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第一章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术

1、普通光学显微镜 结构特点 分辨率 样品片的类型 普通光学显微镜由3部分构成：

①照明系统；②光学放大系统；③机械装置。

显微镜的质量不仅决定于放大倍数，还取决于显微镜的分辨力。

分辨力是指显微镜或人的眼睛在25cm处能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光波的波长和镜口率以及介质的折射率，可以下公式表示：

R=0.61λ /N．A N．A．＝ｎ.sinα/2

式中：n=介质折射率；α=镜口角（聚焦点对物镜镜口的张角）。 普通光学显微镜的分辨率是怎样得知的?

制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65--1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。镜口角总是要小于180?，所以sin a/2的最大值必然小于1。对于干燥物镜来说，介质为空气，其折射率为1，镜口率一般为0.05-0.95；油镜头用香柏油为介质，其折射率为1.515。镜口率可接近1.5。 可见光波长为390-760nm，因此普通光学显微镜分辨力不会小于0.2μm。 显微镜的两个重要的技术指标

2、荧光显微镜（fluorescence microscope）

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料特异染色或用偶联荧光染料的抗体特异性标记后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性、定位和定量研究。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：

⑴照明方式通常为落射式，即激发光经物镜照射到样品，样品受激发后发出的发射光再经物镜聚光投射到观测光路中； ⑵光源通常为高压汞灯和卤素灯；

⑶两个特殊的滤光片组件，称激发／发射滤光片组件，针对拟使用的荧光色素或样品的荧光特性选择对应波谱的激发／发射荧光组件，做到合理搭配；

⑷双色分光镜，能选择性的透过或截止激发光和发射光； ⑸物镜由无荧光氟石或萤石玻璃制成 滤色镜系统配合 激发区 激发滤色镜 二向色镜 阻断滤色镜 U （紫外） U（UG-1） U（DM-400+L-420） L-435以上 V（紫） V（BG-3+IF-405） V（DM-455+Y-455） Y-475以上 B（蓝） B（IF-490） B（IF-490）+EX-450 B（DM-500+O-515） O-530以上 G（绿） G（IF-545+BG-36） G（DM-530+O-590） R-610 具有自发荧光的物质在紫外线的照射下可显示出荧光像，因而可直接检测到该物质。但不具有自发荧光的物质则不能直接捡测到。 如拟对不具有自发荧光的物质进行检测，则必须事先对拟检测的物质给予荧光色素(荧光物质)的标记(荧光染色法)。荧光抗体法就是根据此特点在进行抗原一抗体反应时，将与抗原结合的抗体用荧光色素事先进行标记，制成荧光抗体，再使标记了荧光色素的荧光抗体与抗原结合，从而标记出抗原。

作为荧光染色，可以使用具有从可见光到红外线光色谱中的各种各样波长的荧光色素。将用这种方法获得的荧光称为附加荧光或二次荧光。

3、激光共焦点扫描显微镜（Lass scanning confocal microscope LSCM）

1957年，Marvin Minsky申请了激光共聚焦扫描显微镜的发明专利，但直到1987年该仪器才开始真正商业化生产。

? 基本组件和工作原理 ? 观察生物样品中的优越性 ? 适用范围

激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的基本组成和工作原理

LSCM 的组成除光学显微镜部分之外，主要由激光发射器、扫描装置、光检测器、计算机系统(包括数据采集，处理，转换，应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。

LSCM 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。激光扫描束经照明针孔形成点光源，经分光镜反射后，通过物镜聚焦在样品上。对标本内焦平面上的每一点进行扫描，标本上的被照射点所发射的荧光被物镜收集，透过分光镜后在探测针孔处成像，该点以外的任何发射光均被阻挡。然后经探测针孔后的光电倍增管或冷电感耦合器件逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。

在共聚焦扫描装置中，由于激光光源的照明针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的，即焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔，进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像, 经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片。

