三羟异黄酮对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用

第27卷第6期第　三　军　医　大　学　学　报Vol.27,No.6

2005年3月ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAEMar.2005

471

文章编号:100025404(2005)0620471203　　

论著

三羟异黄酮对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用

周　永,糜漫天,杨镇洲　　(第三军医大学:1预防医学院营养与食品卫生学教研室,重庆400038,2大坪医院野战外科研

究所肿瘤中心,重庆400042)

提　要:目的　探讨三羟异黄酮(genistein,GEN)对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)的保

护作用。方法　成年雄性小鼠辐射前24h给予GEN,610Gyγ射线辐射后观察BMSCs的形态变化、成纤维细胞集落(CFU2F)形成数量、BMSCs层对正常小鼠骨髓细胞(BMCs)的粘附能力以及血管细胞粘附分子(VCAM21)、纤维连接素(Fn)和层粘素(Ln)等细胞粘附分子的变化。结果　GEN处理组辐射后BMSCs虽然形态上与单纯辐射损伤组在光镜下无差异,但其CFU2F形成数量、对正常BMCs的粘附能力以及VCAM21、Fn和Ln等细胞粘附分子的表达均较单纯辐射损伤组高而且恢复较快。结论　GEN可减小辐射对小鼠BMSCs的损伤,促进受损BMSCs增殖、粘附功能恢复,改善骨髓造血微环境,有利于辐射损伤小鼠造血重建,具有辐射防护作用。　　关键词:三羟异黄酮;辐射损伤;骨髓基质细胞;细胞粘附分子　　中图法分类号:R322.71;R818.74;R977.12　　　文献标识码:A

1

1

2

Radioprotectivepotentialofgenisteinonmurinebonemarrowstromalcells

112

ZHOUYong,MIMan2tian,YANGZhen2zhou(1DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPreventiveMedicine,Chongqing

)400038,2OncologyResearchCenter,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China

Abstract:Objective　Toinvestigatetheradioprotectiveeffectofgenistein(GEN)onmurinebonemarrowstro2

malcells(BMSCs).Methods　AdultmalemicewereadministeredorallywithGENat24hpriorto6.0Gygammairradiation.ThenumberofCFU2F,theadherentcapabilityofbonemarrowcells(BMCs)toBMSCsadherencelayer,andtheexpressionsofcelladhesionmoleculesincludingvascularcelladhesionmolecule21(VCAM21),fibronectin(Fn),andlaminin(Ln)onBMSCsculturedinvitroweredetected,respectively.Results　ThenumberofCFU2F,theadherentcapability,theexpressionsofVCAM21,Fn,andLnonBMSCsculturedinvitroinGEN2pretreatedmicewerehigherandrecoveredmorerapidlythanthoseinmicewithoutGEN2pretreatment.LightmicroscopyrevealedthattherewasnosignificantdifferenceinmorphologyofBMSCsinbothgroupsafterirradiationinjury.Conclusion　TheseobservationssuggestthatradioprotectivepropertiesassociatedwithGENarelargelyaconsequenceofthereduc2tionofdamage,theinductionofcellproliferation,andthepromotionofadherentcapabilityrecoveryinrecipientmice.Thesechangesmayultimatelyamelioratebonemarrowmicroenvironmentandthereforeacceleratetherebuildingofhematopoieticsystemafterirradiationinjury.

Keywords:genistein;irradiationinjury;bonemarrowstromalcell;celladhesionmolecule　　雌激素是研究较多的一类的辐射防护剂,由于毒副作用大,特别是对生殖系统的雌活性大大制约了其在临床上的应用。三羟异黄酮(genistein,GEN)是大豆中非常重要的营养成分,是一类重要的天然雌激素,具有抗氧化、抑制酪氨酸蛋白激酶活性、模拟和拮抗雌激

1,2

素作用等多种生理活性,对多种肿瘤(如乳腺癌、前

3,4

列腺癌等)和一些慢性病(如骨质疏松和心血管疾

5,6

有防治作用。近年来有报道,GEN具有辐病等)

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30100046)

　　　　SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30100046)　　作者简介:周　永(1972-),女,重庆市人,博士研究生,助教,主要从事营养

