生物工程专业英语课文翻译2.3

2.4 葡糖异生作用

当一个有机体利用C和C化合物进行生长，或者利用经过代谢过程能够生成C或C这种化合物的物质进行生长的时候，在丙酮酸的代谢水平或者低于该水平（例如脂肪烃、乙酸、乙醇或者乳酸），对有机体来说，就必须合成各种糖类以满足其代谢需求。这被称为葡糖异生作用。

尽管糖酵解途径中的大部分反应都是可逆的，但那些被丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶催化地反应则是不可逆的，对细胞来说，就要避开这种阻碍。

一般而言，磷酸烯醇式丙酮酸不能由丙酮酸形成，尽管在少数有机体内存在一种磷酸烯醇式丙酮酸合成酶可以催化这个反应。

通常，草酰乙酸作为磷酸烯醇式丙酮酸的前体物质。

这个反应由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化进行，它是葡糖异生作用中的关键酶。已经讲过草酰乙酸的生成，果糖二磷酸化酶的作用可避开磷酸果糖激酶的不可逆作用的性质（其作用产生1，6-二磷酸果糖）。

从这一点来看，通过终止糖酵解途径可积累己糖，通过磷酸戊糖循环又可生成C3和C4糖，葡萄糖不是葡糖异生作用的终产物， 然而6-磷酸葡萄糖被用来合成细胞壁组分，和各种细胞外物质及储备多糖。

2.5 好氧生物的能量代谢

在葡萄糖代谢和三羧酸循环中已经讲过，如何把各种代谢中间产物的氧化过程与辅因子（NAD+、NADP+、FAD+）还原为其还原型（NADH、NADPH、FADH）的还原反应过程联系起来的。这些产物的还原性是由一系列复杂的反应过程而是释放。这个反应过程最终与空气中氧气的还原相关。在这个反应过程中，由电子传递上的ATP或者2-3个具体位点上的无机磷而生成ATP，这取决于最初还原剂的性质。如图2.14，总反应式如下：。。。。。。。

每摩尔葡萄糖经过恩伯纳-迈耶霍夫途径所生成的ATP和丙酮酸经三羧酸循环产生的ATP总结于表2.1。

能够被生物利用的ATP形式的能量是在膜上产生的，可以是真核细胞的线粒体膜或者是细菌细胞的细胞质膜，其产生过程大致相同。具体差异根据个体差异而不同。电子传递链的主要成分是黄素蛋白，醌和细胞色素。细胞色素具有还原性（接受氢离子或者电子），经过氧化可以有效释放电子到下一个载体上。

每个载体都有不同的氧化-还原能，大约可以从NADH/NAD+反应的320摩尔到1/2O2/H2O终反应的800mV。在电子传递链上的特定位点，两个相邻电子载体的氧化-还原能差就已足够进行可逆反应：。。。。向合成ATP的方向进行。这个过程需要一种复杂的多亚基酶ATPase的协助。

有两种原理来说明ATPase是怎样作用的。在化学渗透学说中，过去二十年里米歇尔对其进行了发展，认为电子传递上的各组分是跨膜排列的，由于质子从一边向另一边移动，这样便产生了pH和电子浓度梯度。质子跨膜运动就推动了ATPase反应合成ATP。ATPase是定向作用的，质子只能从一边靠近催化位点，图2.15对这个概念进行了简单说明。

ATP合成的第二种解释为，电子传递链上的载体与假设的将要被活化的中间产物相互作用使ATP磷酸化。这种中间产物称为偶联因子。 两种理论个具有优缺点，都可以解释不成对氧化磷酸化作用产生的影响，如鱼藤酮、安必妥、抗霉素A等。它们可以阻止ATP的合成。

2.6 厌氧生物能量生成过程

在2.5部分中所说的ATP生成过程需要供应氧气。某些有机体则可以用磷酸盐，另一些则用硫酸盐或铁离子来代替氧气分子，而且如果在培养集中，这些物质被大量供应，那么有机体利用电子传递体在没有空气的条件下仍可以生成ATP，从而进行厌氧生长。如果没有合适的电子受体，或者（如大多数细菌）有机体缺少这类物质，那么一旦缺少氧气，有机体将不能以这样的方式合成ATP联系，才能获得ATP，这被称为底物水平磷酸化。这只发生在有限数量的反应中。反应自由能的变化必须能够进行ATP磷酸化反应。其中最为重要的反应归纳于表2.2。

这6种反应，其中后3种只对少数生物体来说是重要的。表2.2中其它的3个反应中，反应1与反应2涉及糖酵解的中间产物，涉及乙酰磷酸的反应3广泛存在于厌氧有机体中。乙酰磷酸由乙酰CoA与无机磷反应而合成，它还是被磷酸酮醇酶作用的。

乙酰CoA可以由乙酰乙酰CoA 降解而生成，或者由丙酮酸经3种反应中的一种而生成：丙酮酸脱氢酶反应，丙酮酸甲酸裂解酶反应，铁氧还蛋白氧化

还原酶反应，该反应与丙酮酸脱氢酶反应产生同样的产物，但是用到了一种铁硫蛋白，铁氧还蛋白不是NAD+作为还原剂（还原型铁氧还蛋白被氢化酶还原为铁氧蛋白，释放出氢气）这三种酶中，后两种对氧敏感，当含有它们的有机体被暴露于空气中的时候，它们便会迅速失活。

越来越多的证据表明，电子传递磷酸化同样可以进行延胡羧酸还原酶的反应。这种酶对于某些产甲烷菌，还原硫酸盐的有机体及进行氢气与二氧化碳发酵的氢化菌来说大概是重要的。反应：。。。。。，氢原子可以由各种辅因子提供，包括NADPH，而某些有机体如大肠杆菌、其氢原子的生成经过了电子传递链，即使与好氧有机体中的电子传递链不同，但也至少是类似的。因此，尽管没有氧气，有机体仍通过偶联不同的反应从而生成ATP。

所有的厌氧有机体都面临两个问题：第一，在氧化磷酸化作用中，缺少将NADH或NADPH的再氧化与ATP的生成相联系。每摩尔底物所生成的ATP量比好氧代谢产生的少。第二，不能将NADH的氧化与氧气的还原相联系，这样如何进行这个重要的反应就成为一个问题，当所有的NAD+不可逆的转化为NADH，代谢过程也就很快被停止。 厌氧生物采用很多方法使还原型辅因子重新被氧化。其中的核心部分为：。。。

