第五章 色谱理论

第五章 色谱原理

5.1

色谱的原理和分类

5.1.1色谱色基本原理

色谱技术是一种重要的分离和分析技术，其用于物质的分离始于二十世纪初。1903年，俄国植物学家Tswett向填充碳酸钙的柱中注 入植物色素的石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，色谱法的命名就是由此发现开始的。随后色谱技术得到不断发展。Martin于1952年因创立气－液色谱分离方法而荣获诺贝尔奖。气相色谱的出现极大地鼓舞了世界各地的科学工作者，激发了人们对分析色谱技术进行放大，使之用于制备目的和工业生产的研究兴趣。资料表明，在50和60年代，分析和生产规模的气相色谱分离技术的研究十分活跃。到了70年代，尤其是在美国制糖工业采用酶法转化技术生产高果葡糖浆以后，液相色谱技术就变成了一个热门的研究领域。色谱在英文中只有一个名词Chromatography），但在中文中却有色谱和层析的名称。 色谱的主要装置如图所示;

1

图 色谱的主要装置图

色谱实际是 色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进

行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且应用于生物物质的制备分离和纯化，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。 5.1．2色谱的分类 1) 流动相与固定相

色谱法根据流动相的相状态分气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱

法，而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。 2) 固定相的形状

根据固定相或色谱装置形状的不同，液相色谱法又分为纸色谱法（Paper chromatography）、薄层色谱法（Thin－layer chromatography）和柱色谱法（Column chromatography）。纸色谱法和薄层色谱法多用于分析目的，而柱色谱易于放大，适用于分离大量制备分离，是主要的色谱分离手段。 3) 分离操作方式

色谱法根据分离操作方式的不同可分为间隙色谱和连续色谱两大类。间隙色谱技术通过合理选择固定相介质和冲洗剂可以得到广泛应用。但是，在工业应用中更希望采用连续分离操作，尤其是分离过程必须与其他连续单元操作（如连续生化反应器）同时进行时更是如此。 5.1.3色谱的主要检测器

色谱峰的确定完全考检测器,所以检测器的好坏对色谱技术是十分重要的。气相色谱的检测器主要有以下几种：

2

（1） 氢火焰检测器 （2） 热导检测器 （3） 离子检测器

这些检测器的主要功能如表所示 表 气相色谱检测器 检测器种类 优点 缺点 应用对象 灵敏度较低 氢焰离子化检测（1） 成本低廉 器（FID） （2） 通用性广 （3） 热导检测器（1）成本低廉 （TCD） 电子捕获检测器灵敏度高 （ECD） 设备昂贵 火焰热离子检测（1）对氮、磷化 器（FTD） 合物有高的选择性合灵敏度 火焰广度检测器 适合于农药、药物残留分析 液相色谱的主要检测器有紫外检测器、视差折光检测器、蒸发散射光检测器、等

其主要功能如表所示。

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表 液相色谱检测器的主要功能 检测器种类 紫外检测器 优点 （4） 成本低廉 （5） 通用性广 （6） 示差折光检测器 （1） (1) 不容易做梯度 (2) 灵敏度低 化学发光检测器 缺点 干扰大 应用对象 对有紫外吸收的有机物合蛋白质、核酸等适用 对糖类检测 蒸发散射光检测 器 荧光检测器 电化学检测器

5.1．4 生物分离制备液相色谱的类型和特点

气相色谱主要用于挥发性成分的分析。在生物产品的分离纯化中主要采用的液相色谱。液相色谱中有些主要是用于分析如反相色谱。液相色谱方法的主要特点是：分离效率高，选择性好，适用于各种多元组分复杂混合物的分离；应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等，可以说几乎包括了所有类型物质。

