高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）

高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理） HPLC应用 一、样品测定

1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。

2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。

4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）

5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。 6．仪器的使用：

①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。

②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。 ③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。

④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。

⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。

⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。 二、方法研究

1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。

2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。 附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 一、对起草单位的要求：

1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立HPLC法的依据及参考文献。 2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。

3．建立方法时，应考虑下列事项：

①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。

②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。

③尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。

④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物质化学结构相似，理化性质接近，峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题。 ⑤检测器首选UV检测器。

4．采用HPLC法进行有关物质检查时，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法。

5．HPLC法用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次，计算相对标准

差（RSD应不得大于l.5％）。

二、对复核单位的要求：http://hplc2.blog.163.com/blog 1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。

2．当HPLC法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验。

3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价。

4、流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。 常用的脱气方法比较：

氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。

超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。

在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。 1、为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型：

30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。

13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。

3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。 滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。

醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。

尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。 2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？

HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项. 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。

高效液相色谱级乙腈的质量评价

信息来源：液色迷人

摘要: 高效液相色谱（HPLC）分析中，流动相溶剂的纯度和质量对分析结果和仪器本身都有重要影响。溶剂中的各种痕量杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性定量分析结果，而且可能会污染分离柱和堵塞系统，造成仪器出现故障。了解HPLC溶剂规格和相关的测试方法，可以帮助HPLC 用户评价和筛选HPLC溶剂，减少溶剂杂质对应用造成的负面影响。本文介绍了基于紫外（UV）吸收和HPLC梯度确定HPLC级乙腈纯度和质量的两种规范方法及其对HPLC分析的意义，并探讨了这两种方法的实际应用。

乙腈区别于其他HPLC溶剂的独特性质（中等洗脱能力、强溶解能力、能够得到明确的色谱峰、低粘度、相对于醇类和酯类有较低的UV吸收）[1]，使其成为 最常用的有机流动相组分。乙腈一般是（由氨和丙烯）大规模生产丙烯腈的副产物。其中可能含有多种很少量的杂质，例如丙烯腈、α(β)-甲基丙烯腈、顺/反 式丁烯腈、

乙醛、丙酮、甲醇、乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、恶唑和乙酸[2-4]。经过复杂的纯化过程，痕量的上述杂质可能仍然存在于HPLC级 乙腈中。其中一些杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性定量分析，而且会污染分析柱、堵塞系统，导致仪器出现故障。

作为美国分析试剂标准测试方法的权威，美国化学学会（ACS）分析试剂委员会在《试剂化学品》（第9版）中明确定义了HPLC级乙腈的技术说明，包括通用 的说明和HPLC的适用说明。通用的说明包括气相色谱（GC）纯度、水、滴定酸或碱、以及挥发残留物。HPLC的适用说明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脱基线[5]。 本文详细介绍了乙腈的两种适用于HPLC的规范方法及其对HPLC应用的意义，并通过详尽的实验数据讨论了操作中的注意事项以及影响测试结果的因素。 1 实验 1.1 仪器

本文中使用了两种HPLC系统，其特定条件介绍如下：Agilent 1100 HPLC系统由脱气机（G1379A）、四元泵（G1311A）、自动进样器（G1315A）和二极管阵列检测器（DAD）（G1315B） （Agilent Technologies, Wilmington, DE）组成，并用该系统获得图1和图2的结果。其他色谱图由Alliance 2695 HPLC系统和2996 光电二极管阵列（PDA）检测器(Waters, Milford, MA)获得。ZORBAX C18柱由Agilent提供；B&J C8柱从Honeywell Burdick & Jackson获得。

UV光谱使用Cary 4000 UV-VIS 分光光度计（Varian, Palo Alto, CA）。参比池为1 cm石英池，样品池为1 cm或5 cm石英池。 1.2 药品和试剂

HPLC级乙腈来自Honeywell Burdick & Jackson 及其他HPLC溶剂供应商。高纯水由Milli-Q超纯水系统（Millipore, Bedford, MA）和Honeywell Burdick & Jackson供应。乙酸（AR）由Sigma（St. Louis, MO）提供。 2 结果和讨论

2.1 HPLC级乙腈UV吸收规范的意义

UV吸收背景对HPLC乙腈的关键性源于两个原因。首先，大部分有机杂质都会产生UV吸收。乙腈的UV吸收越小意味着其中杂质含量越少。第二，HPLC仪器最常用的检测模式就是UV检测。因此乙腈的UV吸收越小，色谱的基线背景越低；从而灵敏度越高，检测限越低。

图3是来自不同供应商的HPLC级乙腈的UV光谱，尤其是在短波长范围（300~190 nm）并不相同。这可能是由于乙腈中难以去除的杂质因各溶剂供应商使用的纯化技术不同而不同。鉴于使用UV检测器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下检测，因此大部分溶剂供应商在上述波长范围内设立UV吸收规范。

2.2 影响UV吸收测量值的因素

在测试实验中，很多因素会影响UV吸收的测量值： （1）光路距离（比色皿长）。在0.2~0.8 AU范围内，吸光率（A）的测量值误差最小，否则吸光率的测量误差会相对大些。如使用1 cm比色皿，即使在250～210 nm的短波长范围内，乙腈的吸光率也远小于0.2 AU，因此可能产生很大的误差。根据比尔定律，溶剂的吸光率和样品的光路距离成正比，因此增加样品池长度会使溶剂吸光率增加，使其值进入0.2~0.8 AU范围内，从而减小测量误差。使用5 cm比色皿，在400~190 nm扫描范围内得到不同乙腈样品的UV光谱（如图4所示）。从图4中曲线可以发现，使用5 cm比色皿可使乙腈在低波长的大部分UV吸光率进入0.2~0.8 AU范围，从而显示出数据的准确度更高。而且，不同乙腈样品的UV吸光率的差别与使用1 cm比色皿时相比更明显。鉴于这一点，Honeywell Burdick & Jackson等一些生产商使用1 cm和5 cm两种比色皿建立UV吸收规范。

