微生物学实验指导书

实验一 微生物的分离和纯化

本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容，在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候，不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后，能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求

1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法。 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。

3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件。 二、原理

培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围。根据研究目的不同，可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8%的琼脂。有时为了特殊目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。

由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异样微生物时，对一般细菌常用肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所含需的各种营养物外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉素可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。

灭菌的方法很多，最常用的是加压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在每平方厘米为一个大气压（即15磅/时2）的压力下，温度可达121℃，一般只要持续15～20分钟后，就可杀死一切

微生物的营养体和它们的各种孢子。

由于加压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物的，所以，该法只有当灭菌锅内的空气完全排尽后，才能达到最佳效果。

土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。

为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免菌源中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10％的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌（如加链霉素25～50 u/ml以抑制细菌；添加制霉菌素50 u/ml或多菌灵30 u/ml以抑制霉菌）。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为pH 7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。 三、试验材料

1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、麦芽汁、氢氧化钠

2．其它：试管、三角瓶、移液管、烧杯、量筒、玻棒、漏斗、纱布、棉花、牛皮纸、天平、PH试纸、马铃薯干、高压蒸汽灭菌锅。

3无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒（刮刀）、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。

四、试验方法与步骤：

（一） 玻璃器皿的准备 培养基的配制消毒灭菌

1．根据实验需要，准备各种玻璃器皿，洗刷干净，用报纸包扎好，进行干热灭菌。需要什么，需要多少，各实验组要认真核算，否则影响实验进程。 2．培养基的配制：

（1）称药品： 根据配方，计算出试验中各种药品所需要的量，然后分别称取。 （2）溶解： 一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内，先加入少于所需要的总体积的水进行加热溶解（但在配置化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想）。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，，补足水分到需要的总体积。 （3）调节PH： 用滴管逐滴加入1N的NaOH，边搅动，边用精密的PH试纸测其PH值，直到符合要求时为止。PH值也可用PH计来测。 （4）过滤： 要趁热用四层纱布过滤。

（5）分装： 按照实验要求进行分装。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口，以免弄湿棉塞，造成污染。 培养基的分装装置见图

（6）加塞： 培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证优良还得通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形与未开伞的蘑菇相似，其大小、松紧都应适当。

加塞时，棉塞总长度的3/5应在口内，2/5应在口外。

作棉塞的棉花要选用纤维较长的，一般不用脱脂棉作棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也较贵。 棉塞的一般制作方法可参见图

如果培养基在短期内使用，不用棉塞，直接套上一只铝质试管帽也可试管帽是通过互相交叉的弹簧丝来控制与试管的松紧度。它的外形、构造如图

在微生物实验或科研工作中，常常要用到通气塞。所谓的通气塞就是用几层纱布（一般是六至八层）做成的、通气性能更加良好的塞子。通气塞加在装有液体培

养基的三角烧瓶瓶口上，放在摇床上进行振荡培养，可获得更多的氧气来促进菌体生长或进行发酵。它的形状如图

（7）包扎：棉塞塞好以后，试管用棉绳扎成捆。在棉塞的外面包上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水的沾湿和灭菌后的灰尘侵入。然后再用棉绳扎好，挂上标签，注明培养基的名称及配制日期。

（8）灭菌：一般情况下，培养基配好以后，应立即灭菌。如不及时灭菌，应放入冰箱内保存。

（9）搁置斜面：灭菌后，固体培养基如需制成斜面，应在未凝固前将试馆有塞的一头搁在一根长的玻棒或木条上即可。搁置的斜度要适当。斜面长度一般以不超过时管长度的1/2为宜 3．培养基的灭菌：

（1）加水： 直接往灭菌锅内加水约3升

（2）装料： 将待灭菌的物品放在灭菌桶内。包于包之间留有适当的空隙，以利蒸汽的流通。

（3）密封： 将盖上的软管插入灭菌桶的槽内。上下对齐，拧紧螺栓，切勿滴漏气。

（4）升压： 点燃煤气，加热至水沸腾，排尽锅内空气（可将排出的气体用橡皮管引至深层冷水中，如只听有“噗噗”之声而未见气泡逸出水面，表示锅内空气以排尽）。然后盖上放气阀，升压。