表1 适用于大规模生物分子分离纯化的主要色谱方法 分离分离原特点 理 应用 4

使用率/% 方法 离子交换 疏水色谱 亲和色谱 凝胶过滤 吸附色谱 共价色谱

其实上表只是给出了目前常用的生物产品用液相色谱。还有许多新的液相色谱。如分子印迹层析技术，。 5.1．5 液相色谱介质和操作形式

液相色谱介质主要是颗粒状、膜状和一体柱形式。颗粒状介质，包括球星颗粒、无定型颗粒等。膜状介质是将膜用作介质，一体柱介质又称为连续床或

5

（1） 通常分辨率高。 （2） （2）选用介质得当时流速快，容量最适用于大量样品处理的前电荷 75 很高，样品体积不阶段。 受限制。 （3） 成本较低 适用于分离的任何阶段，尤（1）分辨率好。（2）流其是当样品的离子强度高疏水性 速快。（3）容量高，样〉33 时，即在盐析、离子交换和品体积不受限制。 亲和层析后使用。 （1）分辨率非常高。（2）适用于分离纯化的任何阶亲和性 流速高，样品体积不受段，尤其是样品体积大、浓60 限制。 度很高而杂质含量很高时。 （1）在分级方法中分辨率中等，但对脱盐效果适用于大规模纯化的最后步优良。（2）流速较低，分子大骤，在纯化过程的任何阶段对分级每周期约〉8小50 小 均可进行脱盐处理，尤其适时，对脱盐仅30分钟。用于两种缓冲液交替时 （3）容量受样品体积的限制 （1） 吸附剂比较廉价 范德华可用于大规模分离的初步分（2） 分辨率较高 物理吸离 30％ （3） 选择时试验工作附 适合小分子的分离纯化 量大 共价键（1）选择性好 作用 适合含硫醇蛋白质的分离纯不多 化

连续棒，即介质单体材料在柱中直接聚合，形成多孔状网，达到吸附分离的目的。

液相色谱的固定相目前主要是颗粒状介质，但颗粒状介质存在内扩散阻力和颗粒分布不均匀的问题，近几年开始研究连续床或大孔灌柱色谱的方法来解决这个问题。这些会在后面章节中详细讨论。 目前颗粒状介质主要是考填充的方式填在柱子中。

5．2．色谱理论

5．2．1概论

色谱理论是研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。色谱学理论研究的三个主要问题是[1]：色谱过程的热力学研究，它是发展高选择性柱的理论基础；色谱过程的动力学研究，它是发展高效能色谱柱与高效能色谱方法的理论基础；色谱分离条件的选择和优化，它是多元混合物分离的理论基础。 5．2.2吸附平衡热力学

描述吸附平衡的模型有多种形式，早期经验模型如：亨利（Henry）模型，

6

佛罗因得利希(Freundlich)模型，兰格谬尔(Langmuir)模型和BET（Brunauer-Emmett-Teller）模型。最近发展起来的吸附模型有质量作用模型，空间质量作用模型等。

溶质在吸附剂上的吸附平衡关系是指吸附达到平衡时，吸附剂的平衡吸附质浓度q与液相游离溶质浓度c之间的关系。一般q是c和温度的函数，既

q?f(c,T)（1）

但一般吸附过程是在一定的温度下进行，此时q只是c的函数，q与c的关系曲线称为吸附等温线（adsorption isotherm）。当q与c之间呈线性函数关系，

q?mc（2）

时，称为亨利（Henry）型吸附平衡，其中m是分配系数。该式一般在低浓度范围内成立。当溶质浓度较高时，吸附平衡常呈非线性，该式不再成立，经常利用佛罗因得利希（Freundlich）经验方程描述平衡行为，既：

q?kcn（3）

1其中k和n为常数，一般110，可用矩形吸附平衡关系近似。 5．2.2.1 Langmuir 模型

Langmuir模型是描述吸附过程最简单和最常用的模型，也是第一个有一定理论基础的吸附模型。它最初源于气体吸附过程,从动力学角度推导出来的,基于以下假设:(1)分子只在固体表面的固定位点吸附;(2)每个吸附位点只能吸附一个分子,吸附分子在固体表面形成单分子层;(3)所有吸附位点的能量相等;(4)吸附分子之间没有相互作用。基于 Langmuir单分子层吸附理论，可推导Langmuir型平衡方程。

q?qmc (4) kd?c7

或： q?qmKbc (5) 1?Kbc

其中，qm为饱和吸附容量，Kd为吸附平衡的解离常数，Kb为结合常数（=1/Kd）当n个溶质分子在一个活性点上发生吸附时，可得上式的一般形式：

qmKbcn(6) q?n1?Kbc对于n个组分的单分子层吸附，又变成另一种形式：

q?qmKbjci1??Kbjcjjn(7)

