毕业设计正文（改完版）-李云浩(1) - 图文

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摘 要

目的：地木耳(Nostoc commune vauch)是属于藻类蓝藻纲念珠藻科(Nostocaceae)，

全球广泛分布，资源十分丰富。已有研究表明地木耳含有丰富的氨基酸、糖苷、维生素、钙、磷等，在抑菌、抗氧等方面具有很高的活性。而近些年来，有很多关于多种植物、真菌多糖抗肿瘤领域的研究。随着地木耳以药材的身份逐渐走入了研究人员的视野，地木耳多糖的药理药效也开始得到重视。本课题拟针对地木耳多糖的抗肿瘤活性开展研究。

宫颈癌是女性患者常见的恶性肿瘤之一，原位癌高发的年龄为30～35

岁，浸润癌为45～55岁，而且近年来其发病更有向年轻女性发展的趋势，已是女性患者的一大杀手，而肿瘤细胞的侵袭和转移是导致放疗、化疗失败的主要因素。本实验利用多糖组和对照组宫颈癌细胞培养，并通过划痕实验，确定地木耳多糖对宫颈癌细胞侵袭的作用效果。

方法：首先，用水醇法按照60：1液料比，温度控制在90℃，反复提取三次，合

并提取液抽滤，并进行浓缩。加入无水乙醇，低温过夜。离心，取沉淀，并用savege试剂去除蛋白，干燥成粉末。然后绘制葡萄糖标准曲线，测出提取多糖的含量。将地木耳多糖配制成三种不同浓度溶液，加入宫颈癌HeLa细胞培养皿中，进行划痕实验，培养0、6、12、24、48小时后观察划痕的修复。最后进行统计学处理。

结果: 本实验利用水提法对地木耳进行提取，提取率为7.86%。地木耳多糖有抑制

宫颈癌Hela细胞侵袭的作用，在三种浓度中，40μg/ml的抑制效果强，并且具有剂量依赖性。

结论：地木耳多糖可抑制宫颈癌Hela细胞的侵袭能力，有望用于宫颈癌的治疗。 关键词：地木耳 多糖 宫颈癌 侵袭

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Abstract

Objective：Nostoc commune Vauch commonly known as Nostoc commune, Nostoc commune is a global wide species, mainly distributed in Karst karst area and limestone karstzone in Karst district. Nostoc contains a lot of amino acid, glucoside, vitamin, calcium, phosphorus. In recent years, there are many researches on polysaccharides efficacy in this direction. With the fungus medicine identity gradually into there search field of vision, pharmacological effect of polysaccharides of Nostoc commune also get attention.

Cervical cancer is one of the most common malignant tumor of female patients, in some cancer at the age of 30 to 35 years of age, invasive carcinoma was 45 ~ 55 years old, and more in recent years the incidence to the development trend of young women. Tumor invasion and metastasis is one of the main lethal factor. This experiment using polysaccharide group and control group to determine the effect on cultured cervical cancer cells.

Methods: Firstly, water alcohol method according to the 60:1 ratio of liquid to solid, temperature control in 90 ℃, repeated extraction. Repeated three times of extraction, merging the extracted liquid filtration, and concentrating. Adding anhydrous ethanol, cold night. Centrifugal, and precipitation, and Savege reagent was used to remove protein, drying into powder. Secondly, draw the standard curve of glucose, measure the content of polysaccharides extracted from. The fungus polysaccharide preparation of three different concentration solutions, adding to cervical cancer HeLa cell culture dishes. For wounding healing test, HeLa cell cultured for 0, 6, 12, 24, 48 hours. Finally, statistical analysis.

Results: To the Nostoc polysaccharide solution inhibited the invasive cervical carcinoma Hela cells, and 40μg/ml of the strongest inhibitory effect of the Nostoc polysaccharide.