这里，由AH2 A这步是厌氧生物利用底物时所采用的途径中的一部分。通常，底物B是补充还原反应所必需的，也直接来源于底物；BH2一旦形成，以来，厌氧生物必须积累还原型代谢产物从而能够进行任何底物的降解过程。而且，就像已经说明的那样，既然厌氧生物从降解底物后获得极少的ATP，那么还原型代谢产物的积累与合成的细胞物质必将有极大的联系。以这种方式进行的厌氧代谢将在后面内容中讲述。

2.7 厌氧代谢

选择底物来氧化还原剂，例如NADH、NADPH、FADH2是非常普遍的现象，同时产生相应的各种终产物，因此对厌氧代谢途径的描述也就是个体将积累何种终产物的描述。这些终产物例如乙醇有着很高的商业价值。即使是在厌氧条件下，葡萄糖仍是生成丙酮酸，但是只有小部分丙酮酸进入三羧酸循环从而生

成用来合成主要的细胞物质的中间体。三羧酸循环反应只提供这些中间体而不生成能量，通常，三羧酸循环不会完全发挥作用，尤其是α-酮戊二酸脱氢酶不作用，因此，这个循环成为一个铁蹄形，其中草酰乙酸转化为琥珀酸，而柠檬酸转化为α-酮戊二酸。

2.7.1发酵产酒精

在酿酒酵母这样的酵母菌中，氧化剂是缩醛；从葡萄糖转化的丙酮酸大部分转化为酒精。（反应式）

1摩尔葡萄糖可生成2摩尔丙酮酸；产生的酒精可以重新氧化在磷酸丙糖脱氢酶反应过程中生成的NADH，总的化学计量如下式：

ATP为酵母细胞的生长提供能量，但是由表2.1中比较得知，每摩尔葡萄糖在好氧条件下转化的量少于5%。

葡萄糖通过磷酸戊糖途经主要的代谢产物为必需的C5和C4糖，经过这个过程摩尔葡萄糖仅能生成1摩尔的丙酮酸，同时产生2摩尔NADPH和1摩尔NADH。这些附属的还原性物质必须与其它反应相连从而被重新氧化。

这些反应中最重要的反应过程是脂肪酸的形成，它们是化学合成的还原性化合物，其合成过程需要大量的相应的还原性物质。

某些细菌也可进行生产酒精，通常还伴有其他终产物的生成，某些霉菌也能生产酒精，而且厌氧条件一般对生产最大量的酒精来说是必需的。如果产酒精的有机体可以像酿酒酵母那样进行好氧生长，那么一旦通入氧气，积累的酒精就常常被细胞吸收并以醋酸的形式作为生长底物而被利用。

2.7.2 乳酸发酵

发酵产乳酸的过程是仅次于酒精发酵的过程，对于食品工业均具有重要的历史意义。

除乳酸外，杂发酵乳酸菌生产各种还原性化合物，而且没有主要的糖酵酶-醛缩酶；而使用磷酸酮醇酶，它是生成乙酰磷酸的酶。在厌氧条件下，乙酰磷酸经过生成ATP的过程而转化为酒精和乙酸，酒精重新生产NAD+。磷酸酮醇酶的另一个反应产物是3-磷酸甘油，其通过普遍的糖酵解系列反应转化为丙酮酸，然后经过乳酸脱氢酶的作用转化为乳酸。

单纯乳酸菌也进行这样的反应过程；这类有机体没有磷酸酮醇酶，结果乳

酸是位的终产物。某些乳酸杆菌生产D-乳酸，其他的则生产L-乳酸，而另一些乳酸杆菌则生产两种乳酸的混合物，主要是乳酸脱氢酶的不同。

2.7.3 丙酸发酵

丙酸菌，例如在格鲁–耶尔奶酪中发现，经过一系列以甲基丙二酰CoA为中间产物的反应，可将丙酮酸转化为丙酸。在特殊的转羧化反应中，被用作丙酸的直接来源。

甲基丙二酰CoA经过内部转羧化作用，由琥珀酸CoA形成，可由草酰乙酸重新生成（经苹果酸、延胡羧酸和琥珀酸），同时2摩尔NADH被氧化NAD+。在某些羧状芽孢杆菌中，丙酸可由丙酮酸经乳酸和丙烯酸直接生成；这个转化过程又将2摩尔NADH重新氧化。

2.7.4 丁二醇发酵

。。。。。。。。。。2摩尔丙酮酸经过浓缩最终生成2，2-丁二醇， 只有最后一步反应与NADH的氧化相联系，因此，1摩尔丙酮酸只生成0.5摩尔NAD+，这些有机体也可将丙酮酸转化为其他产物包括乳酸和甲酸。

2.7.5 甲酸发酵

在不同的细菌体内，丙酮酸部分转化为乳酸，部分转化为乙酰CoA+甲酸。后一种反应被称为磷酸裂解反应，甲酸能够少量积累但常常被甲酸水解酶转化为CO2+H2。这种从丙酮酸到乙酰CoA的途径，其优点是它不生成NADH从而避免了必需的再氧化过程。乙酰CoA经过醛脱氢酶作用转化为乙醛。

将乙醛还原为乙醇的过程通过进一步的NADH来完成。注意这种生成酒精的过程与酵母产酒精过程是不同的。

2.7.6 丁酸发酵

历史上，丁酸、丙酮和propan-2-ol的生产过程是最古老的精细发酵过程，i.e.从利用已知单菌株进行的发酵过程规律发展而来。这类葡萄糖代谢的终产物经过图2.17的代谢流程，由羧状芽孢杆菌进行生产。

有一些不同的是，某些羧状芽孢杆菌生产丁酸、乙酸、CO2和H2；而另一些则主要生产丙酮而不是propan-2-ol，由于所选用的物种和菌株以及培养条件的不同，终产物所占的比例也就发生变化。

