PPARγ激动剂对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β_1和Smad信号途径的作用研究

增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。目前已知,转化生长因子(TGF)β1是主要致纤维化因子之一,Smad是参与TGF-β主要信号转导途径,Smad2和Smad3磷酸化参与其信号转导。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)系一类配体激活的核转录因子超家族,

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中国美容医学 2 1年 7月第 2 0 1 0卷第 7期 C ieeJu a o ete cMeiieJ1 0 V 1 0N . hn s or l f s t dc . . 1.o. .o n A hi n u2 1 2 7

P A P RY激动剂对增生性瘢痕成纤维细胞 T F 5和 S a G -t。 m d信号途径的作用研究聂 树涛(齐鲁石化医院集团中心医院检验科细胞室山东淄博增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过

250) 5 4 0

组和 5 gm G -B n/ lT F组，作用 2 4 h后收集细胞。对照组和各处理组均重复 3次。

度沉积为主要特征的结缔组织疾病。发病机制至今尚未彻其底阐明。目前己知，化生长因子 (G )是主要致纤维化转 TF D因子之一，S a m d是参与 T F 3主要信号转导途径，S a2 G -1 m d和 S a 3磷酸化参与其信号转导。 md过氧化物酶体增殖物激活受体 Y(P RY) P A系一类配体激活的核转录因子超家族，受到配体或激动剂的激活而活化，参与许多细胞功能的调控。 。目 前有关其对瘢痕成纤维细胞作用机制的研究尚少。本文通过研究 P A P RY激动剂对 T F致瘢痕成纤维细胞作用的影 G—响及机制，步探讨 P A 激动剂抗瘢痕形成的潜在作用。初 P Rv 1材料和方法 1 1材料 .

1 2 2R -C . . T P R检测瘢痕成纤维细胞细胞 F R A的表达： NmN以 T i o法提取上述收获的细胞总 R A按逆转录试剂盒操作 rz l N,说明将 R A逆转录为 eN,进行 P R扩增。F N DA C N上游引物：5T A G C A G G A A C A’下游引物： 5 G G G C G’ T T A G T G AG CT 3:’T G G T G

AAATCC’ B A G T A T 3;一肌动蛋白上游引物：5 T G G A Ac A’GAAGGTTG G TC T 3:]旃弓物：’ TC A C G C G A T T T G’ A C G C G’ I 5 G G C CA AA CC G G T 3。

PR产物经 1 5琼脂糖凝胶电泳， C .%用计算机凝胶成像分析系统进行吸光度扫描分析， B一肌动蛋白吸光度值 ()行以 A进校正。

12 3W s en印迹检测瘢痕成纤维细胞细胞 F . . e t r N蛋白的表达：刺激细胞结束时，加细胞裂解液，

￣ 4C,1 0 r m n离心 2O0/i lm n上清液中的蛋白浓度以二喹啉甲酸 (C ) O i, B A法测定。取等量蛋白与 5×上样缓冲液混合煮沸 5 m n后进行凝胶电 i泳。电泳后进行 W s en印迹检测 F etr N蛋白表达。 12 4 W se n印迹检测瘢痕成纤维细胞细胞 S a . . e t r m d及酸化 Sa m d蛋白：同上方法培养细胞， 1 0接于六孔板中，以×1加入 5n/lTF 1 gm G一分别培养 0 i i、 0 i、h和 2 3、m n 3 m n l h后收

l1 1取材标准： _.①增生性瘢痕，痕色泽红，瘢质硬，出皮肤高表面，均为烧伤创面愈合已超过 3个月，但瘢痕仍持续增生， 瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾治疗；②患者无其他疾病。 1 12增生性瘢痕成纤维细胞：采用组织块法进行原代培 ..养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成 i m左右的组织块 m置于培养瓶中， 9%在 5空气、% 0、 7C、 5 C 3￣饱和湿度条件下培养 6 h使组织块牢固的粘附在瓶壁上，~8,然后加入含 1% 0胎牛血清的 D E M M培养基适量，继续培养， 44天换液 1 2 3次，~3周后，代细胞生长成单层， 0 2%蛋白酶消化后，原用 .5胰按