（5）灭菌： 待压力达到一定时，关小煤气，使其恒压，并开始计算灭菌时间。 （6）降压： 达到规定的灭菌时间后，关闭煤气，让其自然降压冷却。 （7）取料： 待压力完全降至“零”后，打开放气阀，再松动螺栓，拿掉盖子，从灭菌筒内取出灭过菌的材料。

（8）倒水： 灭菌锅用好以后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。 按照上面的步骤，参照教材，配置下列培养基，配制的量，同学们自己估算，要略有剩余，不能浪费。 A.配制营养琼脂培养基。 B.配制高氏一号培养基。 C.配制马丁氏培养基。

D.分装上述培养基与三角瓶和试管中，并包扎

E.将上述配置分装和包扎好的培养基进行高压蒸汽灭菌 （二） 土壤中细菌、放线菌、真菌的分离与纯化 1．细菌的分离

（1）制备土壤稀释液 称取土样1g，在火焰旁加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中，振荡10～20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10-2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10-7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10-3??10-7顺序编号，放置试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夹在手上，不能乱放在桌上），将1ml移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后准确吸取0.5ml 10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽（或棉塞），将0.5ml 10-2土壤稀释液注入4.5ml无菌水试管内，制成10-3的土壤稀释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽，右手持10-3稀释液试管在左手上敲打20～30次，混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出0.5ml 10的稀释液，置第二支装有4.5ml无菌水试管中，制成10土壤稀释液。用同法再制成10-5、10-6、10-7的土壤稀释液（为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管）。最后用毕的移液管重新放入纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中，用3％～5％来苏尔浸泡1h后再灭菌洗涤。

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（2）倾注法分离 取无菌培养皿6～9个，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按无菌操作技术加到相应编号10-7的无菌培养皿内。再以相同方法分别吸取1ml 10-6、10-5的土壤稀释液，各加到相应编号为10-5、10-6的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45～50℃左右，分别倾入到已盛有10-5、10-6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多，也会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拔开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12～15ml，将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置桌上。整个操作过程见图

（3）培养 待平板完全冷凝后，将平板倒置于37℃恒温箱中，培养24～48h观察结果。

2．放线菌的分离

（1）制备土壤稀释 液称取土样1g，加入到一个盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中，并加入10滴10％的酚溶液（抑制细菌生长），有时也可不加酚。振荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。

（2）倾注法分离 按前法将土壤稀释液分别稀释为10-3、10-4、10-5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1ml 10-5、10-4、10-3土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行皿。

（3）培养 冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养5～7d观察结果。 3．真菌的分离

（1）制备土壤稀释液 称取土样5g，加入到一个盛有95ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液。

（2）倾注法分离 依前法将土壤稀释液再稀释成10-3、10-4的土壤稀释液。然后用无菌移液管分别吸取1ml 10-4、10-3、10-2土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内。采用马丁培养基倾倒平板，为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马丁培养基临用前需无菌加入孟加拉红、链霉素和去氧胆酸钠。每个稀释度作2～3平行皿。

（3）培养 冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养3～5d后观察结果。 （三）划线分离法

菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种针上的菌（图6-1-4A）；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60～70°划线（见图6-1-4B），每换一次角度，应将接种针上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。 1．连续划线法

以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落（参见附录四微生物的接种技术）。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠（图6-1-4A，6-1-5）。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷凉后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落）。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。

2．分区划线法（四分区划线法，图6-1-4B）

取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。

本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。

五、复习思考题：

1．分析新配制培养基中，何为碳源，何为氮源？ 2．如何检查灭过菌的培养基是否无菌？

3．培养基为什么要调整pH值？细菌、放线菌、酵母菌、霉菌生长最适pH值为

多少？

4．根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、酵母菌与霉菌？它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系？

实验二 微生物的染色

由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。

一、染色的基本原理

微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。

细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。

影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养

基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。 二、染料的种类和选择

染料分为天然染料和人工染料两种。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水，通常制成盐类。

染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类。 1、酸性染料

这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。 2、碱性染料

这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色。 3、中性（复合）染料

酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核的染色。 4、单纯染料

这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudanb）的染料。

三、制片和染色的基本程序

微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。

1、制片

在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。 2、自然干燥

涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3、固定

标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个： １）杀死微生物，固定细胞结构。

２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。

３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。 固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。 以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1—2%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1—2分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。 4、染色

