代谢组学技术及在毒理学研究中的应用

代谢组学技术及在毒理学研究中的应用

摘要：代谢组学是定性和定量分析某一生物或细胞所有低分子量代谢产物，从而监测机体或活细胞中化学变化的一门科学，是系统生物学的重要组成部分。作为系统生物学重要组成部分的“代谢组学”，通过考察机体受毒物刺激后体液或组织中代谢物的整体动态变化轨迹，结合模式识别的多元分析方法，快速筛选毒性相关的分子标志物，进而更系统、更全面的揭示毒物作用于机体的典型特征，为相关毒性作用模型建立、环境或药物中毒性化学物的快速高通量筛选以及相关疾病的预防与治疗提供重要的科学依据。本文将从代谢组学的概况、代谢组学在毒理学中的应用进行综述。

关键词：代谢组学；毒理学；应用

“代谢组学”(metabonomics)是指对机体因环境因素刺激、病理生理扰动或遗传修饰等引起的多种代谢指标动态变化的系统性定量检测新方法，该技术广泛用于植物学、药理学、毒理学、遗传学等学科领域。“代谢组学”最早是在1999年由英国的Jeremy Nicholson提出的，是在利用核磁共振技术检测生物体液组成成分的基础上结合模式识别的分析方法发展而来，主要是通过考察生物体系受环境刺激或病理生理扰动后的代谢产物动态变化，分析代谢产物整体的变化轨迹，以此阐述某种病理(生理)过程中所发生的一系列生物学事件及机制。

毒理学是研究毒物与机体交互作用的一门学科，一方面探讨毒物对机体各种组织细胞、分子、特别是生物大分子作用及损害的机制，阐明毒物分子结构与其毒作用之间的关系；另一方面，也研究毒物的体内过程（吸收、分布、代谢转化、排泄）及机体防御体系对毒物作用的影响。“代谢组学”一经提出，其崭新的研究思路和无损伤的整体研究方法在包括药物开发、毒性评价及预测、营养和食物安全性评价等在内的众多领域得到日益广泛的重视和应用。 1. 代谢组学的概况 1.1代谢组学的定义及发展[1]

代谢组学是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是继基因组学、转录组学、

蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域，它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化，反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化。代谢组学的概念最早来源于代谢轮廓分析。Nicholson研究小组于1999年提出了代谢组学的概念，并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作。Fiehn等提出了metabolomics的概念，第一次把代谢产物和生物基因的功能联系起来，之后很多植物化学家开展了植物代谢组学的研究，使得代谢组学得到了极大的充实，同时也形成了当前代谢组学的两大主流领域:metabolomics和metabonomics。经过不断发展， Fiehn、Allen、Nielsen、Villas-Boas等确定了代谢组学一些相关层次的定义，已被学术界广泛接受。第一个层次为靶标分析，目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物；第二个层次为代谢轮廓分析，采用针对性的分析技术，对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定；第三个层次为代谢指纹/足印，定性并半定量分析细胞外/细胞内全部代谢物；第四个层次为代谢组学，定量分析一个生物系统全部代谢物，但目前还难以实现。

作为应用驱动的新兴科学，代谢组学已在药物毒性和机理研究、微生物和植物研究、疾病诊断和动物模型、基因功能的阐明等领域获得了较广泛地应用。近来，代谢组学又在中药成分的安全性评价、药物代谢的分析、毒性基因组学、营养基因组、药理代谢组学、整合药物代谢和系统毒理学等研究方面取得了新的突破和进展。

完整的代谢组学分析的流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析及解释。样品的制备包括样品的提取、预处理和化合物的分离。代谢物通常用水或有机溶剂(甲醇、己烷等)提取。分析之前，常先用固相微萃取、固相萃取、亲和色谱等方法进行预处理，用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等方法进行化合物的分离。预处理后，样品中的代谢产物需要通过合适的方法进行测定。色谱、质谱、磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、放射性检测、光散射等分离分析手段及其组合都在代谢组学的研究中得到应用。其中，核磁共振(NMR)技术特别是氢谱以其对含氢代谢产物的普适性，色谱以其高分离度、高通量，质谱(MS)以其普适性、高灵敏性和特异性而成为最主要的分析工具。代谢组学研