2.7.7 miscellaneous

2.8 生物合成与生长

微生物细胞可以利用简单的营养物进行自身的繁殖，生物细胞用以完成这个过程所利用的途径数目是巨大的。一个细菌细胞可能包含有100多种酶，而真核生物细胞含有的酶的种类大约为细菌中的2倍。细胞中所有的大分子物质是由100多种单体而组成的（蛋白质、核酸、多糖等）。图2.18总结概括了这些单体物质生物合成途径（氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、糖等）。这些生物合成途径是相互联系的，都依赖于有足够量的必要的中间体。然而，我们无法说明这些途径的特点，关于它们研究普通生物学的部分，这方面的参考书也较多。因此，由于特定的代谢途径与具体的发酵过程相联系，我们将在合适的章节中进行讲述。

由于细胞所进行的代谢活动是以平衡方式进行的，因此所产生的终产物不会过量也不会不足，这种过量与不足都是不利的。为生物细胞必须能够对周围环境的变化做出调整，同时也要充分利用供给的氨基酸、嘌呤和嘧啶。这是自然习惯常会发生的情况，也是一个复杂的营养物作为生长底物被利用的场所。这些营养物含有大量的含碳化合物，因此，细胞可以通过停止合成已经足量的物质来保存碳和能量，而且通过停止合成多余的酶进一步实现节约，因此就有了两种完全不同的作用方式——酶活性的调控和酶合成的调控，通过这两种方法，细胞就能够调控各种化合物的合成过程。相同的调控机制也用来对合成过程进行平衡，甚至在没有天然物质供给的情况下。这种控制机制在这个部分讲述。

2.8.1 控制机制

2.8.1.1营养物的吸收

细胞代谢控制从细胞吸收营养物的调控开始。大部分营养物，除了氧气与极少数含碳化合物以外，都是通过特定的传递机制而被吸收的，因此，这些营养物在细胞外的稀释液在细胞中得到浓缩，这种“主动传递”过程需要能量供应。这个过程是可以控制的，一旦吸收到细胞内的营养物的含量达到了所需要的浓度，就会停止后面营养物的摄入。

2.8.1.2 区分

第二种形式的代谢控制是利用细胞间隔或是细胞器以实现对代谢产物库的

分隔，最明显的例子是真核细胞的线粒体把三羧酸循环反应与细胞质中的反应分隔开来。另一个例子是，过氧化物酶体，它包含降解脂肪酸所有的酶。然而同时有些相似的酶可催化并合成脂肪酸。其他细胞器相类似的控制细胞中的其他反应（液泡、细胞核、叶绿体等）。

2.8.1..3 酶合成控制 细胞中的许多酶作为细胞的基本组成部分而存在，处于生长条件下。其他酶则在需要的时候“出现”，例如乙醛酸途径中的异柠檬酸裂解酶是在当细胞在C2底物上生长的时候才出现的，这被称为酶的诱导合成。相反的，当不再需要它们的时候，就会“消失”，例如，如果已经有足够的组氨酸满足细胞的生长需要，那么于组氨酸合成的酶就不再被合成，这被称为阻遏；如果化合物的供应一旦消失，进行物质合成的酶又将会重新出现，其合成过程称为去阻遏。

为了理解这样的控制是如何作用的，就有必要概述一下蛋白质的合成过程。 蛋白质（包括所有的酶）通过核糖体组织的酶复合物和RNA系列添加氨基酸而合成（图2.19）。确保氨基酸的正确顺序的密码位于信使RNA上，而信使RNA是DNA的一个片断进行复制而在细胞染色体内合成的。这个过程由依赖DNA的RNA多聚酶催化，被称为转录。众所周知，染色体是由DNA双螺旋按照精确排序的碱基组成的：腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）。DNA的两条链只是通过相邻碱基间的氢键相连接。由于A总是与T配对，而C总是与G配对，那么从一条单链就可生成一条新的DNA链，这条单链与最初原来的那条链互补。DNA以这样的方式进行复制，从而保留遗传信息或者密码；信使RNA也是来自于DNA的一条单链。除过用尿嘧啶代替胸腺嘧啶，RNA互补于DNA而且其自身的碱基同样携带者遗传密码。尽管许多mRNA读取整条DNA链，但是每个mRNA只是DNA链上的一小部分。

核糖体附着于mRNA上，而且在核糖体中，mRNA上的碱基每次被读取3个，转译为特定的氨基酸密码。这个密码称为密码子。例如，密码子UCA就至代表着丝氨酸而CAG代表谷氨酸；因此，当黏附于核糖体的mRNA遇到 UCACAG那么就会生成丝-谷氨酸。以共价键连接在特殊转移RNA（tRNA）上的每个氨基酸都可识别mRNA上与其相对应的3个碱基。氨酰- tRNA是反应单元，它被核糖体利用从而合成不断增长的肽链。

每个单一的mRNA分子编码一个蛋白质，它来源于染色体上的一个基因（某些功能酶由不只一个蛋白质构成，例如丙酮酸脱氢酶）。每个基因都可以被多次转录，染色体中就不是仅有这个基因的一个拷贝，从而遗传信息就被扩大了。

经过整个转录与转译过程，合成了蛋白质，对于这个过程的调控是非常复杂的。原核生物与真核生物尤其是在具体的细节上是不同的，而且很多方面还无法解释。尽管如此，细菌系统中的调控机制是可以说明的。

由DNA生成mRNA的过程是由染色体上编码诱导蛋白或者阻遏蛋白的那部分控制的。这种机制如图2.20所示。DNA上被称为调节基因的部分生成调控阻遏蛋白，它的作用是结合到另一个通常是相邻的基因上。将这个蛋白结合到操作基因上就阻止了一段基因的转录过程。这段基因是一个或多个结构基因，它负责编码酶蛋白的mRNA的合成。如果有诱导物存在，诱导物结合到调控蛋白上，从而阻止了调控蛋白结合到操纵基因上，自由的操纵基因就允许结构基因进行转录而合成相应的蛋白质。这就是如何将一个新的代谢途径引进到操作中。只要有诱导分子的存在，那么酶的和成就一直进行，如果除去诱导物，或者诱导物被消耗完（常常是它诱导的代谢途径），那么酶将停止合成。