标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约1—3分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中。

若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。 ５、脱色

用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。 ６、复染

脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红最后进行染色，就是复染。 ７、水洗

染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。 ８、干燥

着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。 ９、镜检

干燥后的标本可用显微镜观察。 综上所述，染色的基本程序如下：

制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。

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四、染色方法

微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。 １、单染色法

用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红

等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。

单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。 染色结果依染料不同而不同：

石碳酸复红染色液：着色快，时间短，菌体呈红色。 美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色。 草酸铵结晶染色液：染色迅速，着色深，菌体呈紫色。 ２、革兰氏染色法

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。

另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

１）涂片固定。

２）草酸铵结晶紫染1分钟。 ３）自来水冲洗。

４）加碘液覆盖涂面染1分钟。 ５）水洗，用吸水纸吸去水分。

６）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 ７）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色

实验三 微生物细胞大小测定和计数

Ⅰ、微生物细胞大小的测定

一、实验原理

微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺(图)是一块圆形玻片，其中央刻有精确等分的刻度，有把5毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100毫米。测量时，将其放在接目镜中的隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同的显微镜放大倍数不同，同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下，其放大倍数也不相同，而目镜测微尺是处在目镜的隔板上，每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。而显微镜下的细胞物象是经过了物镜、目镜两次放大成象后才进入视野的。即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺(或血球计数板)校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格长度。 二、实验器材

1、仪器 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺或血球计数板 2、材料 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)标本片

目镜测微尺及其安装方法如图 三、操作步骤

1、目镜测微尺的校正 把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把血球计数板置于载物台上，使刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清血球计数板的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与血球计数板的刻度平行，移动推动器、使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和血球计数板的格数。因为血球计数板的刻度每格长50微米，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度：

目镜测微尺每格长度?两重合线间血球计数板格数?50?m两重合线间目镜测微尺格数

例如目镜测微尺10小格等于血球计数板2小格，已知血球计数板每小格为50微米则2小格的长度为2×50微米＝100微米，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为：

2?50微米?10微米10

同法校正在高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

2、测定巨大芽孢杆菌细胞大小 换上巨大芽孢杆菌标本片，先在低倍镜下找到目的物，然后在油镜下转动目镜测微尺，测出巨大芽孢杆菌菌体的长、宽各占几格(不足一格的部分估计到小数点后一位数)，测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。

一般测量菌的大小要在同一个涂片上测定10-20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 四、注意事项

1、 当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

2、 不能用血球计数板对目镜测微尺在油镜下进行校正时，此时目镜测微尺每格相当于1微米。

Ⅱ、微生物的显微镜直接计数法

一、实验原理

测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图Ⅳ-2)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图5)。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。

图Ⅳ-2 血球计数扳的构造

a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)

b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)

图Ⅳ-3 血球计数板计数网的分区和分格

二、实验器材

1、1、 菌种 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌液； 2、2、 仪器 显微镜，血球计数板； 3、3、 材料 盖玻片，吸水纸，尖嘴滴管。 三、操作步骤

1、视待测菌液浓度，加无菌水适当稀释(斜面一般稀释到10-2)，以每小格的菌数可数为度。

2、取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。

3、将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

4、静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 5、计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6、凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。

每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数 7、血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。 四、注意事项

1 加酵母菌液时，量不应过多，不能产生气泡。

1、由于酵母菌菌体无色透明，计数观察时应仔细调节光线。或者用吕氏碱

性美蓝染液处理酵母菌液。

实验四 细菌的生理生化试验

一、目的

（一）了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 （二）掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 二、原理

各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 三、材料 （一）菌种

大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、 （二）培养基

葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） （三）试剂

40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 （四）器具

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 四、流程

糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验 五、步骤 (一)糖类发酵试验 1.目的

了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2.原理

可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 3.材料 （1） 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、 （2） 培养基

葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 4.流程

发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5.步骤

(1)试管标记图糖发酵产气

取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气 4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。

(2)接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。 (3)观察记录

与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。 （二）乙酰甲基甲醇试验(V．P试验) 1.目的

了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法． 2.原理

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 3.材料 (1)菌种

大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、 (2)培养基

葡萄糖蛋白胨培养液的试管 4.流程

培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5.步骤 (1)标记试管

取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 (2) 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。 (3) 观察记录