Conclusion: after the processing, compared with the control group, the experimental findings, Nostoc polysaccharide solution, reduce the ability of cells to repair the scratches, as shown in figure shows more of Nostoc polysaccharide suppresses the motion ability of cervical cancer cell line. Key words: Nostoc commune polysaccharide cervical cancer invade

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目录

1 问题的提出 .......................................................................................................................... 1

1.1 研究的背景 .......................................................................................................................... 1 1.2 研究的目的和意义 ............................................................................................................... 1

2 文献综述 ................................................................................................................................ 2

2.1 地木耳的研究进展 ............................................................................................................... 2 2.1.1地木耳的性状.................................................................................................................... 2 2.1.2 地木耳的营养成分 ........................................................................................................... 2 2.1.2.1 蛋白类 .......................................................................................................................... 2 2.1.2.2 脂类 .............................................................................................................................. 3 2.1.2.3 氨基酸类....................................................................................................................... 3 2.1.2.4 多糖类 .......................................................................................................................... 3 2.1.2.5 维生素类....................................................................................................................... 4 2.1.2.6 矿物质类....................................................................................................................... 4 2.1.2.7 色素类 .......................................................................................................................... 4

2.1.3 医药领域 .......................................................................................................................... 5 2.1.3.1 地木耳在医药中的功效 ............................................................................................... 5 2.1.3.2 地木耳的药理作用研究进展 ....................................................................................... 6 2.1.4 食品领域 .......................................................................................................................... 7 2.1.5 保护环境 .......................................................................................................................... 8 2.1.6 农林牧业 .......................................................................................................................... 8

2.2肿瘤侵袭机制........................................................................................................................ 8 2.2.1 肿瘤 .................................................................................................................................. 9

2.3天然抗肿瘤活性物质研究现状 .......................................................................................... 10 2.4 划痕实验 ............................................................................................................................ 11

3 研究方法 .............................................................................................................................. 13

3.1 材料与仪器 ........................................................................................................................ 13 3.1.1 材料 ................................................................................................................................ 13 3.1.2 仪器 ................................................................................................................................ 13

3.2 地木耳多糖的提取 ............................................................................................................. 13 3.2.1 绘制标准曲线................................................................................................................. 13 3.2.2 地木耳的提取................................................................................................................. 14 3.2.3 Sevage试剂除蛋白纯化及浓缩 .................................................................................... 14 3.2.4 地木耳多糖提取率及其含量的测定 ............................................................................. 14

3.3 多糖溶液的配制................................................................................................................. 14 3.4 HeLa细胞分板培养及划痕实验 ........................................................................................ 14 3.4.1 试剂及设备..................................................................................................................... 14 3.4.2 细胞培养 ........................................................................................................................ 15

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3.4.3 地木耳多糖抑制Hela细胞侵袭活性检测 ................................................................... 22 3.5 实验结果 ................................................................................................................................. 23 3.5.1地木耳多糖含量测定 ...................................................................................................... 23 3.5.2 抑制Hela细胞侵袭活性检测 ....................................................................................... 24

4 结论和建议 ........................................................................................................................ 27 参考文献 .................................................................................................................................... 28 致 谢 ............................................................................................................................................. 29

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1 问题的提出

1.1 研究的背景

肿瘤侵袭扩散是恶性肿瘤的主要特征之一。具有浸润性生长的恶性肿瘤，不仅能在原发部位迅速生长，然后直接蔓延。而且肿瘤还可以通过侵袭等各种途径扩散到身体其他部位（转移），从而导致无法彻底的根治。肿瘤的侵袭扩散能力是肿瘤无法彻底根治的关键。

目前国内和国外对地木耳（Nostoc commune）的化学成分、生物活性和开发利用等研究正处于开始阶段, 对地木耳营养成分进行了一些初步的研究,但是研究结果差别相对较大，不宜采用;对地木耳的化学成分并未进行系统研究,其活性成分的构成及生物活性还有待深入研究;有关化学成分的纯化分离、结构的分析鉴定、活性检测等研究同样不够;针对地木耳功能食品、药品和环保产品的研究开发不够,其资源的综合利用有待进一步发现和探索。

