shRNA详细原理及引物设计
更新时间:2023-10-22 07:37:01 阅读量: 综合文库 文档下载
shRNA 克隆原理及引物设计
一.DNAoligo设计
1.来源:1)文献报道(优先考虑)
2)网站
利用网站提供的软件设计DNAoligo:
主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用 网站:
http://genomics.jp/sidirect/
http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html 举例:HEXIM1shRNA设计
A: siDirect
输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列
设置只要将\选上, 如图下
点design siRNA
结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看
优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基
点击各个按钮查看各段碱基 orf, 应选择此范围内的序列
B: Dharmacon
输入accession number, step 4中选blast, database选human 点”design siRNAs”
基因含碱基异构体时使用
结果: 优先选择score高, mismatch为3或大于3, 且不要化学修饰的序列
C: Ambion
序列可由SiDirect或其他位置粘贴过来,
设置中选中”4. Sequence constraints to avoid: 4 or more A's or T's in a row”, 点submit
结果: 本网站生成的序列全部以AA开头, 后19位为所要序列
最终结果
完全重合很难实现, 所以也接受小部分不重合. 举例: 得到以下结果,
1. TT CAACAGCTGGGCAAGTTTA AG
1619
AA CAGCTGGGCAAGTTTAA GG 1622
Matched by SiDirect, Dharmacon (1619) and Ambion (1622)
然后随便选择一段, CAACAGCTGGGCAAGTTTA (起点1621) 或CAGCTGGGCAAGTTTAAGG (1624)均可 标注为”sh+基因+起点” 如: shPRKD1-2616
注:由于所设计的每个oligo并不都具有knockdown效果,针对每个protein
设计oligo时,一般设计4-5个不同的oligo序列以便筛选。
2.shRNA设计model
shRNA design Model
A. New pSUPER-BX and pSR-H1 shRNA design model: BamHI-XhoI site
sh F: 5’-GATCGGG TTCAAGAGA TTTTTC-3’ sh R: 5’-TCGAGAAAAA TCTCTTGAA CCC-3’
Example:
shCdk2-85 F: GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC
shCdk2-85F: GATCGGGGGTGGTGGCGCTTAAGAAATTCAAGAGATTTCTTAAGCGCCACCACCTTTTTC shCdk2-85R: TCGAGAAAAAGGTGGTGGCGCTTAAGAAATCTCTTGAATTTCTTAAGCGCCACCACCCCC
B. Old pSUPER shRNA design model: BglII-HindIII site
sh F: GATCCCC TTCAAGAGA TTTTTA sh R: AGCTTAAAAA TCTCTTGAA GGG Example:
shCdk2-85 F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC
shCdk2-85F: GATCCCCGGTGGTGGCGCTTAAGAAATTCAAGAGATTTCTTAAGCGCCACCACCTTTTTA shCdk2-85R: AGCTTAAAAAGGTGGTGGCGCTTAAGAAATCTCTTGAATTTCTTAAGCGCCACCACCGGG
二.合成后DNAoligo的溶解
1)DNAoligo溶解前, 13000rpm离心3min。(由于合成的DNAoligo为粉末状态,且管内处于真空状态)
2)用经高压灭菌后的ddH2O将DNAoligo定量至3μg/μl。 ddH2O的体积(V/μl)=DNAoligo的质量(mg)×1000/3 注:所取ddH2O的体积尽量准确。
3)常温放置30min,使DNAoligo充分溶解。
三.DNAoligo的退火 1)退火体系(50μl) 正向DNAoligo(F): 1μl
反向DNAoligo(R): 1μl 10×退火Buffer : 5μl ddH2O : 43μl
2)用石蜡膜将EP管口封好。
3)将EP管放入事先煮沸的电磁锅中,煮沸4min。
4)关闭电源,将电磁锅放入泡沫箱中保温。(为使温度缓慢下降,以便正反向oligo充分退火)
5)待锅中的水温降至常温,将EP管取出进行连接实验或置于-20℃冰箱中保存。
四.pSR-H1载体的XhoⅠ和BamHⅠ双酶切 1)酶切体系(50μl)
pSR-H1质粒: 5μg XhoⅠ(NEB) : 2μl BamHⅠ(NEB) : 2μl BamHⅠBuffer: 5μl BSA(100×) : 0.5μl ddH2O : 35.5μl
2)混匀,用离心机将液体甩入管底。
3)37℃恒温水浴锅中反应过夜(至少12h,否则可能酶切不完全)。
五.酶切产物的胶回收(GE胶回收试剂盒) 1)电泳:配制1%的琼脂糖凝胶,150V电泳45min.
2)切胶:用吸水纸将凝胶上的电泳液吸干,干净的刀片在紫外灯下切出目的条带(胶块尽可能小)。
3)称量:将切好的胶块放入1.5ml的EP管中,称其重量并做好标记。
4)溶胶:用枪头将胶块搅碎,按100mg加100μl的capture buffer type 2的比例向EP管中加入capture buffer type 2,于60℃水浴中放置10min,期间颠倒离心管3次使胶块充分溶解。
5)离心:将溶胶液转至事先准备好的柱子中,放置3min,6000rpm离心1min。
6)洗涤:向柱子中加入500μl Wash Buffer,6000rpm离心1min。 7)洗脱:将柱子套置干净的离心管中,向中央加入15μlddH2O,13000rpm离心1min,收集流出液。 8)重复步骤7. 9)-20℃保存,待用。
六.酶切后的pSR-H1和退火oligo的体外连接
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