5．2.2.2 BET方程

如果假设在吸附剂表面吸附的单分子层分子的附着力比吸附质分子之间的内聚力大得多，并在吸附剂表面产生化学吸附形成络合物，可假定分子层在表面不能自由移动。Brunaur、Emmett和Teller提出的BET模型认为，被吸附的分子不能在吸附剂表面自由移动，吸附层是不移动的理想均匀表面。其吸附可以是多层吸附，层与层之间的作用力是范德华力，各层水平方向的分子之间不存在互相作用力，即在第一层吸附层上面，可以吸附第二层，第三层，不等到上一层吸附饱和就可以进行下一层的吸附。各吸附层之间存在着动态平衡，即每一层形成的吸附速率和解吸速率相等。单分子层可由向空的表面吸附或双层分子层解吸产生，吸附速率与吸附有效面积的大小和分子碰击表面的频率有关。恒温下基于气体动力学理论，得出多层物理吸附等温方程为[2]：

q?qmbP(8)

??P(P0?P)?1?(b?1)?P0??式中：b为与吸附热有关的常数； q表示平衡压力为P时的吸附容量； qm饱和吸附容量；

8

P0为实验温度下溶质的饱和蒸汽压。 5．2.2．3质量作用模型

生化分离中经常用色谱法分离纯化生物大分子如蛋白质、多肽。此时如果用Langmuir模型来描述吸附平衡，由于模型简单，未能考虑到溶液反离子等因素的影响，往往得不到好的结果。下面以蛋白质的离子交换为例，介绍近年来常用的质量作用模型和空间质量作用模型。

质量作用模型（Stoichiometric Displacement Model,简称为SDM）是建立在质量作用定律基础上的非机理模型[3]，

常用来描述生物大分子如蛋白质在吸附剂上的吸附平衡。该模型假设离子交换是吸附过程的唯一机理，离子交换过程用满足质量作用定律的化学计量“反应”来描述，这样，在吸附过程中维持固定相电中性。蛋白质分子通过与反离子竞争吸附结合到离子交换配基上。模型假设如下：（1）系统为理想体系，各组分的活度系数为1；（2）与蛋白质分子结合的伴离子(co－ion)分成两类：当蛋白质在离子交换介质上吸附时，第一类伴离子从蛋白质释放出来，而第二类伴离子始终与蛋白质分子相结合。由此假设，蛋白质可看成中性的盐，在水溶液中电离成多价离子；（３）在恒定的PH下，蛋白质的性质，如带电荷数、电荷分布、分子结构和大小等，在整个吸附过程不发生变化；（４）固定相均一，孔道形状和尺寸均匀，且孔道直径足够大，不存在尺寸排阻作用；（５）不考虑蛋白质与离子交换剂之间的疏水作用。 离子交换平衡方程如下（以阴离子交换剂为例）：

n?PBr?m?m?Yn?m?An??n?YmPBr?n?m?B? m为特征电荷，即蛋白质吸附时，能替换下来的单价反离子数。如果P是

9

碱基数小于１0的寡糖核苷酸，m等于分子所带的净电荷数；但对于生物大分子，由于其复杂的三维构像是带电残基形成特殊分布，特征电荷数小于其所带的净电荷数。另外，在静电作用下，蛋白质从流动相向固定转移过程中，由于蛋白质在分子热运动下发生旋转取向，使蛋白质与固定相结合的自由能最小；在一定的操作条件下，如恒定的pH和盐离子浓度下，可能有多个蛋白质取向存在，蛋白质的取向与吸附蛋白浓度有关。因此m代表竞争吸附的平均作用，它的实验值不一定是一个整数。