（2）仪器参数。由于乙腈的吸光率非常低，仪器参数的设定要保证最佳的灵敏度和准确度。双光路模式可以克服单光路模式中光源能量随时间变化的缺点，并且可以更方便地扫描UV全波长范围。使用分光光度计的基线校正功能，可以去除由光源、检测器和样品池等引入的仪器变化[6]。由于仪器噪声随着扫描速度的提高 而增大，因此推荐使用最大扫描速度的一半。

（3）参比物。用于溶剂UV吸收测定的参比物有两种可能。《试剂化学品》（第9版）使用水作为参比；而《中国药典》使用空气作为参比。使用空气作为参比时测定的乙腈UV吸收值低于使用水作为参比时测定的值，而且在400~250 nm波长的范围内通常为负值。这是由于空气中氧和二氧化碳的贡献使其UV吸收强于水。如图5中所示，由于参比不同造成的UV吸收有显著不同，高达 0.03 AU，所以当我们阅读供应商提供的分析报告证

书时需要了解究竟是使用水还是使用空气作为参比。

推荐使用新鲜的HPLC级瓶装水或者实验室超纯水系统制得的超纯水作为参比物。值得注意的是，实验室超纯水系统制得的新鲜水常常含有大量的气泡，这些气泡需要在实验前去除，否则会影响数据的准确度。

（4）氮气喷雾。为了延长溶剂的保存时间，一些HPLC溶剂供应商将惰性氮气充入溶剂。作者研究了氮气对乙腈UV吸收的影响（图6）。结果发现经过氮气喷 雾，乙腈在250~200 nm范围内的UV吸收显著降低。200 nm处的吸光率为0.012，是氮气喷射前的四分之一。其原因可能是氮气在乙腈中的溶解度远小于氧气和二氧化碳。氮气喷雾减少了氧气和二氧化碳对乙腈UV 吸收的贡献。（注意：也可能是由于氧气和溶剂形成了电荷传递复合物导致了UV吸收。）

（5）溶剂的挥发性。由于乙腈是一种挥发性溶剂，如果样品池和参比池在测试过程中是敞开的，那么样品池中的乙腈蒸汽可能会进入样品室或参比池，结果造成吸光率读数偏低。因此，推荐在实验中用聚四氟乙烯（PTFE）盖子将这两个池都盖住。

2.3 HPLC级乙腈空白梯度洗脱规范的意义

如果溶剂中的杂质水平低于1 ppm，简单的UV光谱通常检测不到其存在[1]。然而，这些痕量杂质可能在有机相和水相比例较低时在柱上富集并保留，然后当梯度过程中流动相洗脱能力增强时被洗脱下来，从而形成鬼峰[7]。因此，HPLC空白梯度洗脱基线上的鬼峰高低，是评价HPLC级乙腈质量的关键规范方法。它清楚地表明了乙腈中是否 含有影响梯度洗脱模式下HPLC分析的痕量的杂质。 《试剂化学品》（第9版）明确规定214 nm处HPLC空白梯度洗脱基线的最大峰高应低于5 mAU。具体的测定方法如下：C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；梯度：0 min，80% 水（溶剂A），20% 乙腈（溶剂B），保持30 min；在50 min时达到 100% B，保持10 min；流速2 mL/min。样品运行3次，并去掉第1次运行的结果[5]。图7比较了B&J ACS/HPLC和几种国内色谱级乙腈样品的ACS空白梯度洗脱基线。结果表明，一些本地产色谱级乙腈样品在254 nm时会产生高达20 mAU的鬼峰。这说明即使在254 nm处，这些国产试剂也可能在HPLC常规分析中产生干扰。

在HPLC的一些实际应用中，往往需要在更低波长处使用梯度洗脱模式以实现高灵敏度的HPLC分析，因此对乙腈的HPLC空白梯度洗脱规范提出了更高的要 求。为了满足高灵敏HPLC应用的要求，一些溶剂供应商也生产梯度级HPLC乙腈。这种乙腈不同于用于等度洗脱HPLC分析的乙腈，它们可以满足更严格的 梯度洗脱规范。例如，Honeywell Burdick & Jackson的空白梯度洗脱基线规格为：254 nm时低于1 mAU，215 nm时低于5 mAU。图1中，在215 nm下，不同供应商的梯度级乙腈的梯度洗脱基线不同，说明它们用于低波长梯度洗脱模式痕量HPLC分析的质量不同。

2.4 影响空白梯度洗脱基线测定的因素 由于操作和HPLC系统本身的复杂性，系统中的任何部分都可能成为梯度洗脱基线鬼峰的来源，因此在实验过程中应十分注意降低HPLC系统和水相的干扰。

（1）HPLC系统污染和流动相添加剂的影响。梯度洗脱过程中，任何有UV吸收的杂质都可能产生鬼峰。除了HPLC进样系统和色谱柱的污染，样品溶剂和流 动相的不匹配也会产生鬼峰。图8为当100%乙腈样品进入系统中，乙腈和水梯度运行色谱图中开始处可能产生正或负的鬼峰。因此进行空白梯度洗脱基线测定 时，为了去除可能来自进样系统的干扰而不予以进样。测试前色谱柱应彻底洗净，或者使用一根专门用来做这个实验的色谱柱来避免来源于色谱柱的交叉污染。

HPLC分析的实际应用中，常向流动相中加入一些添加剂来改善分离和峰形。然而，这些添加剂也可能成为梯度洗脱基线鬼峰的来源。图9中可见，水相中加入乙酸会导致梯度洗脱基线中有鬼峰。因此，乙腈空白梯度洗脱基线测定操作中，只用水和乙腈作为流动相而不加添加剂。