当某个分子常常是代谢终产物与阻遏蛋白作用生成一种封锁操纵基因产物的时候，酶合成阻遏就会发生。如果这个产物被除去或者消耗完，那么阻遏蛋白将不再结合到操纵基因上，结构基因开始转录，同时终产物又重新开始合成。

2.8.1.4 分解代谢阻遏

这种代谢调控是对已建立的酶的诱导与阻遏调控的这种想法的延伸，通过向微生物培养液中添加外来营养物来实现。分解代谢阻遏这个术语涉及许多普遍的现象，来看这个例子，当一个微生物可从同时提供给它的一种或多种碳源中进行选择的话，它们则选择利用其偏好的那种底物。例如，如果给一个微生物同时供给葡萄糖和乳糖，则乳糖被忽略直到所有的葡萄糖被消耗完。若供应多种可利用的氮源，那么会出现项类似的情况。对细胞来说，分解代谢物阻遏的优点在于能够以最少的能量消耗对其进行利用。

分解代谢物阻遏的具体机制以生物体发生较大的变化。图2.21所示的一系列事件是大肠杆菌中发生的分解代谢物阻遏过程。对这个过程来讲，最关键的是化合物环化腺苷酸（cAMP，它的磷酸基团连接在核糖部分的3’和5’-羟基上，

从而形成磷酯）。cAMP，经腺苷酸环化酶作用由ATP生成，它与特定的受体蛋白作用（CRP=环化腺苷酸受体蛋白），其正向促进一个操纵子的转录。磷酸二酯酶将cAMP转化为AMP，cAMP的水平与2.2内容中提及的“能荷”紧密相关。葡萄糖代谢的各种产物看上去都是腺苷酸环化酶的强抑制剂[参考2.8.1.5（b）]，只要这些物质存在于细胞中（暗示有连续的可利用的葡萄糖存在），那么基于cAMP- CRP复合物控制的某些操纵子的转录将无法进行。分解代谢阻遏对控制厌氧代谢方式有重要影响，尤其在“次级代谢生物合成”现象中。

2.8.1.5 一旦酶被合成，它的活性就可以通过很多手段进行修饰。

（a） 转录后修饰

某些酶的存在是有活性的或者低活性的形式，这通过与特定基团的

共价吸附作用来相互转化（常常是磷酸，有时是AMP或者UMP）。这种吸附作用由一种单独酶作用，它没有其它的功能，其活性反过来由各种代谢产物来调控。被第一个酶催化的反应可通过细胞的主要代谢状况来调节（如图2.22）。进行这种代谢的例子有大肠杆菌中的谷氨酸合成酶（谷氨酸合成酶对细胞精细调节主要代谢中间产物谷氨酸与谷氨酰胺的库容量来说是非常重要的，它们分别是酶的底物和产物。）和粗糙脓胞杆菌中的糖原磷酸化酶。

（b） 效应物作用

酶的作用常常由于其所催化反应所生成底物的累积而减慢，这个化

合物就被称为抑制剂或者酶的效应物。这个机制理解起来比较简单：反应物阻止底物靠近酶活性位点，在这个位点上，两者必须是合适的。然而，许多酶尤其是代谢途径最开始进行时的那些酶，对于与它们所催化反应无关的化合物是敏感的。最为普遍的作用就是反馈抑制。在这个作用中，代谢终产物是途径中早期的酶的活性的负效应物。这种抑制作用确保一旦有大量的终产物生成，那么含碳物质单元则不会再按照该途径进行代谢。当培养基中有终产物存在时，它被摄入到细胞中， 此时同样出现这种抑制作用。

反馈抑制与酶合成阻遏有相同的作用，也是因为过量终产物的存在

而发生。它可被看作是良好的控制，可以快速进行并容易逆转，而酶的阻遏提供串联控制，需要较长的时间来完成。

反馈抑制的一般机制是基于效应物与酶在某位点相结合，该位点不

同于酶的活性位点；效应物改造了蛋白质的形态，故酶对底物反应过程就不再是一个有效的催化剂。认为这种酶是变构控制的，可见于许多合成氨基酸、嘌呤、嘧啶和其它单体物质的代谢途径中。

这个过程会变得相当的复杂，当从共同途径的支链生成了不只一种

产物的时候。

这里重要的是，如果三种终产物F、G或者J中的一个达到了他的最

高库容量，就必须阻止它的更多生成，但同时又要继续进行其他两种产物的合成。因此，在上面的图中，假设这三种终产物所需要的量是相等的，产物F则完全阻止反应f，反应c的50%和反应a的33%。因此，从A开始，先是B而后以2/3速率生成C，C不是生成2倍于H的D，而是生成等量的这两种物质，所有的D将转化为G，H仍如以往一样生成J。

这种对酶活性部分抑制的方式，根据途径与有机体不同而不同，生

物体所共同采用的一种常用的方法是同工酶。那就是，对于上面的反应a，有三种各不相同的酶以相同的效率催化该反应，尽管一个同工酶对于产物F的反馈抑制作用是敏感的，第二个是对G敏感，第三个则是对H敏感。这样，仅有一个同工酶被抑制，如果一种终产物达到最大库浓度。反应C也类似的由两种同工酶催化，一个受F的反馈抑制，另一个则受G的反馈抑制。

这类控制作用的例子发生在芳香环氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸的生

物合成途径中以及苏氨酸、甲硫氨酸与赖氨酸的生物合成过程中。

反馈抑制作用同时涉及了转运过程的控制。但是，将这个概念用到

以下情况中是不准确的，这时代谢产物如ATP、ADP、AMP、NAD(P)+或NAD(P)H是某个特定的酶的正效应物或负效应物。例如，三羧酸循环中的某些酶特别是柠檬酸合成酶被ATP所抑制，同时由于ATP是与循环反应相关的氧化磷酸化反应的终产物，这个应该被解释为一种较间接形

式的反馈抑制。

不考虑语义，这种通过不同形式或者辅因子进行的控制广泛作用于

主要的代谢过程中的酶。

2.8.1.6 酶的降解

酶不是一种稳定的分子，能被迅速的破坏而且这个过程是不可逆的。正常的半衰期变化较大，短的只有几分钟，长的则可以是数天。尽管可以从基因水平对酶的合成进行调控，但是一旦酶被合成，就可以在某时间内保持其功能。如果周围环境突然发生改变，就无法满足酶的合成的关闭，例如阻遏；细胞需要使酶失活以避免无用的甚至可能是有害的代谢活动。已知的某些例子有，激活的蛋白水解酶将破坏某个特定的酶。激活过程可能由主要代谢产物的出现和缺乏而引发。