[YmPBr]n[An?]m[B?]mn 吸附平衡常数定义为：K?(9) nm[PBr?m][YnA]'在吸附过程中，第一类伴离子从蛋白质上释放，即：

?PBr?m?PBm?m?B? r 上述方程的平衡常数为：

?[PBmr](10) K?[PBr?m]''

（9）式、（10）式相结合，可的离子交换的总平衡常数K?K'/(K'')n为：

[YmPBr]n[An?]m(11) K?m?nm[PBr][YnA]

离子交换剂的交换容量qY为蛋白质和反离子所占的吸附位之和，即：

qY?m[YmPBr]?n[YnA](12)

10

式中A=2/Tm，且

1?m12?16 E?5.7(1??m)设当K?1时，(?a??m?K?a)/(?a?K?a)趋近于1，并且

F?1?m(1??m)Ts30?s

设当K?1时，(?a??m?K?a)/(?a?K?a)2趋近于1/K。

对于液-固色谱，h的表达式则为：

h?2?2dp2Dm?Tmu1??1(Dm/udp)122123216121?????m?Ks???mdp?u?(50) ??235.7????Ks??(1??m)Dm21?????m?K???m(1??m)Tsdpu???30?(???K?)2??sDAS5．2.4.2 传质速率控制理论 4.2.1 引言

考虑到溶质在吸附剂上发生吸附时，溶质由液相主体到与吸附剂上的吸附点结合需经历三个过程：首先，溶质从液相主体通过液膜扩散到达吸附剂粒子外表面（液膜扩散传质阻力）；然后，在固体颗粒内部孔隙中进行扩散到达吸附点（孔扩散传质阻力）；最后，溶质在吸附点上发生吸附（表面吸附阻力）。同时考虑上述三个步骤对吸附速率的影响将使模型变的非常复杂，具体使用存在较大困难。对于实际物系，其中的一个或两个步骤往往是吸附过程的速率控制步骤，据此建立速率控制模型称之为传质速率控制理论。 根据不同的吸附物系，常使用如下几种速率控制模型。

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1 液膜传质扩散速率控制模型

该模型假设吸附剂粒子外表面的液膜传质速率为控制步骤，因此粒子内浓度均一，该模型只适用于吸附剂粒径非常小或溶质的内扩散系数非常大的情况。

2 吸附剂表面吸附速率控制模型

该模型假定表面吸附速率远小于液膜及内扩散传质速率，此时吸附剂粒子内外

吸附质浓度均一。在绝大部分实际

0

固 相 液 相 （1-ε） ε uC

情况下，表面吸附速率要远大于液膜及内扩散传质速率，只有在极个别情况下，溶质与结合位点的结合速率才非常缓慢

?C?Dz

?zz

z+dz

?Dz??C(C?dz) ，此时吸附剂表面吸附速率成为吸?z?z?Cdz) ?z附过程控制步骤。 3 孔扩散速率控制模型

在绝大多数实际吸附过程中，液膜

L

u(C?图3 膜-孔扩散模型示意图

传质和表面吸附速率较孔扩散速率要大，因此很少单独考虑液膜传质和表面吸附速率为控制步骤的情况，而是经常认为孔扩散或孔扩散与液膜传质速率为控制步骤。

下面以蛋白质分子在大粒径吸附剂上的吸附膜-孔扩散模型为例简述一下传质速率控制模型。

5．2.4.2.2膜-孔扩散模型

Arnold的孔扩散模型能较好的描述蛋白质分子在大粒径吸附剂上的吸附

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动力学行为[12,13]。综合考虑孔扩散和液膜传

质即得到膜-孔扩散模型。膜-孔扩散模型假设[14,15]：液相主体不存在浓度梯度；吸附剂颗粒为球形，有能够均一的尺寸和密度，且离子交换剂的官能团均匀的分布在颗粒内部；吸附剂为多孔物质，孔内溶质发生扩散可用孔扩散系数Dp描述，假定Dp与溶质浓度无关，且吸附介质中蛋白质的孔隙率是恒定的；被吸附物质与吸附点之间的表面反应可看作快速不可逆过程，在等温吸附下它的平衡行为可用Langmuir吸附等温方程表示；液膜传质系数kf是膜-孔扩散模型中的特征参数，假定kf控制着吸附剂表面传质；液膜传质和孔扩散是色谱过程控制步骤。