另外，还可通过计算机控制显微镜载物台上的微量步进马达，使显微镜上下步进移动，从而实现对细胞或组织切片进行类似CT断层扫描的无损伤连续光学切片，然后经过计算机的三维重构，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。 激光共聚焦显微镜在观察生物样品中的优越性：

对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。 ? 对细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如pH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。

? 荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品

片上同时进行多重物质标记，同时观察。

? 对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。

用途 可用于组织和细胞中荧光标记的分子或结构的定位、定量分析；钙离子、pH及其他细胞内离子浓度及变化的实时定量测定；三维图像重建；荧光光漂白及恢复技术等。 4、相差显微镜(phase-contrast microscope)

相差显微镜由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差：同一种光波通过折射率不同的物质时，光的相位会发生变化，在某一位置上，波峰与波谷不一致，存在相位上的差异。 光的干涉现象：光通过质点后产生直射光和衍射光，衍射光相位延后，振幅减小。如果这两束光在同一个光学系统中向同一方向传播时，会发生合成。

相长干涉：如果相位相同的两束光在同一个光学系统中发生合成，其合成光的振幅会加大，振幅反映了亮度，合成光的亮度会比背景的强。

相消干涉：如果相位不同（相差半周期）的两束光在同一个光学系统中发生合成，其合成光的振幅会减小，合成光的亮度会比背景的暗。 明反差：影像中样品亮而背景暗形成的反差。 暗反差：影像中样品暗而背景亮形成的反差。 相差显微镜与普通光学显微镜在结构上的不同点：

环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 相位板（annular phaseplate）安装在物镜和目镜之间，涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： A+相板：将直射光推迟1/4λ，使其与衍射光处于同一相位，两组光波合成后振幅加大，标本结构比周围介质亮，形成明反差。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，使其与直射光相差1/2λ，两组光线合成后振幅变小，标本结构比周围介质暗，形成暗反差。

5、微分干涉差显微镜

（differential interference contrast（DIC） microscope）

DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarski contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC显微镜的物理原理类似相差显微镜，技术设计要复杂得多。

为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，从而改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。 DIC显微镜使细胞的细微结构特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。 7、偏光显微镜（polarizing microscope）

用途 偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。

和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器。这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体的存在。 二、电子显微镜技术 1、普通透射电子显微镜

（transmissive electron microscope TEM）

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各种波长的实际极限 ? TEM的结构

? TEM的工作原理和分辨率 ? TEM的适用范围 ? TEM所要求的样品

? 透射电镜与普通光镜的主要区别 波长的比较： 可见光：7600-3900埃 紫外光：3900-1300埃 X-射线：130-0.5埃 γ-射线： 1-0.05埃

电子波：1万伏 0.122埃 10万伏 0.0387埃 透射电镜的结构：

? 电子光学系统（镜筒）：照明系统；样品室；成像放大系统；观察记录系统。

? 真空系统：泵；控制管道和阀门；真空测试装置。

? 电路系统：高压发生器；稳压、稳流电路；自动控制电路。 透射电镜的工作原理：

电子枪的阴极通电加热到一定温度后，发射电子，由于阴阳极之间有很高的电位差（约-10万伏），引起了电子的快速流动，形成了一束强的照明电子流。经阳极孔的汇聚，形成了一束很细的但电子密度高的电子流，经磁透镜的会聚，打在样品上。高速的电子与样品中原子的电子发生碰撞，发生散射，散射角小的电子与透射电子参与成像，它们经过物镜、中间镜的逐级发散、放大，最后投射到荧光屏上。由于切片中各部分的密度有差异，透过切片的电子就有了疏密之别，电子激发荧光物质所产生的荧光就有了强弱之别。 透射电镜与普通光镜的主要区别：

? 照明源 ? 照明控制 ? 成象透镜 ? 样品片 ? 聚焦法 ? 成象原理 ? 像的观察

? 分辨率 放大倍数

2、扫描电子显微镜（scanning electron microscope 简称SEM）

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SEM的结构 ? SEM的成像原理 ? 电子信号的种类及作用 ? SEM的适用范围