与肿瘤方面的研究。电话:(023)68752291

通讯作者:糜漫天,电话:(023)68752292　　收稿日期:2004212227;修回日期:2005201215

射防护作用,对放射性造血损伤的重建有促进作用,且

7～10

对生殖系统无明显雌活性,但具体的分子机制尚不清楚。骨髓微环境是造血干Π祖细胞定居、增殖、分化、发育和成熟的场所。骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)是造血微环境的重要组成部分,造血微环境的异常是造血功能障碍的重要影响因素。放射性造血功能障碍是射线对造血实质细胞和造血微环境共同损伤的结果。本实验主要研究GEN对辐射损伤小鼠BMSCs的保护作用,初步探讨其辐射防护作用的机制。1　材料与方法1.1　实验动物及分组

本校实验动物中心繁殖的昆明种健康雄性小鼠300只,体

第　三　军　医　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第27卷472　　　　　　　　　　　　　　　　　

质量23～26g,随机分为3组,每组100只:①正常对照组(Con2

trol);②辐射损伤对照组(R);③GEN+辐射损伤组(GEN+R)。给药方式:辐射前24h,GEN(西安交大保赛生物技术股份有限公司,纯度≥98%)以食用色拉油作为溶剂,按160mgΠkg给予灌胃,每只约011ml。小鼠装在弧形有机玻璃盒内,以60Coγ射线一次性全身照射,吸收剂量为610Gy,吸收剂量率为98168×10-2

GyΠmin。取辐射后1、3、7、14d和21d小鼠骨髓细胞(bone

marrowcells,BMCs)进行体外培养,分别对培养14d和28d的BMSCs进行检测。实验重复3次,每次实验均设正常对照组。

1.2　BMSCs培养

在各个时相点取20只小鼠双侧股骨制备BMCs,按常规方法培养BMSCs。

1.3　成纤维细胞集落形成单位(CFU2F)的培养

BMCs以含10%新生小牛血清、10%马血清、青链霉素各

100UΠml、1×10

-6

molΠL氢化考的松和IMDM培养液制备成1×106

Πml,混匀后接种于24孔板,每孔2ml,每组重复6个孔,37℃、5%CO2培养箱内培养,每周半量换液,第14天于倒置显

微镜下计数,由40个以上细胞组成的集落为1个CFU2F。

1.4　BMSCs贴壁层粘附能力测定

将上述骨髓CFU2F继续培养,第28天基质细胞层形成后,用PBS液轻轻冲洗2次,去除悬浮细胞后,各孔加入细胞浓度

为5×105Πml的含20%小牛血清的正常小鼠BMCs1ml,37℃、

5%CO2培养箱内孵育2h,用IMDM培养液轻轻冲洗2次,收集

并计数未粘附的BMCs,按照下列公式计算BMSCs对正常BMCs的粘附能力。

粘附能力=1-5×10

5

×100%。1.5　流式细胞仪检测BMSCs粘附分子的表达

BMSCs培养28d后,收集各组细胞,台盼蓝染色判定BM2

SCs的成活率为95%以上。采用间接免疫荧光法,在各样本管

中分别加入一抗(VCAM21、Fn和Ln等单抗);阴性对照用PBS代替一抗,4℃过夜离心弃上清,PBS洗3次。分别加FITC标记的二抗,37℃孵育30min,离心弃上清,PBS洗3次,FCM分析并计算各指标的荧光强度变化。

1.6　统计学处理

实验数据以 x±s表示,采用SPSS统计软件进行t检验。

2　结果

2.1　辐射损伤后BMSCs形态观察

光镜下,正常小鼠BMSCs呈梭形、多角形,胞浆丰富,胞体较大且伸展,伪足明显;胞核居中或偏位,呈圆形或椭圆形,核仁单个或两个以上;细胞贴壁快,呈漩涡状或平行样生长,21d长满培养瓶。辐射受损BMSCs形态不规则,胞体较短小,排列散乱,胞浆呈撕裂状,胞核不清楚;细胞增殖能力明显受抑,贴壁能力大大降低;随着培养时间的延长,在光镜下可看见一些结构模糊的变性细胞。特别是辐射后第3天,骨髓中有核细胞较少,细胞极少贴壁;辐射后第7天,细胞形态、贴壁能力才逐渐开始恢复,培养28d后细胞融合仍然较差。R组与GEN+R组的细胞形态差异不明显。