1.2 研究的目的和意义

本课题“地木耳多糖抑制人宫颈癌侵袭能力实验研究”是研究Nostoc commune当中的多糖成分可能具有抑制宫颈癌侵袭的能力，对阻止癌细胞侵犯临近组织和细胞进而转移扩散全身具有重要的意义。原材料地木耳产地遍布多省，资源丰富，容易采集获得。而近些年来，有很多关于多种植物、真菌多糖抗肿瘤领域的研究。本课题研究地木耳多糖抑制人宫颈癌细胞侵袭能力，为抗癌药品的研发和推广、临床及应用提供新的思路。

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2 文献综述

2．1 地木耳的研究进展

2.1.1地木耳的性状

别名：天仙米、地皮菜、地耳等，为念珠藻科植物葛仙米的藻体，是真菌和藻类的结合体。多生于潮湿的地面、墙根以及静水面，夏季雨后湿地表面上最为常见，各省各地均有分布。此外，其富含蛋白质、多种维生素和磷、锌、钙等矿物质，可食用，亦作药用。

繁殖方式主要是异形胞将藻丝隔成若干个小段，叫藻殖段，极易从异形胞处断开分离，每个藻殖段再通过细胞分裂生长成长的丝状体。地木耳的这种以藻殖段进行繁殖的方式，也属于营养繁殖的一种增殖方式。地木耳（Nostoc commune）可固氮，也可食用。 地木耳由真菌和藻类结合而成的结合体，一般生长在光线稀少的阴暗潮湿地方，暗黑色，有点像泡软的黑木耳，藻体比黑木耳薄。多生于潮湿阴暗的土壤表面和静水当中，夏季雨后湿地面上最常见，而且各地均有分布。中国清代王磐编纂的《野菜谱》中，收录了滑浩一首名为《地踏菜》的词曰：“地踏菜，生雨中，晴日一照郊原空。庄前阿婆呼阿翁，相携儿女去匆匆。须臾采得青满笼，还家饱食忘岁凶。”这首歌谣记述了生长出的地木耳充饥救荒的情景。由此可见，地耳从古至今，就是饥荒年头重要渡荒的天然野生藻类，拯救过千万的劳苦大众，是大自然恩赐的佳品，它为广博大地上的人们立下了不可磨灭的功绩。

2.1.2 地木耳的营养成分 2.1.2.1 蛋白类

国内关于此类的文献也指出,地木耳（Nostoc commune）中蛋白质含量一般占干重的14.6%-21.81%,Maria Portia P.Briones等研究报道,地木耳中的蛋白质含量占干重的22.8%-28.7%,蛋白质的含量和地木耳的生长环境地域有关,并且发现地木耳（Nostoc commune）中含有可消化性很高的蛋白质,是多肽类物质的储存和来源。一些研究发现一种血红蛋白存在于Nostoc commune当中,取名cyanoglobin。这种血红蛋白结合氧分子的方式是可以逆转的, 它有较为厉害地和氧亲和力,但同时氧化的速度和X因子损失的速度也很快。Donna R.Hill等发现这种血红蛋白属于一种胞外蛋白。在经过了休眠多年的荒漠藻中Breanne Shirkey等得到活性强的含铁超氧化物歧化酶(SODF),这些SODF可以清除细胞外的超氧自由基，而这种自由

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基由多糖在UV照射下生成的。可以测定出了SODF的氨基酸的排列方式,并且减少紫外线间接损伤细胞。此外其他文献指出，地木耳还含有肌红蛋白等人体需要的蛋白质。 2.1.2.2 脂类