究的后期需借助于生物信息学平台进行数据的分析和解释，解读数据中蕴藏的生物学意义。最常用的是主成分分析(PCA)法和偏最小二乘(PLS)法。

代谢组的规模与物种有关，差异很大。细菌代谢组规模相对较小，一般认为大约不到1500种，例如F rster等重建了啤酒酵母的代谢通路图，其中包含1175个代谢反应和584种代谢产物。Karp等对大肠杆菌的研究证实其包含904个代谢反应和886个小分子代谢物和376个大分子代谢物。植物代谢组通常可达数千种，例如拟南芥有约5000种代谢物，而整个植物界的代谢物种类估计高达20万，高等动物代谢组的规模可能更大。但在研究的几个步骤中，代谢组学还存在一些不足。例如，分析手段存在局限性；全部定量分析难以实现，准确性不足；定性过程复杂。针对这些问题，现在的研究者们在研究策略和方法上做着积极的探索和改进。

1.2代谢组学研究工作的主要流程[2]

根据生物学问题设计实验方案→收集样品→制备分析样品→数据获得—

原始数据 差异峰列表 ↓ ↓

→数据处理→数据分析→生物标志物→从生物学角度解释 1.3代谢组学的研究方法[3]

一个完整的代谢组学流程从要研究的科学问题开始，通过合理的实验设计，采集和制备生物样本，使用适当的分析化学技术获取代谢物的时空分布信息；经过数据整合与挖掘，发现和鉴定生物标志物并将多维信息投影到代谢网络中，回答生物学问题并提炼新的科学构想，然后设计新的生物学实验验证猜想或修正代谢网络(图1)。

图1 代谢组学研究方法

2. 代谢组学研究中的优势及存在的问题 2.1代谢组学研究中的优势[4]

代谢组学与转录组学和蛋白质组学相比，具有以下优点:①基因和蛋白表达的微小变化在代谢物上得到放大，从而更易检测；②代谢组学技术无需建立全基因组测序和大量表达序列标签的数据库；③代谢物质种类远少于基因和蛋白质的种类；④代谢组学的研究标本容易获得。 2.2代谢组学研究中存在的问题[5]

代谢组学在广泛应用的同时，也存在着明显的不足。具体为：①对某一物种、某个组织或其细胞中所有的代谢途径中的所有代谢产物同时进行全面的高通量的定性和定量分析，在理论上行得通，但没有任何一种分析技术能够同时对代谢组中的所有化合物进行分析；②代谢组学可得到大量信息，如何处理、分析及解释这些信息是一个艰巨的技术难题；③如何把代谢组学数据和转录组学、蛋白质

组学、遗传学、酶学、代谢途径和表现型分析的数据整合在一起，并给出生物学功能的解释，将是最大的挑战；④各种生理因素，如饮食、健康状态、年龄、昼夜节律、压力、遗传变异和动物品系均可影响生物标本的代谢成分，如何准确区分代谢图谱的改变是生理学影响还是病理学改变也是一个难题；⑤当机体的生理和药理效应超敏时)受试物即使没有相关毒性，也可能引起明显的代谢变化，导致假阳性结果。

3. 代谢组学在毒理学中的实际应用 3.1在毒性机制研究中的应用[6]