2.8.2 同步代谢与生长

我们已经知道了细胞是怎样控制它们的许多组分的生物合成从而合成适量单体与不同的酶分子，这种控制机制受细胞周围环境的影响，细胞总是试图优化内在的生化过程以便更有效的利用预先生成的含碳和含氮化合物，同时产生最大的能量，消耗最少的能量，并以最快的速度进行生长。

在限定的环境条件下，如果没有任何一种氮源，那么有机体就不能生长，在这种条件下，当有机体继续对可利用的碳源进行生长代谢时，终产物将被累积。有机体生物合成过程必须要不停的运作，只有当生物体死亡，这时细胞的反应过程才能达到平衡。

因此，有机体保持其生化机能进行不停的运作是关键的，它们通过许多方法来达到这个目的，这些方法依赖于有机体所处的主要状态：通过阻遏新的厌氧代谢酶，有机体将含碳底物进行任意一种次级代谢；可产生大量的储备化合物如多聚-β-羟基丁酸、脂肪、糖原和其它多糖。如果处于“饥饿”状态，没有外来碳源供应，有机体便将降解这些储备物质，与细胞维持代谢途径相比，生成什么产物来说就显得不那么重要了。

在正常的情况下，如果所有的必需养分都能供应，则微生物就能生长。 在分批式培养中，细胞在关闭的系统中繁殖（一旦培养开始，就不会添减发酵罐中的物质），直到某些养分被耗尽或积累的某些产物抑制了有机体的生

长，或者细胞的数量达到了不能再有任何空间容纳新生细胞的水平，这个时候，细胞增值才会停止。在细胞生长过程中，各种化合物的相对含量发生变化，由于细胞在核糖体中合成越来越多的蛋白质，RNA的量就会迅速增高，而如图2.23所示，DNA的量就会减少，尽管减少的程度取决于细胞进行DNA复制的速率。

细胞生长速率以倍增时间（td）表示细胞从一个变为2个所需要的时间，以及比生长速率（μ）表示单位重量的已有细胞物质合成新物质的速率。这两个量按下式关联：。。。。。。。。

在分批式培养中，由于营养物质含量的持续下降，μ值一直是变化的；在好氧有机体的许多实际情况中，氧气供应的速率最终控制它们生长的速率。只有在连续培养中，通过不断地加入新鲜养分，具体生长速率才会保持恒定。一个生物能够获得最大生长速率是由谁来控制的依不同生物而异，而且对大部分有机体来说都不得而知。可能是DNA合成的最终速度，或者是细胞吸收某一特定养分的速度，或者是细胞的某部分如细胞壁的装配速度。倍增时间可以从Behakea natriegens的10分钟到酵母菌与真菌的几小时，大部分细菌的倍增时间为30分钟或更长，而某些则需要几天。表2.3例出了例子。

2.8.3 细胞周期与DNA复制

细胞分裂过程在原核与真核生物中是不同的，尽管它们采用相似的机制来控制基因的表达和调控基因产物（酶蛋白）的活性。在一个快速增长的细胞中，DNA合成或多或少的是连续进行的，但在一个真核细胞中，它只在部分细胞周期中形成。细菌的基因是双螺旋结构中的2分子DNA。它们头尾相连形成环状染色体，真核生物细胞含有多条独立的染色体。

在真核生物细胞中，细胞周期可分为几个阶段，每段持续的时间取决于生长条件。随着所有染色体的复制，周期达到最高潮，然后通过有丝分裂两套染色体在母细胞和子细胞之间分配。当生物体进化到更高级的微生物领域将进行有性生殖而不是细菌体的简单的二次分裂或者是酵母的芽殖，这时有丝分裂过程将变得更为复杂。染色体分配的过程将通过减数分裂来进行，经过DNA的复制，染色体将分配到生殖细胞中。

在所有的微生物中，DNA都以相似的机制进行复制，双链DNA解旋，每条链形成互补新链，这个过程如图2.24所示。每个复制叉作双向运动，也就是

说，解链与互补新链的合成发生在同一个分离末端。

在细菌中，同一时刻有多个复制叉发挥作用，所以基因可以极快的速度进行复制。当DNA完全复制的时间比细胞分裂的时间长的时候，这个情况就会发生，而且在这样的条件下，每个细胞将含有多个染色体上被复制的部分的拷贝。这样使细胞分裂与染色体的完全复制同步进行，以使每个配体细胞在分裂隔膜形成前就获得自身的DNA。显然，当DNA复制过程完成时，一种“终端蛋白”被合成，就是这个蛋白引发隔膜的形成和细胞分裂。

真核细胞中，细胞成倍复制过程被复杂化，在细胞周期过程中，细胞器要进行分裂，线粒体和叶绿体有自身的DNA并各自独立的分裂为细胞核子，这样，根据周围环境条件，线粒体与叶绿体的数量就会发生变化。例如，在厌氧条件下生长的酵母，不依赖线粒体提供ATP从而线粒体的数量就比较少。

尽管载有遗传信息的DNA能够精确复制从而使子细胞带有与它们父母相同的染色体图谱，但仍会出现错误。这样的错误导致突变体的形成，突变体可自发的生成，通常以很低的频率（大约每108-1010细胞分裂中有一个突变体），或者被诱导生成，通过将生物体暴露于DNA突变剂中。具有可变化的酶功能的突变体在发酵过程中对于提高产量来说是很有益的，尽管这样 ，从成千上万个不需要的突变体中寻找我们想要的那个突变体是一个漫长的过程。 在大多数情况下，突变体不能进行某些活动；许多情况下，这种作用将是致死性的从而细胞就不能生长。一般很少数量的突变体能够存活下来 ，但由于在实验中应用了大量的微生物，因此0.001%的存活就代表着10000个生物。

