植物细胞骨架的光学和荧光显微镜观察

植物细胞骨架的光学和荧光显微镜观察

一、实验目的：掌握植物细胞骨架处理及染色方法。

二、实验原理：用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内蛋白

质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，用光学染料考马斯亮兰R250和荧光染料鬼笔环肽染色，在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察微丝结构。

三、实验步骤：

光学观察 1、

撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小若干片）置于装有

pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；材料预处理时间太短会影响下一步操作，务必过夜处理。 2、 3、 4、 5、 6、

吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20min； 吸去1% TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次8min； 3%戊二醛固定30min；

pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次8min；

0.2%考马斯亮兰R250染色20min或者25μg/ mL罗丹明-

鬼笔环肽染色1小时； 7、

用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺子载玻片上，加盖

玻片，于显微镜下观察。

荧光观察：

1． 固定液中(固定液成份:4 %多聚甲醛, 50 mmol/ L Pipes pH 6.9 ,

5 mmol/ L EGTA , 5mmol/ L MgSO4 ) 固定1 h。

2． 利用Pipes 缓冲液(pH6.9) 结合离心洗涤3 次,再用1%Triton

100 抽提30min 。

3． 然后将洋葱表皮细胞加入终浓度为25μg/ mL罗丹明- 鬼笔环

肽(TRITCOPh) 0.5 mL ,混匀后黑暗条件下25 ℃反应1 h。或者0.2%考马斯亮兰R250染色20min。

4． 随后再用Pipes 缓冲液结合离心再洗涤3 次

5． 最后用50 % 的甘油(50 mmol/ L ,pH 6.9 Pipes 缓冲液配制) 装

片观察。

四、实验作业：

1、 2、

绘制你所观察到的植物细胞骨架图象；

戊二醛、多聚甲醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什

么？在本实验中各起什么作用？

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