通过体液或组织中代谢物的变化，能够追溯到药物所影响的代谢通路，从而给研究者关于毒性机制的大量信息。Mortishire - Smith等研究发现肝脏毒性与趋化因子受体5有关。研究发现尿中三羧酸循环中间产物减少，而且出现了异常物质—中链二羟酸，就推测该药物诱导了脂肪酸代谢紊乱。随后通过3H同位素标记软脂酸发现其β-氧化呈剂量依赖性的减少，就进一步证实了以上推测。Ming-yang Liao等对抗乙型肝炎病毒的化合物Bay41- 4109的肝脏毒性进行了研究。他们研究了不同剂量Bay41- 4109处理的大鼠尿液、血清、肝脏的水性提取物和肝脏的脂性提取物的代谢物1H NMR图谱的变化情况，发现3-羟(基)丁酸、乳酸、2-羟(基)丙酮醇、肌酐、乙醇、甘露醇、D-葡萄糖、马尿酸等浓度有明显变化，提示此药物引起的肝毒性的机制与脂代谢紊乱和线粒体抑制有关。有研究者应用代谢组学的方法对muraglitazar，一种能够在雄性大鼠中引起结晶尿、膀胱乳突状瘤以及中间细胞癌的PPAR双激动剂进行了危险性评价，发现尿液中二价阳离子、枸橼酸盐减少，并由此推测，以上疾病的发生发病原因为：药物能引起尿液中钙的磷酸盐结晶，该结晶物能够造成膀胱慢性组织损伤。随后的研究证实该药对膀胱的致癌效应是通过尿路结石造成的泌尿上皮损伤及其代偿性增生介导的[7]。Flint，O. P等用代谢组学的方法研究了市场上HIV蛋白酶抑制剂(PI)的副作用。分别选择导致脂肪营养障碍、胰岛素抵抗、脂肪重动员的蛋白酶抑制剂以及阴性对照药为研究对象来处理体外培养的3T3-L1脂肪细胞。研究显示，确认的193个代谢物中，一种或多种PI处理后有81个化合物减少。这些代谢物主要是葡萄糖、磷酸、氨基酸(包括所有的糖异生前体)、谷胱甘肽(由谷氨酸衍生而来)、脂肪酸、泛酸(脂肪酸合成所必须)、三羧酸循环的中间产物以及酮类物质。

导致脂肪营养障碍的PI抑制了24~58个化合物，而与脂肪营养障碍无关的PI只改变了3个化合物。这些结果显示PI导致脂肪营养障碍与糖异生或糖酵解增强而导致的脂类合成的中间产物减少有关。Paker，R.A等的研究结果显示，脂肪营养障碍发生的机制与PI抑制了脂肪细胞的葡萄糖转运体GLUT4有关。一种PI-3激酶抑制剂在高剂量时能引起大鼠不明原因的死亡，Robertson D.G等[8]用代谢组学的方法对其毒性进行了研究，发现在早期就有β-羟丁酸的迅速增高，而且传统的毒性研究并没有检测出来。 3.2 代谢组学在毒理学评价中的应用[9]

由英国帝国理工学院牵头，5家著名的制药公司参与设立了“COMET”(Consortium for Metabonomic Toxicology)计划。该计划由Nicholson等科学家参与，旨在建立代谢组学数据库，为毒性预测建立计算机专家系统。在完成147种不同模式毒物的实验研究后，他们建立起第一个基于代谢组的实验室啮齿动物肝脏和肾脏毒性预测的计算机专家系统，目前许多药物毒理学研究均受到该计划资助。通过代谢组学技术可以研究毒性物质造成的生化代谢的异常，追踪毒性作用的靶器官和生物标志物，还能对毒性效应随时间的发展进行直观描述。例如Constantinou等对大鼠慢性肝硬化的代谢组学分析表明，血清代谢组能提供生物标志物信息，并能跟踪病理变化的发展进程，可能提供一种肝硬化患者病情诊断的手段。Parr等对土豆的代谢指研究发现其中存在青藤碱等多胺类物质，而这些物质在以前的研究中从未报道，这是由于代谢指纹研究并无特定目标物质。这也说明代谢指纹在植物毒理学研究领域有着广泛的应用空间。Chen等用LC-MS研究了马兜铃酸的肾脏毒性，结果表明95%的大鼠能正确归类到受试组和对照组，并且找到了相对应的代谢通路变化，这种方法可以应用于复杂成分下机体的毒理学反应。Coen等[10]认为基于代谢组学的分子毒理学在疾病诊断、外源物质毒性评估、功能基因组学和营养学等领域有着良好应用前景，其非侵入性的特点也更容易被人接受。