2.8.4 微生物生长速率

微生物生长的速率常常以每消耗单位重量的底物所生成的细胞数量的形式来表示。摩尔生长率是细胞量（干重）与每摩尔底物的比值，而碳转化系数是细胞量与每克含碳底物的比值，这个对于不同分子大小的底物之间的比较更有意义。表2.4列举了这两种表达方式的一些典型数据，都是最大值，因为在某些特定情况下（尤其是处于低生长率情况下），用于细胞生长的底物的利用是不完全的。

表2.4显示了一个典型特点，参考前面的讨论是很容易理解的，即当兼性有机体从好氧状态转为厌氧状态时，生长率降低，这个现象明显的与厌氧过程中

能量降低的流向和ATP产量的减少相关。

经验上，实际的生长率取决于很多因素：

（1） 碳源的性质

（2） 底物分解代谢途径

（3） 任何复杂底物的供应（排除某些合成途径）

（4） 同化其他养分的能量需求，特别是氮（如果供应的是氨基酸，那么它比

利用NH3所需要的能量少，而比以氮作为氮源所需要的能量多）。

（5） ATP生成反应的速率

（6） 抑制剂，不利离子的平衡，或者其他培养基组分，需要转运体系的参与。

（7） 生物体的生理状态；几乎所有的微生物都是根据外界环境来改变它们的发展，常常是大量的而且不同的发展过程必须要保持不同质量与能量的平衡。

在连续培养系统中 ，细胞的生长速度和营养状态时可以进行控制的，进一步的影响因素有：

（8） 限制性底物的性质；限制性碳源比限制性氮源的生长效率高；在这个过

程中，对过量含碳底物的分解代谢将进入耗能代谢途径。

（9） 所允许的生长速率 作为最终控制微生物活动各个方面的因素，必须要补充：

（10） 微生物的倾向与微生物学家的能力

第一章 应用遗传学

生物工程发展的第一步通常是寻找合适的有机体。这种有机体期望能够创造一种产品或者服务从而给其工业带来商业回报。实际中，遗传学家必须选择一个有机体，这个有机体能够生产出想要的产品。一旦找到合适的有机体，在可能发生诱导遗传变化的地方利用传统育种和诱变方法就可以生产出更多的想要的产品。对改造过的有机体的选择工作是乏味而耗时的，并且直到最近遗传学家能够采用的大部分方法都还涉及试验和错误。然而，新的基因技术，例如原生质体融合和重组DNA技术的使用使得通过采用新方法就能将有用的遗传特征直接插入到所选择的有机体中。这样，就能够设计建造出完全新的性能

（capabilities），而且尤其是微生物以及小部分植物和动物细胞就超越了它们天生所赋予的遗传能力而生产物质。 当应用遗传学家对一个潜在的工业有机体进行操作的时候，生产能力的提高并不是唯一的目标。因此，对病毒的防御能力和提高的遗传稳定性可以被引入到有机体内，从而缺少它们，就能减少或消除有害的副产品的形成并且可以除去令人不快的味道、颜色或者粘质物。 一个成功的工业化培养物应该最终具有大部分或者全部下列特点：这个培养必须是纯培养物，遗传稳定；容易繁殖；具有快速生长的特点；具有良好的产品形成速度；不产生有毒的副产品；并且能够行基因操作。

工业上所用的培养物通常有三种应用：（1）作为一种研究培养物——对它进行研究已寻找一种有用的产品；（2）作为一种发展培养物——一个研究培养物获得了重要性；和（3）作为一种生产培养物——一个研究培养物现在实际上用来进行工业化生产。 它的代谢功能远超过野生型的代谢功能。这个只能通过在生产过程中对有机体的生长进行最大的控制得以实现。从一个野生型发展到工业有机体需要改变它的遗传信息，消除不要的特点或者甚至是引入整个新的遗传信息。

寻找所要的有机体并且提高它的性能（capabilities）是目前大部分生物工程过程的最基本的方面（图3.1菌株改造流程图）

3.1 选择与筛选

在生物技术的所有方面中，最主要的精力都用在了筛选程序（progaramme）上, 以通过突变或者杂交程序（progaramme）包括遗传设计的途径，从天然资源或者已经建立的培养物中生产出新的有机体。这些有机体必须经过筛选来获得有用的产品并且可以进行足够大规模的生长以生产和提取所期望的产品，然后对这个产品进行鉴定评估（evaluation）。筛选可以定义为利用高效选择程序从庞大的微生物与代谢物中只检测和分离那些有益的微生物与代谢产物。对分离物进一步的改进包括对培养物的改造与保存。然而，对充分利用这个能力来说最大的障碍是适宜的筛选程序的可行性，这个筛选程序能鉴别所必需的产物，

尤其在存在培养基组分的情况下。

现在生物工程中利用的主要的生物群体是微生物。所述的筛选方法也主要集中于这类群体。

在从环境中为生物工程寻找新的微生物的过程中，一般有三种可行性的选择；它们包括取样点的选择，分离出想要的微生物的物理分离过程以及实现选择的方法的选用，这个过程大多数情况下要进行富集培养（表3.1生产微生物的创造）。 尽管许多新的生产微生物是野生型而且已经从自然环境中分离出来，但是通过实验操作从现存的基因组制造新的基因组同样花费了大部分的精力。通过突变、重组、转化、转导和基因克隆的单一处理过程或者联合处理过程可以对有机体进行改造（表3.1生产微生物的创造）。。

通过自然选择，尤其更多的是基因操作，所有工业重要的微生物都将经过某些形式的筛选。筛选程序的设计对实现最大程度的认知新基因性来说是很重要的。筛选可分为两个基本形式：

（1） 无选择的随机筛选 对所有分离物进行单独检测，以获得所要的性质

（2） 比率筛选 在这个过程中，会进行某些方面的预筛选。

随机筛选将是非常耗时的，因为每个分离物都要进行仔细的研究。在抗生素生产的研究中，成千上万的摇瓶培养的单一孢子分离物进行有规律的使用。Agar 技术加快了这个过程，但这个方法最好是用作在使用摇瓶之前作为一种最初的筛选。大量的分离物或者突变体现在就可以平铺开来，暴露于广泛的环境条件下，同时任意时间段的反应就可以通过电视监控或者计算机控制而被自动记录下来。 相反的，比率筛选更多的是利用了特定产物形成的生物化学知识，建立一个选择过程，这个过程利用了所要的基因型的一个特点，这个特点不是特定的有益的那一个，但必须是很容易进行评价scored或者assayed化验。比率筛选应该有选择的杀死所有不需要的基因型从而允许routinely检测更多的分离物。因此，最近已表明in Cephalosporium acremonium抗生素的生产与蛋白水解活性 当筛选过程完成以及有潜在价值的微生物分离后，效率的最终证明来自生