（2）HPLC系统中气泡的影响。溶剂中的气泡经过HPLC系统也可能产生鬼峰（图10）。这种鬼峰和典型的杂质峰不同，它们是鱼翅形：其前边缘很锐，然 后几乎线性下降至基线。在线压力监测系统显示，鬼峰形成时有很快的系统压力降（图11），更进一步证明这些鬼峰的形成是由于系统压力的瞬间快速降低而不是 由于杂质的存在。参考文献[7]和[8]详细解释了气泡如何导致了这种鬼峰的生成。

因此，当进行空白梯度洗脱测试时，需要确保HPLC系统中的气泡完全除净、脱气机正常工作并且流动相充分脱气，从而保证系统中没有气泡。

（3）流动相中水的影响。水相也是空白梯度洗脱基线中鬼峰的一个重要来源。实际上，空白基线洗脱基线中的大部分鬼峰来源于水相[9]。在消费者处进行的一 次HPLC梯度洗脱基线操作中发现使用不同品牌的乙腈时，17.5 min处都有一个很高的鬼峰，说明这是由消费者的水净化系统引起的（图2）。许多分析实验室常使用商品化饮用水或蒸馏水作为HPLC分析的流动相。实际 上，水的塑料容器常会促进细菌的生长，容器中的添加剂也可能会溶入水中，从而导致梯度洗脱模式中出现鬼峰。因此，推荐使用由HPLC溶剂供应商提供的商品 化瓶装HPLC级水，或超纯水系统制备的用于HPLC的水。图12表明新鲜的B&J ACS/HPLC水和来自Milli-Q系统的超纯水都能满足高灵敏度HPLC梯度洗脱测试规格。

但应该注意的是，空气中的污染物也可能进入到瓶装HPLC水中，一旦盖子打开一段时间后可能会长菌。图12显示，开瓶一周的棕色瓶装HPLC水的梯度洗脱 基线严重漂移，并且相比于新鲜HPLC水，其峰的数量和峰高都显著增加。因此，瓶装HPLC级水一旦打开，最好在两天内使用。至于Milli-Q超纯水， 应注意的是超纯水系统中的柱子和UV灯是消耗品，当到达使用寿命时需要更换;否则水中的总有机碳（TOC）可能显著增加，从而在梯度洗脱测试中产生干扰 [9]。

为避免柱内的流动相“疏水性塌陷”，梯度洗脱中初始流动相组成不使用100%水，而使用较低的有机相/水相比例（根据不同的HPLC溶剂供应商，通常为 10%~30%乙腈）。如果鬼峰是由流动相造成的，峰高会随着初始有机相/水相比例的持续时间而变大。为了进一步确定鬼峰是来自乙腈或水，可以改变初始有机相的比例。如果鬼峰随着初始有机相比例增大而增大，那么其来源应为乙腈；反之则来源于水。图13中，鬼峰高随着平衡时间增加，所以这些鬼峰全部来自于流动相。如果考察不同初始有机相比例的两个梯度洗脱基线，当初始有机相比例从20%增至30%时，48~52 min范围内的鬼峰增多，40~46 min范围内的鬼峰消失。这说明前一个来源是乙腈而后一个是水。

（4）过滤造成的流动相污染。为了避免流动相中可能存在的颗粒造成HPLC系统堵塞，HPLC仪器供应商通常推荐对流动相进行微过滤。然而，操作不小心或者微过滤装置本身都可能会向流动相中引入杂质。一方面，商品化过滤膜的质量差别很大，并且（尤其是用尼龙或高密度聚乙烯制作的）过滤膜本身可能引入更多颗 粒或含有可被乙腈萃取的物质；另一方面，一般的实验室条件下，很难保证过滤过程中过滤装置的玻璃器皿部分完全没有颗粒。使用0.45 μm尼龙支撑的的疏水PTFE膜过滤乙腈，空白梯度洗脱基线中45 min处会出现高达50 mAU的鬼峰（图14）。尽管污染的来源还需要进一步确认，这仍可说明实验室中微过滤操作引起污染的风险很高。因此，推荐在HPLC梯度洗脱评价测试中直 接使用由生产商提供的原装瓶里的乙腈，而不增加其他处理操作。

3 结论

UV吸收和HPLC空白梯度洗脱基线是HPLC级乙腈的两个关键规格。由于UV区域内乙腈的吸收很低，推荐使用双光路模式、基线校正和适当增加比色皿长度来获得更加准确的结果。另外，参比物质、溶剂是否经过氮气喷射以及溶剂本身的挥发性也可能影响测试结果。相比于UV吸收，HPLC空白梯度洗脱基线评价可 以为应用于HPLC梯度的乙腈质量提供更加精确和实用的评价。测试中需要考虑多种实际方面来确保获得准确可靠的测试结果；来自于HPLC系统、流动相添加 剂和水相的污染，以及附加的过滤操作都需要避免；系统中的气泡也要除净。

操作心得 操作过程：

1、 开机操作： （1）、打开电源 （2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时，打开工作站，先打开在线工作站；打开离线状态的工作站可以离线处理图谱与出报告 （3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；提到异丙醇溶液，我还学到一点就是，在用完反相后要换成正相时，我们需要用异丙醇过度30分钟左右，然后在

换上正相柱 （4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液； （5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。

2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间，如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相，正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；

3、 建立色谱操作方法，注意保存为自己清楚的方法名，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；

4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；

5、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；

6、 实验结束后，如果有盐一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。如果是一般的溶剂系统就直接用甲醇冲洗，冲洗过程中关闭D灯、W灯；以延长灯的寿命

7、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；

8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不得擅自使用仪器。

流动相：

1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；

3、 使用双泵时，最好不要有机相与水相直接调用，这样可能造成管路气泡，最好我们根据自己的需要配制一定浓度的有机相与水相的混合溶液，再与水相混合调用 4、换流动相后，要purge 样品：

1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2、 用流动相或比流动相弱的溶剂制备样品溶液，若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小，尽量用流动相制备样品液； 手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍； 色谱柱：