取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min

后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。 注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。 （三）甲基红试验（M.R.试验） 1.目的

了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法． 2.原理

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 3.材料 (1) 菌种 同V．P试验 (2) 培养基 同V．P试验 4.流程

培养液→指示剂→观察→记录结果 5.步骤

于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

（四）吲哚试验 1.目的

掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法 2.原理

有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。

3.材料 (1) 菌种 测试菌株． (2) 培养基 蛋白胨水培养基 (3) 试剂

二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 4. 流程

标记试管→接种→培养→观察→记录 5. 步骤 (1) 试管标记

取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 (2) 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。 (3) 观察记录

在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。 6. 结果

记录生理生化反应测定结果． 7. 思考

1) 以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么？ 2) 细菌生理生化反应试验中为什么要设对照． 3) 试设计一试验方案，鉴别一株肠道细菌．

实验五 化学因素对微生物的影响

一、目的要求

1．了解常用化学药品对微生物的作用。 2．学习测定石炭酸系数的方法。 二、基本原理

常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类，酚、醇、醛等有机化合物以及碘、表面活性剂等。它们的杀菌或抑菌作用主要是使菌体蛋白质变性，或者与酶的—SH基结合而使酶失去活性所致。

本实验是观察某些常用的化学药品在一定浓度下对微生物的致死或抑菌作用，从而了解它们的杀菌或抑菌性能。

为了比较各种化学消毒剂的杀菌能力，常以石炭酸为标准，即将某一消毒剂作不同稀释后，在一定条件下，一定时间内致死全部供试微生物的最高稀释浓度，与达到同样效果的石炭酸的最高稀释度的比值，称为这种消毒剂对该种微生物的石炭酸系数（酚系数）。石炭酸系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。 三、器材

大肠杆菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2．5％碘酒，0．1％升汞（HgCl2），5％石炭酸，75％酒精，1％来苏尔，0．25％新洁尔灭， 0．005％龙胆紫，0．05％龙胆紫； 培养皿，滤纸片，试管，吸管等。 四、操作步骤

1．各种化学药品的杀菌作用

(1)用无菌吸管吸取培养18小时的白色葡萄球菌菌液0．2ml于无菌平皿内。 (2)倒入已溶化并冷至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于上述平皿内，充分摇匀，水平放置，待凝。

(3)将上述已凝固的平皿用记号笔在平皿底划成八等份，每一等份内标明一种药物的名称。

(4)用无菌镊子将小圆形滤纸片分别浸入各种药品中，取出，并在试管内壁上除去多余药液后，以无菌操作将纸片对号放入培养皿的小区内，如图Ⅸ-1。

(5)将上述放好滤纸片的含菌平皿，倒置于37℃温室中培养24小时后，取出测定抑菌圈大小，并说明其杀菌强弱。 2．石炭酸系数的测定

（1）将5％（1：20）的石炭酸液按表Ⅸ-1配成不同浓度，每管5ml。 （2）将待测药物（来苏尔）先配成1：20的原液，再按表Ⅸ-2配成不同浓度，每管 5ml。

（3）取肉膏蛋白胨液体培养基30管，1—15管标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理，16—30管标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理。

（4）在上述不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液中，各接入0．5ml大肠杆菌液，摇匀。注意每管自接种时起在5、10、15分钟，用同一接种环从各管内取一环接入上述已标记的液体培养基试管中。

（5）置37℃温室中培养 48小时，观察并记录生长情况。生长者溶液混浊，以“+”表示；不生长者溶液澄清，以“-”表示。

（6）计算系数值 找出在5分钟生长，而在10分钟和15分钟均不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释度，计算二者的比值。例如石炭酸在10分钟内杀死大肠杆菌的最大稀释度是1：70，来苏尔是1：250，则来苏尔的石炭酸系数为250/70=3．6。 五、实验报告 1、结果

（1）各种化学药品对白色葡萄球菌的致死能力 （2）石炭酸系数的测定和计算

（3）来苏尔对大肠杆菌的石炭酸系数是多少？ 2．思考题：

化学药剂对微生物所形成的抑菌圈未长菌部分是否说明微生物细胞已被杀死？

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