产条件。从新的或者现存的微生物进行产品的优化也涉及到最佳培养条件的选择，固体或者液体、分批或者连续发酵。繁殖微生物的培养基类型对于形成产物的表型表达有着重要的影响。因此，培养基的组成能够影响生物体的浓度、形成产物的特定速率specific rate、产物形成的持续时间、产物的降解速率及生产微生物（生产菌）的稳定性。然而，生产环境是不稳定的，成功的生产也需要对培养基和环境控制参数进行改造。

菌种的退化是生物工程中普遍遇到的一个问题。稳定性是由基因控制的，可以通过环境因素的特定控制进行改变，比如改变培养基或者通过阻止导致不稳定的遗传事件的发生。

3.2 菌种保藏

通过自然选择或者基因操作产生一个新的微生物，这个新的有机体就必须进行储藏或者保藏以使遗传性能发生最小的退化。有机体的保藏、制备和繁殖必须达到一定标准的重复性。一个工业微生物的保藏过程生物工程基础结构的整体特征。所有的工业没有一个共同的方法。特定的工业微生物保藏技术作为商业机密而被很好的保守。实际上，大部分工业微生物通过下列的程序被保存的：

（1） 在琼脂培养基上进行规律性接种；

（2） 利用还原性代谢产物——矿物油的覆盖、冷藏或者冷冻储存；

（3） 干燥——干燥的沙子、硅胶或者滤纸；

（4） 冷冻干燥——由于与前面方法相比更加方便而且稳定性高所以被广

泛采用；

（5） 在超低温下冰冻保存（-70―-196℃——是一个高成本的方法但是适

用范围广而且存活率高）。 在全世界范围内，菌种收集对于生物工程大范围的纯种微生物的供应正扮演着越来越重要的角色，这些微生物有着过去、现在或者潜在的价值。重要的操作菌株必须处于可进行繁殖与生产的条件下。尤其是，很多新的基因操作有机体都有不同程度的不稳定性而且保藏必须以获得最小的菌种漂移为目标。

这章余下的内容将较具体的讲述目前应用遗传学家可用的对工业重要有机体进行改造的各种各样的技术。

3.3 诱变作用

一旦一个有用的有机体经过最初的筛选被分离出来，那么对提高生产力的一些选择条件就可以使用了，包括对培养基和发酵条件的改变，诱变（自然发生或者是诱导发生）和杂交。既然诱变是所有遗传变化的根本来源，那么它就成为了在工业微生物学中有着根本重要性的一个话题。而且，这些工业中使用的很多重要的微生物没有正常的性特征，因此不易进行杂交。基于这个原因，各种各样的诱变技术就被大量采用以生产许多目前在使用的生产菌株。对于很多工业化过程，诱变程序确实代表着提高生产力所主要采用的方法。诱变剂—诱导提高生产力或者滴度的方法长期以来都在使用，青霉素、Cephalosporuim 和Streptomyces的抗生素生产，有机酸生产与用Aspergillus species 生产酶，用各种菌种生产氨基酸以及其他大量的工业微生物。诱变作用还无法被更新的基因工程技术所代替。

现在已经认识到，提高一个发酵产物产量最有效的方法是利用诱导突变和其后对改变菌株的筛选。最困难的是突变发生的频率低而且还必须从庞大的没有突变的菌株中进行选择。

有许多关于经重要突变所生产的改造工业菌株生产出更有效验的产品的例子。四环素的生产菌株Streptomyces在这方面尤为重要。发现S.aureofaciens 的突变株S-604可以合成6-demethyltetracycline脱甲基四环素，而不是由亲代生产菌株合成的。这个突变现在是一个重要的商业化程序。

尽管如此，很少的突变能够成为改造菌株的主要方法。这种突变通常对形成产物带来小的改变（5%-10%）而没有任何表型表现。连续的利用小的突变可能导致负责原始基因型生产力的遗传因素的增加。生产头孢菌素的有机体与生产青霉素的Penicilliium chrysogenum 菌株一样有着特殊的价值。

诱变剂的选择 尽管诱变剂分为物理和化学来源，但是对于工业遗传学家来说这没有多大的联系。选择的主要理由是所选择的技术能够生产尽可能大范围的突变异种以供选择。许多诱导的突变作用不是DNA损伤类型的直接结果而是细胞DNA修复过程作用于损伤处使其在碱基序列上发生了固定的改动的结果。能够导致这种现象发生的诱变剂包括紫外线、离子射线、胸腺嘧啶饥饿和某些化学诱变剂，例如丝裂霉素C、5-溴尿嘧啶、甲基甲烷磺酸酯、氮芥子气和硝基呋

喃。

关于诱变剂特异性的分子基础是不完整的，但很大程度上取决于诱变修复过程。实际上，生产菌株对于一个特定的诱变剂的作用可能会难以控制的，轮流使用一些诱变剂是明智的，这些诱变剂经历不同的修复过程而发挥作用。而且，突变剂的正确选择可以大大提高在诱变体中我们想要的诱变体的产生的频率，经过这样的方式，当对整个群体进行筛选的时候，鉴定的机会就会增加。 诱变率是基因控制的而且能够通过增变或者减变基因进行改变。这些基因能够影响自发的或者诱导的突变性或者两者都有影响。在筛选过程中，增变菌株是重要的由于其中有些增变菌株在诱变作用后能够使在每个存活的菌株中的诱变菌株的频率增高，这将提供了一个有效的输入。