1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；2、 使用符合要求的流动相；

3、 使用保护柱；

4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇或乙氰冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子；

7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱，使用硅胶柱时还要特别小心流动相的PH范围在2~8之间；使用过程中注意轻拿轻放。

8、上柱时我们要注意柱子的方向，千万不要装反了

高效液相色谱法的分类及其分离原理

高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制

吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）

其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为：

K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求：

试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小

流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用

常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。 ③液-液色谱法的固定相

常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。 采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。

使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成Si-O-Si-C型键，把固定液的分子结合到担体表面上。

优点：

化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。 固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。 固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。 ④液-液色谱法的应用

液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。

3.离子交换色谱法

原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。 ①离子交换色谱法的作用机制

聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：

离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。交换达到平衡时：

K值越大，保留时间越长。 ②溶剂和固定相

两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。

多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。 薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。 ③离子交换色谱法的应用

主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。 广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。 4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）

凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。 ①凝胶色谱法的作用机制

体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。

凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。 ②凝胶色谱法的固定相

软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。 ③凝胶色谱法的应用特点 保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。

保留时间短，色谱峰窄，容易检测。

固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。

不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离

高效液相色谱的类型 （一）吸附色谱

在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。

吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为１０％或更少一些。如有可能，可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。 （二）分配色谱

１. 正相分配色谱

正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。

２.反相分配色谱

这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。 通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的ＰＨ值，例如，如果样品有一个—ＣＯＯＨ 基团，使流动相的ＰＨ值是偏向酸性的，由于抑制了—ＣＯＯＨ基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。 在调节ＰＨ值中，保持ＰＨ值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在ＰＨ＝２-９，然而，当加入盐以后，最好使其ＰＨ＝７.５-８或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的ＰＨ值。 （三）离子交换色谱

这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。

离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、ＰＨ及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用ＮａＣＩ或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在２１０ｎｍ，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。 （四）凝胶色谱

凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。

因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。 凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。 １.凝胶渗透色谱

凝胶渗透色谱（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＰＣ。此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如ＰＶＣ，ＰＳ，ＡＢＳ等等，而所用的洗脱液有ＴＨＦ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ等等。

２.凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｒｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＦＣ。此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。 凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。 [编辑本段]

高效液相色谱法在分析检测上的应用 食品中山梨酸、苯甲酸的测定 １. 原理

样品加温除去二氧化碳和乙醇，调ＰＨ至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。 ２.试剂和溶液

方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水，溶液为水溶液。 （１）甲醇：优级纯，如果是分析纯，需重蒸。

（２）稀氨水：１+１ 溶液，氨水加水等体积混匀。

（３）０.０２ｍｏｌ／Ｌ乙酸铰溶液：称取１.５４ｇ乙酸按，加水至１０００ｍＬ，溶解，经滤膜（０.４５ｍ）过滤。

（４）２０ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液：称取２ｇ碳酸氢钠（优级纯）加水至１００ｍＬ，振摇溶解。

（５）苯甲酸标准储备液：准确称取０.１０００ｇ 苯甲酸，加２０ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液５ｍＬ，加热溶解，移入１００ｍＬ 容量瓶中，加水定客至１００ｍＬ，摇匀，此溶液苯甲酸含量为１ｍｇ／１ｍＬ，作为储备液。 （６）山梨酸标准储备液：准确称取０.１０００ｇ.山梨酸，加碳酸氢钠溶液（２０ｇ／Ｌ）５ｍＬ，加热

溶解，移入１００ｍＬ 容量瓶中，加水定容至１００ｍＬ，山梨酸含量为１ｍｇ／１ｍＬ，作为储备溶液。 （７）苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液１０.０ｍＬ，放入１００ｍＬ容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各０.１ｍｇ／ｍＬ。经滤膜（０.４５ｍ）过滤（ 同时测定糖精钠时，可加入糖精钠标准储备液）。 ３.仪器

高效液相色谱仪（带紫外检测器）。 ４.测定方法

（１）样品处理 １.汽水、饮料、果汁类：（ 汽水需微温搅拌除去二氧化碳）吸取２.０ｍＬ 样品，加入已装有中性氧化铝（３ｃｍ*１.５ｃｍ）的小柱中，过滤，弃去初滤液，然后用流动相洗脱苯甲酸，接收于２５ｍＬ带塞量简中，洗脱至刻度，摇匀。此液通过微孔滤膜后进样。

３.配制酒类：称取１０.０ｇ 样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（１+１）调节ＰＨ约７，加水定容至适当体积，经滤膜（０.４５ｕｐ）过滤。 （２）高效液相色谱参考条件

１.色谱柱：ＹＷＧ-Ｃ１８ ４.６*１５０ｍｍ５ｕｐ，或其他型号Ｃ１８柱。 ２.流动相：甲醇+乙酸铰溶液（０.０２ｍｏｌ／Ｌ）（５+９５）。 ３.流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ。 ４.进样量：１０ｕｌ。 ５.检测器

紫外检测器，波长２３０ｍｍ，灵敏度０.２ＡＵＦＳ。 根据保留时间定性、外标峰面积法定量。

高压液相色谱HPLC培训教程(二) II．基本概念和理论 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数