Nostoc commune是低脂肪藻类食品, 粗脂肪含量大约在0.2%-4.28%左右,因此可以作为低脂肪保健品。Patti Ann Ta-ran to等研究发现地木耳中含有一定数量的含硫黄糖脂质、半乳糖甘油二脂以及双半乳糖基甘油二脂、磷脂和磷脂酰甘油、和单葡萄糖基甘油二脂。研究表明地木耳中可以提取出一种新的脂肽,其分子式为 C48H76O18N10,一个异常的氨基酸和一个含有羟基、氨基的硬脂酸在此结构中,此结构的硬脂酸和氨基酸具有一定的抗真菌活性。再次研究发现表明，水的重吸收可以加快生物合成地木耳中脂质等脂类。 2.1.2.3 氨基酸类

地木耳（Nostoc commune）含有18种氨基酸,其中人体必需的8种氨基酸含量更为丰富,相互间的成分含量比例与人类个体需要量十分接近。总氨基酸含量也高于猴头、木耳等中氨基酸的含量,与发菜、香菇中氨基酸的含量相近。Rajeshwar P. Sinha等发现地木耳中含有霉孢菌素样氨基酸(MAA),利用高效液相色谱研究发现,这种物质包含丝氨酸组和甘氨酸组,在334nm处有一个最大吸收峰值,其保留时间大约是2.8分钟。 2.1.2.4 多糖类

地木耳（Nostoc commune）的总糖含量是0.53%-23.8%,钱信忠等科学家研究报道地木耳含有单糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖等多糖包括海藻糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、果胶多糖类、葡萄糖苷等以及细胞胞外多糖等多种糖类。用蒽酮比色法粗略估算地木耳中可提取的海藻糖的含量大约为0.24mg/g( 鲜重)。运用色谱法薄层层析分析方法研究发现地木耳中含有大量的海藻糖,盛家荣等对地木耳多糖（Nostoc polysaccharide）进行了研究,粗提取出来的多糖经过

QAE-Sephadex-A-25层析得到几种水溶性多糖分别是，SP-1,SP-2,SP-3。又通过一种特殊的薄膜电泳方法进行Sephadex-100的层析,发现当中的均一多糖是SP-2,用高效液相色谱测定SP-2的相对分子质量为8.8×104,通过GC测定表明它是由单糖葡萄糖为单元组成,红外光谱显示SP-2为B-D-吡喃糖苷键构成,并且对其活性进行测试,结果测试证明地木耳多糖能促进一些植物种子的发芽速度。

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有关文献报道，研究验证了多糖提取的最佳工艺条件,即提取温度98℃、提取时间3.8h,提取次数在3-5次，在此条件下水提水溶性多糖的最大提取率为 7. 91%; 研究酸提水溶性多糖和碱提水溶性多糖均是按照地木耳利用水提法提取的,SP的提取率要比JP的提取率低,有实验证明SP由一种单糖（葡萄糖)构成的单一多糖,属于葡聚糖的一种,JP由木糖和葡萄糖这两种单糖所构成,所以JP是属于杂多糖。国外针对地木耳粘性胞外多糖(EPS)展开了研究,利用分光法和层析法结合测定出粘性EPS是一种以木质半乳糖葡聚糖(xylogalactoglucan)作为骨架,D-呋喃核糖和D-葡萄糖醛酸也连在骨架上。国外相关文献研究发现结合水分子流失经常不正常地在地木耳的胞外多糖上发生,而结合水分子流失速率和其亚显微结构和组成结构密切相关。有研究发现在缺水的环境下地木耳膜囊的融合能很好的被这些胞外多糖抑制,从而使地木耳（Nostoc commune）的抗旱性有效的提高。此外国外科学家们发现地木耳（Nostoc commune）是未来膳食纤维的主要供应。 2.1.2.5 维生素类

通过人们研究发现，生长在干燥地区的地木耳还含有多种维他命,例如维他命C、维他命 B1、维他命B2、维他命A和维维他命E。国内学者有报道地木耳中VB1、C、B２的含量很高，而且易于获得。贺宝珍等测得维生素各类的含量均不低，其中维生素C的含量尤为丰富，目前为止，地木耳中的VC在菌藻类食物中非常高。跟紫菜相比，大约可达紫菜中含量的19倍左右。 2.1.2.6 矿物质类