上图为色谱过程示意图。将色谱柱分为液相和固相两部分，设床层空隙率为ε，色谱柱截面积为S，柱高为L，流体的线速率为u，轴向扩散系数为Dz。柱入口到微分元的距离为z。

1、吸附剂颗粒内部衡算方程

吸附剂颗粒内部的蛋白质点浓度Ci有下式描述，式中ε

p

是相应蛋白质的

孔隙率，qi是吸附剂上吸附蛋白质的点浓度，r是吸附剂颗粒的径向坐标。

?Ci?2Ci2?Ci?q?p??pDp(2?)?(1??p)i(51) ?t?rr?r?t用Langmuir吸附等温式确定孔内蛋白质与所处位置的固相表面所吸附的蛋白质之间的关系。

2、流动相即液相主体衡算方程

溶质进入图1.2中的微分元（液相部分）的速率为

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Rin?(uC?DZ?C)?S(52) ?Z而溶质从微元体中的流出速率为

?C??C??Rout??u(C?dz)?Dz(C?dz)??S(53)

?z?z?z??液膜传质速率kf把流动相蛋白质浓度C和颗粒表面孔内浓度联系起来，固液间传质速率为

Rs?l?(1??)Sdz???kf(C?Ci)(54)

式中?及k?分别表示色谱吸附介质颗粒的比表面积和液膜传质系数。 溶质在微元体内的积累为

Rall??C?Sdz(55) ?t由质量守恒原理，即 Rall?Rin?Rout?Rs?l，代入以上相关各式，经推导得流动相衡算方程

?C?2C?C3(1??)kf?Dz2?u?(C?Ci?t?zR0??zr?R0)(56)

式中R0为吸附剂颗粒半径。

3、 边界及初始条件 采用脉冲进样方式：

孔相： 初始条件：qi?0Ci?0 t?0z?0 边界条件：

?qi?0 t?0 r?0 ?rkf?Ci?(C?Ci)t?0 r?R0 ?r?pDp24

流动相： 初始条件：C?0 t?0 z?0

边界条件： C?C0?C?Dz?C u?z0?t?tp z?0 tp为脉冲进样时间

Dz?C t?tp z?0 u?z?C?0 t?0 z?L ?z结合边界和初始条件，对于液相主体可采用有限元正交配置法进行模拟计算，固定相粒子内采用正交配置法进行模拟运算。

符号一览表

a 柱相比，即vm/vs

? 比表面积

A 反离子， B 伴离子，

df 固定相层厚度（cm） dp 微粒直径（cm） DA 动态吸附系数（cm/s）

Dm 流动相中溶质的扩散系数（cm2/s） Ds 固定相中DA溶质的扩散系数（cm2/s） DAS

DA和Ds（cm2/s）的组合“加重”效应

Dp 溶质在吸附剂孔内扩散系数（cm2/s） Dz 轴相扩散系数（cm2/s）

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H 单位长度（cm）变化相当于一个理论塔板高度 kf 液膜传质系数 K 分配系数

l

柱长（cm）

n 理论塔板数 q 吸附容量 qm 饱和吸附容量

vm 流动相在一块理论塔板上的体积（cm3） vs 固定相在一块理论塔板上的体积（cm3） V 流动相体积（cm3）

Vm 固定相在柱中的总体积（cm3） Vs 流动相在柱中的总体积（cm3） Xm 溶质在流动相中的浓度(g/cm3) Xs 溶质在固定相的浓度(g/cm3) Y 含有一个吸附位点的固定相?

?a?被a相占据的柱体积分数?

???被?相占据的柱体积分数??m?被流动相占据的柱体积的分数?

?s?被固定相占据的柱体积的分数??1，?2?无量纲常数?

? 以恰当面积表示的溶质谱带标准偏差 ?P 蛋白质的空间因子

??吸附剂总表面积与柱体积的比值（cm）?

-1

??无量纲常数?

26

?

参考文献：

?

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