2.2　GEN对辐射损伤后CFU2F数量的影响

从表1可知,辐射后各时相点CFU2F形成数量均少于正常组,且恢复缓慢,直至辐射后21d,CFU2F形成数量仍低于正常

组,仅为正常的35%左右(P<0105)。与R组比较,GEN+R组

BMSCs贴壁能力较强且恢复较快。除辐射后第3、7天外,GEN+R组CFU2F数量高于R组(P<0.05)。

表1　小鼠股骨骨髓体外培养14dCFU2F的变化(n=20, x±s)

Tab1　ChangesofmurinebonemarrowCFU2Fculturedinvitro

for14d(n=20, x±s)

GroupPost2irradiationdays

1d3d7d14d21dControl112±21109±31119±19125±33117±27R23

±7a7

±1aq16

±6a24

±5a

37±15aGEN+R

30±11ab8±2a18±5a33±9ab

49±19ab

a:P<0.05,vscontrolgroup;b:P<0.05,vsgroupR

2.3　GEN对辐射损伤后BMSCs层粘附能力的影响

从表2可知,辐射后各组BMSCs贴壁层对正常小鼠BMCs粘附能力在各时相点均低于正常(P<0105),特别是辐射后第

3天,细胞层粘附能力最低,7d后才逐渐开始恢复,但恢复较

慢,直至辐射后21d,其粘附能力仅为正常的60%左右。除辐射后3d外,GEN+R组BMSCs贴壁层的粘附能力均较R组强

(P<0105)。

表2　小鼠BMSCs贴壁层对正常骨髓细胞的粘附能力(n=20, x±s)

Tab2　Theadhesiverateofbonemarrowcellstotheadherencelayer

ofstromalcellsculturedinvitro(n=20, x±s)

GroupPost2irradiationdays

1d3d7d14d21dControl73.1±7.169.4±5.775.5±3.273.4±4.670.9±7.3R25.3

±8.1a17.6

±3.3a18.2

±5.7a30.4

±2.4a

40.8±5.2aGEN+R

32.17.7ab16.56.1a20.22.1ab39.64.1ab

50.14.7ab

a:P<0.05,vscontrolgroup;b:P<0.05,vsgroupR

2.4　GEN对辐射损伤后BMSCs表达粘附分子的影响

从表3～5可知,辐射后各时相点BMSCs表达VCAM21、Fn

和Ln的能力进行性降低(P<0105)。除表达VCAM21于辐射后第7天逐渐开始恢复外,Fn、Ln的表达于辐射后第14天才逐渐开始恢复,且恢复较慢,直至辐射后21d仍然未恢复正常,仅分别为正常的50%、48%和65%左右。与R组比较,GEN+R组

VCAM21和Ln的表达于辐射后14、21d高于R组,Fn的表达于

辐射后7、21d高于R组(P<0105)。

表3　小鼠BMSCs表达VCAM21的变化(n=20, x±s)

Tab3　ExpressionsofVCAM21onmurinebonemarrowstromalcells

culturedinvitro(n=20, x±s)

GroupPost2irradiationdays

1d3d7d14d21dControl35.75±1.2133.22±1.1238.57±2.7135.64±2.0536.33±1.62R12.41±1.31a8.44±0.79a10.78±0.33a11.17±0.52a

16.15±1.11a

GEN+R

a

a

a

abab

a:P<0.05,vscontrolgroup;b:P<0.05,vsgroupR

第6期　　　　　　　　　　周　永,等.三羟异黄酮对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用　　　　　　　　　　　　473

表4　小鼠BMSCs表达Fibronectin的变化(n=20, x±s)

Tab4　Expressionsoffibronectinonmurinebonemarrowstromal

cellsculturedinvitro(n=20, x±s)

GroupPost2irradiationdays

1d3d

7d

14d

21d

Control47.65±2.8749.32±1.9944.56±2.04

46.81±3.11

48.58±1.97R18.33±1.02a11.27±0.87a7.59±0.41a15.61±1.22a

21.77±0.82aa

a

aba

ab

a:P<0.05,vscontrolgroup;b:P<0.05,vsgroupR

表5　小鼠BMSCs表达Laminin的变化(n=20, x±s)