色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。

拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。

峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。

峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ

标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 2．定性参数（保留值）

死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

5、系统内有气泡 5、用强极性溶液清洗系统

6、检测器内有气泡 6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器

7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）

7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池

8、检测器灯能量不足 8、更换灯

9、色谱柱填料流失或阻塞 9、更换色谱柱

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常

10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置

O、宽峰

原因 解决方法

1、流动相组成变化 1、重新制备新的流动相

2、流动相流速太低 2、调节流速

3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）

3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。

4、检测器设定不正确 4、调整设定

5、柱外效应影响

a、柱子过载

b、检测器对反应时间或池体积响应过大

c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大

d、记录仪响应时间太长

5、 a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品

b、减少响应时间或使用更小的流通池

c、 使用内径为0.007-0.01的短管路

d、减少响应时间

6、缓冲液浓度太低 6、增加浓度

7、保护柱污染或失效 7、更换保护柱

8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。

9、柱入口塌陷 9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子

10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰

10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果

11、柱温过低 11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃

12、检测器时间常数太大 12、使用较小的时间常数

P、分离度降低

原因 解决方法

1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）

1、重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞图

2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

Q、所有的峰面积都太小

原因 解决方法

1、检测器衰减设定过高 1、减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大

2、设定较小的时间常数

3、进样量太少 3、增大进样量

4、记录仪连接不当 4、使用正确的连接

R、所有的峰面积都太大

原因 解决方法

1、检测器衰减设定过低 1、采取较大的衰减

2、进样过多 2、减少进样量

3、记录仪连接不正确 3、正确连接记录仪

HPLC日常维护办法之四：进样阀的问题

以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。

A、手动进样阀，转动不灵

原因 解决方法

1、转子密封损坏 1、更换或调整转子密封

2、转子太紧 2、调整转子的松紧度

B、手动进样阀，载样困难

原因 解决方法

1、进样阀安装不当 1、重新安装

2、定量环阻塞 2、清洗或更换定量环

3、进样器污染 3、清洗或更换进样器

4、管路阻塞 4、清洗或更换管路

C、自动进样阀，不能转动

原因 解决方法

1、无压力（或电源） 1、提供恰当的压力（电源）

2、转子太紧 2、调整转子的松紧度

3、进样阀安装不当 3、重新安装

D、自动进样阀，其它问题

原因 解决方法

1、阻塞 1、清洗或更换阻塞部件

2、机械故障 2、见随机维修手册

3、控制器故障 3、维修或更换控制器

来源：分析化学网

1．流动相溶剂的处理：

(1) 水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH9—10的条件蒸馏，可用于常规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。

(2) 有机溶剂的提纯 通常用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。将溶剂通过氧化铝或硅胶柱可除去极性化合物。氯仿中含有的少量甲醇，可先经水洗再经蒸馏提纯。试剂级的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强烈吸收紫外线，可经蒸馏除去难挥发的丁基甲苯酚。为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。

(3) 溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用0.45ym孔径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞。同时要进行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。

1) 溶剂中的CO2使得电导检测器的背景增大。

2) 检油池中的气泡，使得信号不稳定，常出现系列假峰（特别是当柱子加温使用时）。 3) 色谱柱内的气泡，使柱效降低。

4) 输液泵内的气泡，使活塞动作不稳定，流量变动，严重时法输液。

溶剂脱气的方法很多，常用的方法有：用惰性气相(如氦气)驱除溶剂中的气体；加热回流；真空脱气和超声波脱气。其中，以超声波脱气最为方便、安全、效果良好，只需将溶剂瓶放入加有水的超声波发生器槽中，处理10一15min即可。

2．试样溶液的制备 配制分析试液的溶剂应当使用色谱分离的流动相或可与其混溶的溶剂，配制好的试液需经0.45μm孔径的滤膜过滤，以除去固体微粒物质。 三、样品处理技术

在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需对试样预处理。样品的预处理方法很多，如溶剂萃取、吸附、超速离心及超过滤等。

1．溶剂萃取 溶剂萃取适用于待测组件为非极性物质。在试样中加入缓冲溶液调节pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但如果待测组分和蛋白质结合，在大多数情况下；难以用萃取操作来进行分离。

2．吸附 将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进行吸附。亲水性物质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯—二乙烯基苯等类树脂吸附。

3．除蛋白质 向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白质被沉淀下来，然后经超速离心，吸取上层清液供分离测定用。

4．超过滤 用孔径为l0×10-10一500×l0-10m的多孔膜过滤，可除去蛋白质等高分子物质。 四 液相色谱常见故障及排除方法 色谱柱

1、柱压升高;

色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。 卸下入口接头的滤片，使用1：1的硝酸溶液超声清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份。样品及流动相使用0．45μm滤膜除去微量杂质。使用流动相作溶剂配制样品。

2、新柱柱效低

柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好，影响传质过程。 更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积。使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。

3、旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷。

填料被流动相溶蚀而流失。 用同型填料填补柱效可部分恢复。对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。

4、旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。

入口填料被污染变质所致。 用强溶剂冲洗。刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。污染严重，则废弃或重新填装。

5、新柱接到仪器上后，柱头漏液。

柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。 用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。

6、新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降。

柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。 继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。

7、新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。

①同上。② 流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 ①同上。②配好流动相后一定要进行脱气处理。

8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。

柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。 更换或清洗柱入口滤片；用0．45μm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。

9、[b]进样次数增加柱压降逐渐增加。

①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。②样品在流动相中析出微小结晶。 ①用0．45μm过滤膜过滤样品。②推荐使用流动相溶解样品。 6O{G

10、使用—段时间后，柱效下降，分离不好。

①柱填料被流动相溶解而流失。②柱填料被样品杂质污染。 ①推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。

11、[b]柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。

柱入口床层被污染使柱填料变质。 用强溶剂冲洗除去杂质。 12、柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。

柱入口床层被污染。 用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。

13、进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。

样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。 ①用流动相溶解样品。②样品的浓度不宜太大。④进样量不宜过大。

14、使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。

霉菌生长所致。 ①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。

15、用5μm颗粒填料柱时， 以MeOH／H20作流动相时柱压较高。

MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。 可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。 16、长时间放置的色谱柱，出现双峰。

柱床层出现干裂。 柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。

（4） 重空气或氢气至适当流速 （5） 清洗或更换喷口

（6） 重开氢气发生器，若仍出现跳闸现象，检查氢气流路有无障碍物。清洗氢气流路后，重开动发生器 峰拖尾 （1） 进样器管有污染（样品或胶垫碎屑） （2） 柱温太低

