免疫组织化学步骤详解

免疫组织化学技术

取材

将小鼠麻醉，打开胸腔充分暴露心脏，在心尖处剪一个小口，将注射器针头经小口送入左心室并插至升主动脉起始部，用线将针头固定，剪破右心耳，灌注50ml生理盐水。随后缓缓注入150ml 4%多聚甲醛（pH7.4），固定1h后将脑取出，浸于4%的多聚甲醛中放入4℃冰箱内固定12h，然后转入30%的蔗糖溶液中浸泡48h。

石蜡包埋

1.取出皮层及海马，流水冲洗24h，用梯度浓度的酒精进行脱水，酒精浓度梯度为70%酒精→80%酒精→90%酒精，各30min，95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ，各20min，100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ，各15min。

2.取出皮层及海马，浸入到二甲苯中透明，1h×2次。

3.取出皮层及海马，浸入到二甲苯与石蜡1:1混合液中，浸泡1小时。 4.取出皮层及海马，浸入到石蜡中，浸泡1小时×2次。 5.在石蜡包埋机上进行组织包埋，冷却后保存在4℃冰箱中备用。 切片

将组织用石蜡切片及进行切片，切片厚度为2μm。连续切片5次，取1张切片，水浴锅展片后贴附在多聚赖氨酸包被的载玻片上。每个组织取5张切片。所有切片在烤箱中60℃烤片2h。

脱蜡及水化(48min)

1.切片在二甲苯中脱蜡10min×2次。

2.切片在梯度浓度酒精中水化，酒精梯度浓度为100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ，各5min，90%酒精→80%酒精，各3min，70%酒精，2min。

3.最后蒸馏水中浸泡1min。 灭活内源性的过氧化物酶(40min) 1.用0.01M PBS冲洗3次，每次5min

2.滴加3%H2O2(先用现配)到切片上，孵育10分钟。 3.切片用0.01M PBS洗5分钟×3次。 抗原修复 (70min)

1.将事先配制好的抗原修复液在水浴锅中加热到95℃。

2.将切片浸入到0.01M的柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）修复液中，进行抗原修复15分钟。 3.修复后，取出切片，室温下冷却复温40分钟。 4.切片用0.01M PBS洗5分钟×3次。 膜打孔(25min)

1.滴加0.3% TritonX-100(曲拉通，现用现配)到组织片上，室温下孵育10分钟。 2.切片用0.01M PBS洗5分钟×3次。 封闭(20min)

1.滴加10% BSA至组织片，室温下孵育20分钟。 2.倾去BSA，勿洗。

免疫反应

1.滴加一抗至组织片上。用于DAB显色的组织片一抗 浓度为1:500，用于免疫荧光的组织片一抗浓度为1:2000。

2.组织片4℃孵育过夜。

3.第二天取出组织片，室温下复温1h。 4.组织片用0.01M PBS洗5min×3次。

5.滴加二抗，用于DAB显色的组织片滴加山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗，浓度为0.4:250；用于免疫荧光的组织片滴加山羊抗兔FITC标记的二抗，浓度为1:150。

6.滴加二抗后，酶标组织片室温下孵育一个小时，用0.01M PBS洗5分钟×3次，进行后续实验步骤。FITC标记组织片室温下孵育30分钟，缓冲甘油封片，镜检。

显色

滴加DAB显色液，光镜下显色，待颜色满意后，自来水冲洗终止显色，冲洗时间5min。 苏木素复染

组织片浸入苏木素染液染色2min，自来水冲洗1min，取出后1%盐酸酒精分化10s，自来水冲洗2min，氨水返蓝15s，双蒸水冲洗1min。

封片

将切片依次浸入70%、80%和90%的梯度酒精中各2min，随后浸入2次95%的酒精和2次无水乙醇中各3min。接着浸2次二甲苯，每次5min。最后用树胶封片。

普通：在载玻片组织上滴一滴封片液，然后使盖玻片倾斜，一侧先接触液体，缓慢盖在组织上，避免其产生气泡。

荧光：用荧光封片剂封片，不能滴太多，放盖玻片的时候避免气泡，尤其组织周围。然后用中性树胶滴盖玻片的四角，少滴。30min后放锡纸盒中，冰箱四度保存。

免疫组织化学配方

0.1M PBS：NaH2PO4·2H2O 15.5g，Na2HPO4·12H2O 6g，NaCl 87.75g，双蒸水溶解后调pH至7.2，用双蒸水定容至1L。

0.01M PBS：用双蒸水将0.1M PBS稀释10倍。

4%多聚甲醛磷酸缓冲液：40g多聚甲醛和500ml 0.1M PBS混匀后加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH至溶液清晰为止，冷却后用0.1M PBS定容至1000ml。

3%H2O2：30%H2O2 100μl与0.01M PBS 900μl混匀。现用现配。

Tris-EDTA抗原修复液：将Tris碱1.21g，EDTA 0.37g溶于双蒸水，调pH至9.0，加入吐温-20 500μl，双蒸水定容至1000ml。

10%BSA：10g BSA溶于100ml 0.01M PBS中。

0.3% Triton X-100曲拉通: Triton X-100 3μl同0.01M PBS 997μl混匀。现用现配。 盐酸酒精：1ml盐酸同99ml 75%的酒精混匀。

抗原修复液（柠檬酸钠缓冲液）（10mM柠檬酸钠，0.05%吐温20，PH6.0）的配方：柠檬酸钠（2H2O2）2.94g，双蒸水溶解，用1mol/L的盐酸调PH至6.0，加500μl吐温20，定容到1L，室温下可保存3个月。

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