获细胞，提取总蛋白，处理分组：对照组，2 g m G一 n/ l TF 1 3组， 5 g m T F 1 1组， l￣ o/ 1 d P J n/ l G一3 O m l L 5— G 2+5 g m n/ l

T F B1组， 1￣ o/曲格列酮+n/ l G一1组， G— 0 m lL gm T F 3

1￣ o/ 0 m lL齐格列酮+5n/ lT F B1 (种药物分别预 g m G—组 3处理 2 ) h。作用 2h收获细胞，取总蛋白。W s e n印迹检 4提 e tr测蛋白表达。

13的比例传代培养，:实验用第 3~5代细胞。 1 13主要试剂：M M细胞培养液和胰蛋白酶 (国 G B O .. DE美 I C公司)人类重组 TF (国 P p o T c C L d公司), G—美 er e h E t, P A P RY配体 1d P J、曲格列酮和齐格列酮 (国 B o o 5 -G 2美 im l公司) T io提取液 (国 G B O B L公司)逆转录试剂盒

,r z l美 IC/R,

12 5统计学处理：应用 S S . 2统计软件处理数据。 .. A6 1 R—C T P R和 W s e n印迹实验重复 3次，P R产物和蛋白印 e tr C

迹显影图片光密度扫描比值以±S表示，各组间均数比较采用方差分析。2结果

(陶宛 F r e t s立 e m n a公司)山羊抗大鼠 S a 2 S a 3磷酸化， m d、m d、S a 2 3 P S a 2 3多克隆抗体 (国 S n a C u m d/ (- m d/ )美 a t r z公司),兔抗大鼠 F N多克隆抗体 (国 G B O公司)辣根过氧化物美 IC,酶标记 I G二抗 (国 K L公司)P R引物 ( g美 P,C上海生工合成)。12方法 .

2 1T F 1 . G -诱导瘢痕成纤维细胞细胞 F R A表达的剂量效 3 NmN应和时间效应：痕成纤维细胞细胞有基础量 F R A达。瘢 Nm N表

1 2 1细胞培养与刺激：第 3 ..~5代细胞瘢痕成纤维细胞株培养于含 1% 0灭活小牛血清的 D E/ 1 M M F 2培养液中， 3" 置 7 C,

经不同浓度 T F 刺激 2后，F R A G— 4h N mN表达量明显增加， 呈一定剂量范围内(￣5 g m) 0 n/ 1的依赖效应。lg m T F D n/ I G—刺激时， F R A表达量即明显增加 (< . 5, 5 gm时增 NmN PO0) n/ l

5 0培养箱中， 1 0接种于 2c养瓶中，%c2按×1。 5m培待细胞生长至 8% 0融合状态，无血清 D E/ 1 MM F2培养液孵育 2 h使 4,细胞生长同步化。分别加入不同浓度的 T F (、、、和 G—p 0 1 2 5 1n/ t培养 2 , 0 gm ) 4 h或加入 5 g m G~ 1别培养 0 6 n/ l T F分、、

加 37 .倍，1n/ l 0 g m时略有下降，但仍高于对照组 ( P 00 )均<. 1。 T F以时间 (￣2h依赖方式诱导瘢痕成纤维细胞细胞 G—B 0 4)F R A表达。 n/ lG—刺激 6 N mN 5 gm TF B h后， N mN F R A表达量开始呈现增加趋势，至作用 2 4 h时增加 2 5倍 ( P O O ) .均 (.1。

1 2和 2 h后收集细胞。同法进行细胞培养，分别应用 4 1￣ o/ 5—G 2 l￣ o/ 0 m lL 1d P J、O m lL曲格列酮、0 m lL齐

格列 1￣ o/酮预处理 2, h再加入 5 gm G—B n/ l T F处理，另设一空白对照

22 P A . P RY激动剂对 T F 1 G一3诱导的 F表达的影响： N与对照组比较，5 g m G一0 n/ l TF组 F R A表达量增加 3 7倍 NmN .

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