3.3代谢组学在食品成分评价及溯源中的应用

由于代谢组学可以发现样品间的细微差别，因此可以为食品溯源和成分评价提供定性和定量数据。Cavaliere等[11]采用GC-MS的代谢组学技术对不同产地的橄榄油进行了评价，该方法能对邻近地区生产的橄榄油进行区分，并对决定橄榄

油质量分级的化合物进行了鉴定。Pongsuwan等应用基于GC-TOF-MS和正交信号校正(OSC)与偏最小二乘法(PLS)的代谢组学技术对日本绿茶进行分级，结果表明该方法能在没有标准品的情况下对绿茶的等级进行准确分级。Woodcock等结合近红外光谱和模式识别法对不同产地蜂蜜的聚类进行了研究。上述这些研究说明代谢组学为食品成分研究及食品溯源提供了一种全面而强大的分析方法。 4. 展 望

代谢组学从诞生之日起就被赋予了串联基因组、蛋白质组和转录组的重任，但由于现有仪器手段的限制，这一组学手段还不能完全实现设想的全方位代谢物检测。随着NMR冷冻探头和高频谱仪的发展以及各种质谱技术与NMR的在线连用，将能大大提高代谢组学研究能力，当然降低仪器成本以及仪器的小型化也是这一技术不断推广的前提。代谢组是一个多维度多变量的海量数据库，这就依赖于化学计量学的不断发展为代谢组学研究提供强有力的数据挖掘手段。随着代谢组学的进一步发展，将建立大规模的标准化代谢组学数据库，包括代谢轮廓、代谢标志物等丰富信息，而且这些数据库应该与基因组、蛋白质组、转录组的数据库相互衔接，形成系统生物学数据链，指导科研实践。

目前，国内外许多研究者都在进行代谢组学研究，代谢组学应用的范围和领域也在不断扩大。但这些研究依然存在了许多问题亟待解决。(1)在代谢全谱分析中缺乏量的概念。在这个问题上，我们通过这几年对代谢组学进行的研究，也提出了自己的一些策略和思想，首先是将代谢指纹谱与定量进行了结合，称之为定量代谢指纹谱技术。这个结合包含了两个层次，一个是数据采集技术上的结合；一个是数据分析技术上的结合。这样的结合能实现指纹谱与定量优势互补，将更清晰、更全面、更准确地反映研究对象的代谢情况。(2)虽然代谢组学强调无歧视分析，但对于任何一个体系，都按代谢组学常规步骤按部就班地进行分析，往往最终都没有得到有用的结果。针对这个问题，我们认为要重视先验知识的重要性，了解哪些代谢循环、代谢物质最可能与研究体系相关，利用这样的先验知识指导代谢组学分离分析条件的优化、潜在生物标志物的鉴定，将大大提高代谢组学研究的效率，并能很好地避免研究重心偏离的情况。(3)生物标志物的寻找单一而片面。特别是对于疾病的研究，以前不太重视代谢、蛋白、基因数据与临床数据的结合，各个方面的研究者就在自己的研究数据中进行挖掘，以此来寻找标

志物，探寻机理。但实践证明，这样得出的结果都会有片面性，缺乏说服力。在这个问题上，应该强调代谢组学数据与其它数据的结合，特别是临床相关数据，以此来发现包含了不同数据内容的复合生物标志物，这也是今后代谢组学发展的一个重要方面，同时，这也为生物代谢或临床表型多样性研究[12]提供更可靠的方法和工具。尽管存在许多的问题，但也看到了在研究策略上整合一体化、标准化、定量化的趋势，并且看到了在问题导向下的新技术的不断涌现，这都将推动代谢组学不断持续发展。相信随着关注度的提高、人力和物力的不断投入及应用范围的不断扩大，代谢组学必将得到更为稳健的发展。

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