? SEM对样品的要求及样品类型 ? 与TEM相比SEM的特点 扫描电镜的结构特点：

? 电子光学系统

? 电子信号的收集、处理、显示记录系统 ? 真空系统 ? 电路系统 ? 能谱仪等附件 SEM的成像原理：

电子枪阴极发射的电子束受到阴阳极之间加速电压的作用快速射向镜筒，经聚光镜汇聚成直径为几十埃的细电子束，再经物镜的汇聚，形成更细的、密度更大的电子束（即电子探针），在样品表面作光栅状扫描。样品经入射电子轰击后产生各种电子信号，这些信号分别被相应的检测器捕捉（扫描电镜主要是利用二次电子成像），经转换（将电信号的强弱变为亮度的强弱）、放大（光电倍增管），变为电压信号，来控制荧光屏上扫描的电子束的强度，使其与上述电子束的扫描严格同步，并使其衬度（对比度）与接收信号的强度相对应，因此在荧光屏上产生了扫描电子像。

电子信号的种类：二次电子； 背散射电子；x-射线； 吸收电子等 扫描电子显微镜的适用范围

扫描电子显微镜对样品的要求及样品类型 扫描电镜的适用范围和领域 与TEM相比，SEM的特点：

图像富有立体感； 制样； 样品尺度；分辨率 ； 放大倍数； 适用领域 三、扫描隧道显微镜（STM）

扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由IBM公司瑞士苏黎世研究所的Binnig和Rohrer于1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。1986年曾获诺贝尔物理奖。 1988年中国科学院白春礼和姚俊恩研制出了我国的第一台扫描隧道显微镜。

扫描隧道显微镜是另一种研究物质微观结构的全新技术，其放大倍数可达上亿倍，它采用尖端只有一个原子大小的特殊探针对物质表面进行逐行扫描，来获得原子尺度的样品图像，它也可以用探针对单个原子和分子进行操纵，对材料表面进行微加工。

? STM的主要装置

在多级减振系统中

一个由压电陶瓷制成的爬行器和 一个由三维压电陶瓷杆做成的的支架。 STM的工作原理

当原子尺度的针尖在纳米级的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV-2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度（Ⅰ）和针尖与样品间的距离（d）有一定的指数关系，当针尖沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化，即可显示出样品在原子水平的表面凹凸形态。 STM的特点：

? 高分辨率 扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1- 0.2nm，纵向可达0.001nm。

? 观察环境宽松 可在真空、常压空气，甚至液体中探测物 质的表面结构，对样品表面没有热损伤作用。

? 直接探测样品表面，得到立体图像。 STM的适用范围

利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵；直接观察某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。

第二节 细胞组分的分析方法 一、离心技术（centrifugation）

离心是研究细胞核、线粒体、叶绿体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子的基本手段。一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机；转速超过25000r/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。 从组织得到细胞的方法

悬浮介质需注意的问题：pH; 渗透压；离子强度（缓冲液；蔗糖；无机盐） 细胞破碎的方法 （一）、差速离心

（differential centrifugation）

速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降,从而达到分离。 这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。

速度沉降是指在密度均一的介质中，由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器的方法。

在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、叶绿体和质体、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网小泡与高而基体小泡、最后为核糖核蛋白体。

由于某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般在粗分离后，需要重复离心2～3次，纯化效果会好一些，这就是差速离心。

差速离心只用于分离大小悬殊的细胞器。通过差速离心将细胞器初步分离后，常需进一步通过密度梯离心再行纯化。 分离不同的细胞结构所需的相对离心力

细胞核 500-2000XG 叶绿体 2000-8000XG 线粒体 10,000-20,000XG 溶酶体 10,000-20,000XG 核糖体 100,000-105,000XG (结合0.26%的脱氧胆酸钠) （二）、密度梯度离心

（density gradient centrifugation ）

用一定的介质在离心管内从上到底形成一连续的或不连续的密度梯度（从上到下密度依次增大），将细胞器混悬液置于介质的顶部或与离心介质混匀，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离。

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