（3） 柱子使用不当，样品与载体或固定液发生相互作用 （1） 用容剂或清管器清洗进样器，必要时可更换进样器管

（2） 提高柱温，但不要超过最大使用极限

（3） 提高固定液配比，采用惰性载体或改用极性固定液 前延峰 （1） 对柱子过负荷 （2） 样品在系统中冷凝 （3） 进样技巧不好

（4） 汽化温度太低 （1） 减少进样量 （2） 检查柱温和检测器温度是否正确 （3） 掌握进样技巧 （4） 提高汽化温度

峰分不开 （1） 柱温太高 （2） 柱子太短

（3） 固定液全部流失，仅留下担体

（4） 固定液或担体选择不当 （1） 降低柱温 （2） 加长柱子 （3） 换柱 （4） 另用他柱 （5） 降低载气流速

程序升温时基线上升 （1） 载气流速不平衡 （2） 柱子沾污 （1） 按说明书使流速平衡 （2） 重新老化柱子

程序升温时基线不规则漂移 （1） 柱子老化后仍有过量“流失”

（2） 载气流速未在最佳条件下平衡 （1） 降低固定液用量或降低柱温，有些固定液挥发性太大，不宜程序升温用，即使再老化亦无法解决，故最好换柱子 （2） 按说明书平衡载气流速

表4-5 用电子捕获检测器时的故障图形分析和排除方法 故障及图形 可能原因 排除方法 噪声大 （1）电极绝缘不良 （2）检测器污染

（3）电极引线或电缆接头接触不良 （4）接地线不良 清洗更换 清洗 拧紧接头 更换

灵敏度低 （1） 放射源玷污 （2） 放射源被腐蚀 （3） 电极绝缘不良

（4） 极化电压引线和电极接触不良或对地短路 （5） 放大器输入电榄绝缘性差 （6） 载气杂质过多 清洗 更换

清洗或更换

使其接触良好，消除短路 更换

清洗或更换 更换

出现反峰 （1） 放射源或电极被沾污（图Ⅰ） （2） 脉冲发生器不正常

（3） 收集极接触不良或短路 清洗 波形检查

基线显著漂移 （1） 检测器温度不稳 （2） 放射源沾污

（3） 进入检测器的杂质太多 清洗 老化吹洗

线性范围窄 （1） 载气不纯，如含氧量太高 （2） 色谱柱中放出干扰物质过多 （3） 负电性化合物注入过量（图Ⅰ） （4） 由于放射源被污染基流太小 （5） 放射源过热损伤 更换 老化不能改善时更换 提高柱温老化 清洗 更换

零点失调 （1） 阴极引线绝缘性差或对地短路

（2） 阳极引线绝缘不良或对地短路 更换引线消除短路 同上

“样品瓶帽盖”干扰 样品瓶帽、密封垫的杂质，部分溶于样品中 密封垫用金属箔衬里或用聚乙烯瓶塞磨口

载气的选择、净化和流速的测定 项目 意义与要求 方法

载气种类的选择 载气种类选择的意义

（1） 满足检测器对载气的要求；

（2） 满足分析方法对分析周期、柱效率以及灵敏度的要求 热导检测器可用H2、He、N2或Ar、用H2、He作载气时灵敏度高，N2则灵敏度低，且易出现W峰

氢焰检测器可用H2、N2为载气，空气助燃。气体密度秤检测器可用N2、Ar、CO2

放射性检测器可用H2、He、Ar、N2 。H2 、He适于快速分析，但H2易燃，易漏He最理想 载气的净化 载气中含有O2、CO2、H2O、CH4等杂质可导致

（1） 柱失效：CO2、H2O使分子筛失去活性，O2使PEG；固定液断链等 （2） 样品变化：如载气含水会使氯硅烷类样品水解； （3） 氢焰检测器基流，噪声增大

有机杂质可用活性炭除去?（4） 热导检测器线性变劣，校正因子不能使用。因此，载气必需净化

? 水份用干燥剂除去分析氯硅烷类易水解样品时，载气依次经无水高氯酸镁分子筛、P2O5干燥，可防止样品在系统中水解，满意地分析低浓度氯硅烷样品

? H2气中的O2可用105型催化剂除去，N2气中的O2可用活性铜催化剂除去 载气中的CO2可用碱石棉除去?

? 201或202银X型分子筛催化剂，是一种多用途新型气体净化剂，可以净化气体中氯氧，含硫化合物，水份及二氧化碳等杂质，除氧性能最为突出，效果与105型催化剂相似（可降低O2含量至0.5ppm,）从-80℃到160℃的温度范围均适用。201型催化剂不仅可除氢气中的微量氧，亦可在常温下脱除氮及稀有气体中的微量氧 流速的选择与测定

（1） 在最佳流速下，柱效率最高

（2） 在柱中各点载气流速不同，皂膜流速计测的是柱出口体积流速F，有进用线速度u表示.F、U表示柱管中平均流速和线速

（3） 载气流速一般应选择大于或等于最佳流速 （1）出口载气线速度u等于柱长L被死时间tM除：U= L(cm) tM(s)

(2)平均流速等于出口流速乘以压力梯度校正因子j（见表5-13）： U=ju; F=jf

(3)轻载气最佳线速度比重载所大些，H2和He一般10cm/s，N2为5--7cm/s，用轻载气可缩短分析时间 （4）热导检测器载气流速一般是30--150ml/min

氢焰检测器H2为30--50ml/min N2:H2=1:1--1:2,N2:空气=1：5--1：10 ①. 105型催化剂是大连红光化工厂生产的含钯除氧催化剂。使用前需将它放在脱氧反应管中，在360℃于一毫米汞柱下减压脱水两小时，冷却至室温后可将欲纯化的氢气以1000（体积/体积）的空间流速通过催化剂，还原活化一小时，即可使用。对于含氧1%的H2，一次通过该催化剂后，氧含量可降到0.2ppm，催化剂失效后可用上述方法再生