Tab5　Expressionsoflamininonmurinebonemarrowstromalcells

culturedinvitro(n=20, x±s)

GroupPost2irradiationdays

Control

25.17±1.3928.42±1.4527.86±2.0926.39±1.93

27.44±1.25

R18.15±1.31a9.97±1.79a8.78±1.33a11.17±1.52a16.15±1.11aGEN+R

a

a

a

abab

a:P<0.05,vscontrolgroup;b:P<0.05,vsgroupR

3　讨论

造血微环境是支持和调节造血细胞生长发育的内

环境,BMSCs是造血微环境的重要组成部分,通过与造血细胞的紧密接触及分泌细胞外基质(extracellularma2trix,ECM)等调控机体造血过程。造血干Π祖细胞与BM2SCs间的相互粘附,是造血干Π祖细胞增殖和分化的前提条件,而这种粘附过程需要造血干Π祖细胞和BMSCs表达的细胞粘附分子(celladhesionmolecule,CAMs)发生特异性识别。研究表明,CAMs是一类能介导细胞与细胞、细胞与ECM粘附的糖蛋白,它们由细胞产生并定位于膜上或释放到ECM中,是造血干Π祖细胞回髓定位和信息传递的分子学基础,其中VCAM21、Fn、Ln等是非常重要的CAMs之一,当造血干Π祖细胞或BMSCs的粘附功能一方或双方受损,都将导致骨髓造血功能障碍。国内外研究表明,放射性造血功能障碍是射线对造血实质细胞和造血微环境共同损伤的结果。BMSCs具有较高的辐射敏感性,引起轻度骨髓型急性放射病的γ线照射剂量即可引起BMSCs增殖分化抑制、CFU2F形成减少、粘附功能降低等缺陷,且恢复较慢。

雌激素是一类重要的辐射防护剂,除雌二醇等天然雌激素外,人工合成的非甾体雌激素对放射性造血损伤均有一定的防护作用。早在1943年就有学者发现雌激素不仅可延长放射损伤小鼠的生存天数,还具有“升白”作用。尽管雌激素具有放射防护作用,但其对生殖系统的雌活性可导致严重的毒副作用,故应用受到很大的制约。GEN是大豆中重要的非营养素成分之一,其结构与雌二醇非常相似,但雌活性仅为雌二

醇的10-3～10-2

倍,是一种天然的植物雌激素,对人体无毒性。近年来有报道,GEN可提高辐射损伤小鼠的30d存活率,延长辐射损伤小鼠的平均存活天数,对生

殖系统无明显雌活性7～9

,具有辐射防护作用。我们

以往研究发现,GEN可减轻骨髓的放射性损伤,使辐

射后小鼠外周血WBC、骨髓有核细胞以及CFU2S下降

幅度较单纯辐射损伤组小且恢复快10

,但其分子作用机制尚不清楚。本实验观察了GEN对辐射损伤小鼠BMNCs的保护作用,并研究了其对BMNCs粘附能力以及相关CAMs表达的影响。结果显示,射线对BMNCs有明显的杀伤作用,使其CFU2F形成数量、粘附功能以及CAMs的表达显著降低;GEN可减少射线对BMNCs的损伤并促进其增殖和分化,使骨髓细胞CFU2F形成数量于辐射后1、14、21d高于R组(P<0105);BMSCs贴壁层粘附能力测定发现,除辐射后3d外,GEN+R组BMSCs贴壁层的粘附能力均较R组强(P<0105);进一步研究显示,GEN+R组VCAM21和Ln的表达于辐射后14、21d高于R组,Fn的表达于辐射后7、21d高于R组(P<0105)。提示,GEN可通过减小辐射导致的BMSCs损伤、促进受损的BMSCs增殖分化和细胞粘附分子VCAM21、Ln、Fn等的表达,改善BMSCs与造血实质细胞的粘附作用,进一步影响造血细胞的存活、定居、增殖、分化、发育和成熟,从而达到辅助机体造血重建的目的。该作用可能是GEN防护放射性造血损伤的重要作用机制之一,为其预防放射性造血系统损伤、改善骨髓微环境提供了理论依据。参考文献:

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(编辑　汪勤俭)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/vuuj.html