

为使cTnI的测定更加准确,以便为临床提供更科学、可靠的信息,许多临床化学家进行了大量的深入研究和探讨,并呼吁开展cTnI测定标准化工作。为了使cTnI测定标准化顺利进行,国际临床化学协会(IFCC)和AACC还分别设立了专门机构从事这方面工作。必须认识到,cTnI的测定标准化工作将可能是十分艰巨的。

[2]

[15]

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