②. 活性铜催化剂呈棕色条状，使用前需用H2在300-400℃下有效地除去氮气中的氧，使其含量下降到10ppm左右，催化剂变黑说明失效，需再生

③. 201或202银X型分子筛催化剂是南京无机化工厂产品。使用前需加热活化（100--160℃）用氢气缓慢吹洗，使银X型分子筛还原成为金属态即可使用。失效后可再通H2还原，还原十余次后，可将催化剂升温活化除去水分

进样操作要领 项目 意义 要领

汽化温度 （1） 对峰形影响：温度过低产生前延峰，过高峰前沿直立，或出现分解产物的色谱峰 （2） 对柱效和峰高的影响：汽化温度超过样品沸点，柱效和峰高变化不明显

（3） 对分离的影响：汽化温度低分离不好 汽化温度可比样品中最高沸点组份的沸点30-40℃ 进样量 进样量应选择在组份量与其峰高或峰面积呈线性关系的范围内。进样量过大会导致： （1） 降低柱效和分离度

（2） 超过柱负荷，使峰高不呈线性增加，不能用峰高定量

（3） 超过检测器的线性范围，峰高、峰面积都不呈线性增加 填充柱一般进液样不超过10ul,气样不超过10ml。并取决于检测的灵敏度，热导检测器一般1—5ul,氢焰检测器1ul以下 进样手法 （1） 注射深度、速度和位置对峰高、峰面积都有影响

（2） 易挥发样要更加注意 固定进针速度稍快为好（高沸点物质进针可慢些）、针头不要靠壁，低沸点样品拔针要求快，尽量保持注射器针尖中残留液体的体积一致在毛细色谱分流进样情况下，为避免样品在注射器针尖中残留体积不一致而对进样量产生误差，可在取样前先取一定量（1ul）早出峰的溶剂，然后取一段空气，再取样品，取完样后，把针杆上提到针尖内的样品全部进入注射器刻度管内，精确读取样量，然后进样，这样针尖内不会残留样品，仅留下溶剂，可保证所取样量全部进入柱内 气相色谱柱的使用及日常维护的注意事项

1、高温下在没有载气通过时，柱的固定液热分解较迅速，所以在柱箱（炉）升温前应该先通上载气，柱箱冷却后才能关闭载气。

2、载气中若夹带灰尘或其它颗粒状物体就会导致柱迅速损坏，因此在载气进入仪器管线前需加净化器。（带填充剂的汽化室玻璃衬管必须注意不能带有微粒或灰尘吹出）

3、载气中的水分通过固定液的液膜吸附在柱管表面上，将取代或破坏固定液液膜，所以，固定液极性越强，越

需要采用干燥的载气，例如：象OV-1、SE-30、SE-54、OV-101对载气干燥要求不高，而PEG20M、FFAP和SP1000对载气要求就很高。但在涂布于碳酸钡沉积层上的柱子情况就恰恰相反，涂极性固定液的柱子能经受含水样品的直接进样，而涂非极性固定液的柱反而不能经受含水样品。

4、对于那些能被氧化的固定液（如PEG20M、Caxbowax、FFAP等）对载气除氧也很重要，在N2和He中往往含O2较高，而H2中含O2少，所以，ECD-CS、FID-CS常用高纯N2作载气，TCD-CS用H2作载气，可用105催化剂常温下除O2。同时，停机使用时，应将排空端密封住，以防止空气中的O2对柱固定液的氧化作用。 5、在大多数情况下，柱的寿命与它的使用温度成反比。采用稍低些的温度上限，可显著提高柱的寿命，程序升温到较高温度所维持的时间短对柱的寿命影响较小。

6、 毛细管柱最大特点是高的柱效，但是必须清楚一般所测得的柱效不仅反映了柱的质量，而且还包括进样过程的整个系统的效率的总质量，也就是说，自样品进入系统的一瞬间开始到记录笔绘出色谱峰为止，每一个能影响峰的加宽或分离的因素，如进样器、柱的连接、辅助气引入位置、管路死体积、进样器内衬的毛病等等，都一定会影响柱效。

7、 一根好的柱子，由于安装不当，可以造成理论塔板数降低，峰形增宽或拖尾、活性物质的吸附性拖尾或消失、灵敏度降低或组分分离不佳等等。 8、 进样器与色谱柱连接方式：

①.分流进样方式：分流点要求位于载气流速较高的区域。

②不分流进样方式：色谱柱最好不伸进进样器内，避免造成气流扫不到的区域，通常直接连接到进样器的末端。 ③检测器与色谱柱出口端连接：对FID不仅插入深度要超过尾吹和H2气的进口，而且应尽可能将柱出口端插到FID的喷嘴下面1mm处为佳，对Micro TCD应插到TCD气体入口处为佳。可以改善轻度拖尾。 如何选择填充柱

1．固定液的选择

选择固定液无严格规律可循。一般是凭经验规则，或根据文献，或利用麦克雷诺（McReynolds）常数表来选择固定液，然后将样品注入初步选定的柱子，根据样品分离结果，再决定是否更换固定液。 事实上同一样品也可用不同固定液加以分离，“相似相溶”规律必须遵循，分子间的相互作用力（定向力、色散力、诱导力、氢键力。这些分子间作用力的强弱取决于作为分析对象的固定液-溶质体系，大致顺序是氢键≥色散力、偶极间力、诱导力。）必须考虑。

在初步选择固定液之前，对样品的各种性质应尽可能多的了解。 1.1 固定液的选择

（1）已知样品固定液的选择

A．对于非极性样品，应首先考虑选用非极性固定液。在非极性固定液上，不论样品是非极性或极性，保留作用都是色散力造成的。无特殊选择性，组分基本按沸点顺序分离。如果是烃与非烃混合物，则同沸点的极性物质先流出。