不仅在其他营养物质上面含量丰富，地木耳（Nostoc commune）含有多种矿物质例如钾、钠、钙和硒等人体所必须的微量元素,这些微量元素和其他常量元素都是人体不可缺少的，维持生命的物质。地木耳含钙量高,多食易壮,可使得小儿佝偻病和成人骨质疏松病及上消化道出血症得到预防和治疗。含铁量也相对比较高, 长期食用,可预防和缓解婴幼儿和孕妇缺铁性贫血症。这就说明了从膳食中摄取的微量元素要比通过人工合成的药物补给更容易被人体吸收利用。 2.1.2.7 色素类

藻类所含色素大致可分为三部分:类胡萝卜素、叶绿素和藻胆蛋白。地木耳中含有叶绿素A、B-胡萝卜素(B-caroteme)、4,4-C-二氧-B-胡萝卜素、4-氧-B-胡萝卜素和玉米黄素,还有眉藻黄素、海胆酮和念珠藻黄素。S.scherer等研究发现地木耳提取物中含有一种新的色素，用作于紫外线的防护。相对分子质量在

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1500-3000之间,有多糖的结构特征,地木耳中这种抑制紫外破坏的色素含量很高,占Nostoc commune干重十分之一上下。更深一步研究表明，地木耳色素中的合成过程中发现这种防护色素,紫外线照射能使地木耳胞外多糖被诱导生成,与此同时紫外线的照射能促进类胡罗卜素的增加,特别是对海胆酮和阿叶黄素这两种化合物的生成增加,但是研究结果表明对叶绿素A没有明显的影响。利用这种保护色素制成的美容防护产品可有效的阻止UV对人体皮肤的危害。 2.1.3 医药领域

2.1.3.1 地木耳在医药中的功效

地木耳（Nostoc commune）在国外科学家的一系列的试验当中，被提取出一种类似草酸类的物质,这种物质可溶。在实验过程中这种物质对老鼠有降胆固醇作用,而且没有毒副作用。《中国医学大辞典》等书记载,地耳具，明目益气的功效。全部藻体皆可入药,味甘，性寒,可以清热解读，润珠明目、令人有子，收敛益气之功效。其中含有维生素A，所以用作治疗夜盲症；对久痢脱肛等病症皆有疗效；目赤红肿，食之明目；干燥，研成粉末,加之植物油调理外用,可治疗烧伤和烫伤。有专家认为原有药方中可用地木耳代替的其他药材如：黑木耳或白木耳。来使得精神或神经方面的疾病得以缓解。《本草纲目》记载地皮菜（地木耳，Nostoc commune）具有补护心腑，清理肠胃,长时间食用可以美白补气,使人面色红润,返老还童等功效,是一种营养健康野菜品种。其他研究发现地木耳中提取出几种二萜类化合物这几种化合物对某种芽孢杆菌、某种葡萄球菌和大肠杆菌Ecoi也有相应抑制作用,其中一种二萜类化合物C型对抑制大肠杆菌的作用可以与其他抗生素的作用效过相类似而二萜类化合物E型抑制表皮葡萄球菌的作用可以达到氯霉素的抑菌效果。地木耳中含有一种具有抗菌活性的胞外二萜类化合物,对于某种葡萄球菌和某种芽孢杆菌来说这种化合物的抗菌作用甚至比对照品氯霉素强, 而对大肠杆菌的抗菌作用也相对来说要好的多。地木耳还含有三种代谢物都是具有抗菌活性的,其中一种是第一次作为天然产物被证实的,一种是从地木耳中得到的蒽醌类化合物,另外一种对某种葡萄球菌的抗菌作用强度达到了氯霉素的水平,这三种物质均对某种芽孢杆菌、大肠杆菌和某种葡萄球菌也有抑制效果。国外研究报道抗真菌活性的脂肽(nostofungicidine)也被从地木耳当中提取获得，这种抗真菌效果的化合物对白曲菌有抑制效果。下面列举几个地木耳作为药膳的功效：