在诱变作用后，环境条件能迅速影响整个的诱变频率和特异性。因此，在诱变作用后在完全培养基上进行生长而不是基本培养基将会增大诱变体的产量。

大部分生物有一种机制就是与其他相似的但是基因不同的单体进行核物质交换，从而所形成的后代的基因型均不同于其亲代。这个过程就是杂交，是促进可能的基因物质进行重组的一种重要方法。诱变改变了一个有机体的基因，而重组或者杂交又重新安排了基因或者部分基因，而且将从一个或者两个有机体而来的遗传信息带到一个单独的有机体中。杂交在植物和动物育种中广为采用，最近又被用来为很多生物工程过程生产改造的微生物。原则上，杂交有两种表达方式：真核生物的有性生殖和原核生物的准性杂交，对于一个特定的真核生物和大多数真核组织培养物不是纯性别的。在生物工程背景下，真菌和细菌是杂交的主要对象。

3.4 有性杂交 在有性杂交过程中，来自相反配体类型的单倍体核子被带入到一个细胞中（核配）：核子最终融合形成一个二倍体核子然后经历减数分裂。在减数分裂过程中，染色体被重新安排和组织从而使遗传元素重组（图3.2真核生物的减数分裂）。这个同源重组对于产生新的基因型来说是很有效的。这样，如果两个有机体有不同的n个基因，则发生在它们基因间的重组就会产生2n个基因型。如果这两个菌株在上亿个碱基对中的只有12个分散在其上的碱基对是不同的，那么

将会产生212个或者是4096个基因型。

在许多生物体中，存在的繁殖系统使有性杂交变得复杂，这个繁殖系统通过阻止自体受精的近系繁殖调节一个群体的远系繁殖。通过这样的方式，繁殖系统促进了适宜遗传物质的不断混合。繁殖系统对许多高等子囊菌纲和担子菌纲来说已有文件证明并且已被广泛用来蘑菇的商业化生产：。。。。。。

通过现代化工厂工艺，不同酵母菌株的有性杂交已被用来快速生产面包，提高蒸馏液体的酒精浓度和酿造特殊的啤酒，其中几乎所有的可溶性碳水化合物都被除去了。

3.5 目前在生物工程中应用的重要的有机体几乎没有明显的有性重组能力。然而，通过准性机制可实现有限的重组。准性过程包含在营养细胞中所有不进行减数分裂的基因重组过程。

准性过程利用许多细胞机制把不同来源的遗传物质带到一起。这个机制在生物工程中有着实际的应用包括接合、转导、转化、有丝分裂重组和原生质体融合。

细菌中的接合是将遗传信息通过细胞与细胞的联接从一个细胞转移到另一个细胞的过程。接合也能发生在真核生物中，这时单倍体配子融合形成二倍体合子（图3.3(a)准性过程机制）。它是最为适用的转移方法之一并且对于种内和种间遗传转移来说是非常有用的。在细菌中，这个过程通常是以质粒为中介的，甚至在涉及高频率重组株和相关菌株的例外情况下，一个外来遗传元素一旦是质粒，它就整合到染色体上。接合转移伴随着DNA的复制并使转移的DNA整合到受体的基因组上。尽管接合作用是革兰氏阴性菌的特征但是在革兰氏阳性菌中也证明有接合作用。发现最早的细菌接合系统是大肠杆菌的两个不同菌株细胞间的联结和遗传物质经过性纤毛或者两个配子的一个所形成的微管进行转移。形成纤毛的细胞包含有额外的遗传元素，F因子或者质粒，它们将环状的细菌DNA开裂并向另一个菌体细胞移动，在这个细胞里，两个基因组之间进行重组。利用多种宿主的质粒就可以在大范围的革兰氏阴性菌之间进行基因的转移。接合作用发现对于生产抗生素的Streptomyces和Nocardiaju菌株的改造有着很多实际应用。

转导是通过病毒载体将遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞并通过重组进行随后的合并（图3.3(b)准性过程机制）。溶源性噬菌体将部分细菌基因组整合到自身的基因组上，转移这个细菌基因到另一个宿主细胞中并在合适的条件下，这个细菌DNA在新的细胞中进行表达。英国皇家化学机构成功的利用转导作用对参与生产单细胞蛋白的Pruteen process的细菌进行改造。对于动物细胞获得了感兴趣的猿猴病毒40（SV40）和鼠多瘤病毒而植物细胞是一种病毒传递物质，它有着特殊的价值。这就是花菜花斑病毒（CMV），它是一个双链DNA分子，其宿主限定为十字花科。还没有期望这个病毒系统在植物生物工程中有重要的应用。

转化，或者是遗传物质的单向转移，在这个过程中，来源于一个细胞的DNA被吸收并且被另一个细胞稳定的维持，转化在细菌中有广泛的作用（图3.3(c)准性过程机制）。酵母和Streptomyces的转化正在广泛并迅速的发展，但是到现在为止在丝状真菌和植物与动物细胞中只有有限成功的转化。转化的DNA可以经过体外处理或者操作包括诱变作用再导入到细胞中。转化的一个主要的缺点是对于大多数细菌来说，一个群体中只有一小部分能够进行转化（大约为大肠杆菌的0.1%，高于大肠杆菌10-100倍的B.subtilis）。在大肠杆菌中已经表明与小分子相比，大的质粒DNA分子的转化效率较低。转化已成为基因工程的一个主要的方法，其利用质粒作为运输工具，将在本章的后面内容中进行讨论。 有丝分裂重组对于丝状真菌有着特殊的价值。对于某些真菌，无性噬菌体是单倍体，少量的核子可以融合形成二倍体。真菌无性循环过程中的二倍体菌体是无性核子在杂合条件下融合的结果。这个过程由下列阶段组成：在两个单倍体菌丝体之间形成异核体（一个单独的细胞质含有两个或多个不同的核子）；少数相反核子发生细胞核融合（频率为10-6）；在二倍体核子中进行有丝分裂交换使染色体间发生交换（频率大约为10-2每细胞核分裂）；当二倍体核子被还原到单倍体状态下的时候，以大约每细胞核分裂10-3的频率进行单倍体化（图3.4有丝分裂性重组过程）。这种有丝分裂性重组可进行可能的基因分析并在无性循环的有机体中进行可控制的育种。对于重组的效率，与有性重组相比，有丝分裂性重组的效率很低。已知这种形式的准性杂交在许多工业真菌中都有发生包括Penicilliium chrysogenum 、Aspergillus oryzase 和Cephalosporium

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