实验八、蛋白质含量的测定

实验八、蛋白质含量的测定

教学目的要求： 基本知识点

?1、掌握凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

?2、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?3、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 ?4、掌数据处理和结果计算技术。

重点

?1、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?2、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 难点

凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。 课时教学方案： 复习与提问：

?1、检查实验准备情况，

?（1）实验内容；

?（2）实验仪器与试剂有哪些？

?（3）凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质程序。 ?2、凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理。 ?3、样品消化时应注意的事项。

?4、龙科－A型K氏定氮仪的工作原理与蒸馏操作方法。

实验八、蛋白质含量的测定

一、实验目的

1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、熟悉凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能； 3、熟练称量、溶液转移、滴定等基本操作技能。 二、实验原理

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2

及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。将消化液碱化、蒸馏，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定所生成的硼酸铵，根据消耗的盐酸标准溶液的量，计算出总氮量，反应式如下：

2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑

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∣ NH2

（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3

Kjeldah法测定蛋白质含量主要分三个步骤： （一）消化

样品中的有机物和含N有机化合物，经浓H2SO4加热消化，H2SO4使有机物脱水，炭化为碳；碳将H2SO4还原为SO2，而本身则变为CO2；SO2使N还原为NH3，而本身则氧化为SO3，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在反应中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3与H2SO4结合生成（NH4）2SO4留在消化液中。

蛋白质+H2SO4——→C C+H2SO4——→SO2+CO2↑ SO2+[N]——→NH3+SO3↑ NH3+H2SO4——→（NH4）2SO4

2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑ ∣ NH2

（二）碱化、蒸馏

（NH4）2SO4在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。 （NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O （三）吸收、滴定

蒸馏过程中所放出的NH3，可用一定量的标准硼酸溶液吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3 硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收氨的作用，所以采用之作吸收剂。

三、试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

1、硫酸(密度为1.8419g/L)2、硫酸钾3、硫酸铜(CuSO4?5H2O)

4、硼酸溶液(20g/L)

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5、氢氧化钠溶液(400g/L)。

6、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液(1g/L)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L)临用时混合。变色点pH=5.4，呈灰色；酸色为红紫色，碱色为绿色。

注:(婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定GB5410—1999)配制方法:甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L溴甲酚绿：1g/L甲基红为5：1的比例混合。

7、硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]或盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L]。

8、过氧化氢溶液：体积分数为30%。 9、乙戊醇 四、仪器设备 1、100mL凯氏烧瓶 2、龙科A—凯氏定氮仪 3、扭力天平 4、分析天平 5、5mL移液管 6、温度可以控制的电炉 7、小漏斗 8、酸式微量滴定管 9、150mL锥形瓶

结合实验想一想，以上列举试剂与仪器全面吗？

五、操作方法 (一)样品的制备

将样品全部移入约两倍于样品体积的洁净干燥容器中，立即盖紧容器，反复旋转振荡，使样品彻底混合均匀。

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(二)消化准备

称取0.20g～2.00g固体试样或2.00g～5.00g半固体试样或吸取10.00mL～25.00mL液体试样(约相当氮30mg～40mg)，用纸卷成筒状，小心无损地将试样移入100mL或500mL洗净、烘干、编号的凯氏烧瓶内，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL浓硫酸，加入2～3粒玻璃珠，在凯氏烧瓶的瓶口放一小漏斗。

注意：小心转移20mL浓硫酸，防止烧伤！ 【注】： 1、加入样品及试剂时，避免粘附在瓶颈上。你准备怎么处理？ 2、加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点（338℃），增进反应速度。 在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在360℃～410℃间，低于360℃，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于410℃则容易引氮的损失。而H2SO4的沸点仅为330℃，K2SO4沸点：400℃，10g硫酸钾将沸点提高至接近400℃，在消化过程中，随着H2SO4的不断分解，水分不断蒸发，K2SO4浓度逐渐升高，则沸点升高，加速对有机物的分解作用。但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在513℃会分解。 3、消化中若H2SO4消耗过多,则会影响盐的浓度,一般在凯氏瓶口插一小漏斗,以减少H2SO4的损失:

K2SO4+ H2SO4=2KHSO4 2KHSO4= K2SO4+H2O+SO3↑

4、消化中加入硫酸铜的作用：作催化剂，加速氧化作用加速。 3C+4CuSO4+2H2SO4→2Cu2SO4+4SO2↑+3CO2↑+2H2O Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2↑ 想一想1、试验中小漏斗有什么作用？ 2、加入玻珠的目的是什么？ 3、试样、硫酸钾、硫酸铜分别采用何种称量仪器？ （三）消化 将准备好的凯氏烧瓶以45°斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化,泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力,并保持瓶内液体微沸,（为加快消化速度,可分数次加入10mL30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）,经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时，继续消化0.5h～

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1h（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。然后取下并使之冷却。

提示：控制加热温度是关键！ 想一想： 1、为什么要必须将烧瓶冷却数分钟以后再加入H2O2？ 2、若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，还可采用什么方法将其冲下？ 3、实验中若出现大量泡沫将要冒出该如何处理？ （四）定容 将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20mL蒸馏水摇匀放冷，小心转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，加水至刻度线定容，静置至室温，混匀备用。同样条件下做一试剂空白试验。

注：在消化完全后，消化液应呈清澈透明的兰绿色或深绿色（铁多）,故CuSO4在消化中还起指示作用。

同时应注意,凯氏瓶内液体刚清澈时并不表示所有的N均已转化为氨,因此消化液仍要加热一段时间。 想一想：1、空白实验如何操作？ 2、如何保留玻珠在凯氏烧瓶中？ 3、为何要将凯氏烧瓶洗至中性？ （五）蒸馏 1、水蒸汽发生器的准备：按要求安装好定N装置，保证管路密闭不漏气。在水气发生瓶内装水至2/3处，加甲基橙指示剂3滴，及1mL～5mL硫酸，以保持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸使成为（NH4）2SO4形式固定下来，使蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热至沸腾。 想一想：调整水蒸汽发生器内水呈酸性的目的是什么？ 2、清洗凯氏定氮仪：打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸5min～10min，冲洗定N仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气口！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少量水，冲洗再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。

3、吸收液准备：在250mL锥形瓶中加入10mL(20g/L)硼酸溶液和1滴～3滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。

想一想：（1）20mL(20g/L)硼酸溶液需要准确吗？ （2）冷凝管下端不插入液面下可以吗？ 5 （3）硼酸吸收液过多过少有何影响？

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