B．对于中等极性样品，应首先选用中等极性固定液。组分与固定液分子间的作用力为色散力和诱导力，基本上按沸点顺序分离，但对沸点相同的极性和非极性组分，则诱导力起主要作用，非极性组分先流出。

C．对于强极性样品，应选用强极性固定液，组分与固定液分子间的作用力主要为定向力，诱导力和色散力处于次要地位，则样品组分主要按极性顺序分离。对于极性和非极性混合物，则非极性组分首先流出，而且固定液极性越强，则非极性组分出峰越快，极性组分保留时间越长。

D．对于兼有酸性或碱性的极性样品，应选用带有酸性或碱性基团的高分子多孔小球，大致按分子量大小顺序分离。还可选用强极性固定液，加入小量酸性或碱性填充剂，以克服载体的拖尾效应。 E．对于能形成氢键的样品，就选用氢键型固定液，按形成的氢键能力大小顺序分离。

F．对于含有异构体的样品，主要是芳香性异构体样品，可选用特殊保留作用的有机皂土或液晶做固定液。则对位异构体往往出峰较晚。

（2）未知样品固定液的选择

固定液的选择要和定性分离结合起来。选择的指标只能由分离峰数目的多少，峰形以及主要（含量多的）组分分离的好坏来评价。

A．用高效能毛细管柱进行初分离。毛细管柱具有很高的分离效能，一般未知样品大都可以分离开。 B．按指定固定液进行选择 12种指定固定液是角鲨烷（SQ）、甲基硅油或甲基硅橡胶（SE-30，OV-101）、苯基（10%）甲基聚硅氧烷（OV-3）、

苯基（20%）甲基聚硅氧烷（OV-7）、苯基（50%）甲基聚硅氧烷（OV-17）、苯基（60%）甲基聚硅氧烷（OV-22）、三氟丙基（50%）甲基聚硅氧烷（QF-1，OV-210）、β-氰乙基（25%）甲基聚硅氧烷（XE-60）、聚乙二醇-20000（PEG-20M）、己二酸二乙二醇酯（DEGA）、丁二酸二乙二醇酯（DEGS）、1,2,3-三(2-氰乙氧基)丙烷（TCEP）。

在这些指定固定液中，半数以上为有机硅固定液。这是因其极性可由取代基百分数来调节，热稳定性好，使用温度范围宽（-50～350℃）对各种组分皆有良好的分离能力。其中有五种称为最常使用固定液：SE-30，OV-17，QF-1，PEG-20M，DEGS，它们的性能稳定，极性间距均匀，应用面广，是一类最佳固定液。 （3）利用混合固定液

可以用混合固定液调节被分离物质的保留值，以达到适宜的选择性。对许多常规固定液来说，它们的保留性能具有“线性加和性”。

1.2 固定液配比的选择

固定液配比的选择取决于样品的性质（沸点、极性），固定液、载体的性质以及柱温等一系列因素。

固定液的涂渍量有：10～30%，5～0.5%和＜0.5%三种。固定液的厚度与载体的表面积有关。固定液的涂渍量减少时，保留时间缩短。一般而言，即使在低固定液相时色谱柱的理论塔板数也不改变，所以快速分析最好用低固定液相色谱柱。

一般来说，载体的表面积越大，固定液的含量可以越高。反之表面积越小，固定液含量应越低。近年来多采用低配比固定液柱，一般在10%以下。从速率理论可知，固定液配比主要影响传质项，即分配比和液膜厚度，降低固定液的配比，可以降低液膜厚度，减少液相传质阻力，提高柱效。但固定液含量过低，以至敷盖不了载体表面，也会由于载体吸附效应而使柱效降低。 2．载体的选择

载体的选择对色谱柱性能有很大影响。即：（1）决定柱效率（理论塔板数N直接与载体的表面积有关，表面积越大N越大）；（2）样品吸附在载体上会产生拖尾峰或前延峰。如样品和载体之间产生氢键会引起色谱峰拖尾。

气相色谱法的载体有：硅藻土微粒；对苯二甲酸微粒（185℃）；特氟隆树脂微粒（210℃），此外还有硅胶、活性氧化铝等吸附剂。 理想的载体条件：（1）单位体积的填料要有足够的表面积；（2）表面是惰性的；（3）装柱时载体不破碎；（4）有耐热性。

2.1 载体的选择原则

（1）生物类制品、药品等，它们一般属于高沸点、强极性物质，经常采用玻璃微珠担体，也可采用质量好的经酸洗的白色担体。

（2）高沸点的化工产品，如高碳醇、芳香羧酸酯，固定液涂渍量一般低于5%，经常采用白色担体或灰色担体。

（3）强腐蚀性物质，如SO2等，可选用特氟隆担体。

（4）含水有机物的分析，要求测定其中水的含量，可采用经硅烷化处理后的担体或高分子多孔小球（GDX）担体。

（5）一般常规的非极性或弱极性物质，如烃类、芳烃、卤代烃的分析，经常以采用红色担体为好。 2.2 载体粒度的选择

理论塔板高度（H）和载体的粒径（dp）成比例，所以减小dp可以得到尖峰。

载体颗粒减小，柱效将线性增加。但粒度过细会使柱压差过大，使柱子填充不均匀，使柱效和分析速度降低，给操作也带来不便。通常填充柱的载体直径约为柱径的1/20～1/25左右，即当柱子较长时用60～80目（125～250微米），较短时用80～100目。 2.3 载体的前处理

前处理方法有：酸碱洗涤；硅烷化处理；涂渍极性液相；KOH处理；H3PO4处理等。表面处理最重要的方法是酸处理法。这种酸处理方法能除去硅藻土表面的铁、镁、钠等金属物质。 3．色谱柱的选择 3.1 色谱柱的材质

有玻璃、镍、不锈钢和聚四氟乙烯塑料、石英等。有极性的样品或不稳定的样品必须用玻璃柱。不锈钢柱宜用于比较稳定的样品或需进样量大才能分析的样品。

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