1．降脂明目。地木耳（Nostoc commune）是一种非常实用的低脂肪营养保健

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菜，能降脂减肥。同时，对目赤、夜盲、脱肛等病症缓解和治疗也有一定疗效。

2．清热降火。地木耳性寒而滑，具有清热解毒的功效，内服外用皆可。还能辅助治疗烫伤、烧伤及疮疡肿毒。

3．补充营养。地木耳含有非常丰富的氨基酸蛋白质、钙、磷、铁等，可为人体机能提供多种营养成分和能量。还具有补虚益气，滋养肝肾的作用。

药用：以全藻体入药。夏秋雨后采摘收集，清洗干净，除去杂质，新鲜利用或晒干使用。可以口服。据《全国中草药汇编》介绍，地木耳（葛仙米）“性寒、味淡，有消热、收敛、益气、明目之作用，主治脱肛、夜盲症；外用可治烧伤、烫伤等病症，护肤美容也有疗效。”功能与主治,清热，明目，益气，收敛。用于夜盲症。主治目赤红肿，夜盲，久痢，烫火伤，脱肛等病症。性味与归经,淡，寒；味甘，性凉；入肝经。用法与用量,50g-100g；外用适量，研粉调敷患处。相传在东晋时期，医学家、道教理论家、炼丹术家葛洪隐居在南土时，灾荒之年便采以为食，偶获地木耳健体之功能。后来葛洪入朝以此为宝献给皇上，体弱多病的太子食后药到病除，再服，则体壮精益，皇上为感谢葛洪之功，随将天仙米也就是地木耳赐名“葛仙米”，并沿称至今。

现代的《秦巴山区天然药物志》、《陕西中草药》、《四川中草药志》等也有相似记载。民间常用来治夜盲、丹毒、烫火伤、皮疹赤热、久痢脱肛、痔疮等症。如新鲜炒食，可缓解夜盲和牙痛；白糖浸泡而凉食，能医脱肛；与糯米饭、鸡汤等熬粥，可补血益气；用其焙干研成粉末调菜油外敷，可治烫火伤。现代药理研究也可以证明：地耳用于食疗，功效卓著。地木耳含有15种氨基酸，多种维生素和其它自然食品不及而人体必须的微量元素Mn、Ca、Zn、Fe、P等矿物质成份。 2.1.3.2 地木耳的药理作用研究进展 1.抗氧化的作用

在实验质量浓度范围内,地木耳多糖对DPPH自由基的清除率随其质量浓度的增加而提高.质量浓度0-0.4mg/ml范围内,地木耳多糖对DPPH自由基的清除率迅速提高,在0.4-1mg/ml范围内清除率呈现平稳提升的趋势,最高可达66.35%. 2.抗辐射作用

地木耳天然提取物当中含有伪枝藻素、类菌孢素等具有超强抗辐射作用的物质。自然光下的紫外线能破坏人体内的表皮蛋白，核酸，使其化学键断裂导致DNA突变诱发皮肤炎症，甚至皮肤癌，同时刺激黑色素形成，进而形成黑斑，雀斑等

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各种色斑。目前应用于紫外线防护的物质大致分为两类：物理阻隔剂和化学吸收剂，这些物质可以通过化学合成如氧化锌，水杨酸酯等，也可在动植物体内天然提取如黄芩苷，芦丁，类菌孢素氨基酸，伪枝藻素等。地木耳中的抗辐射的色素类菌孢素和伪枝藻素含量在12%左右，含量也丰富。[7] 3.抗癌作用

文献报道称，根据对来自中国中西部荒漠地区存在的两种地木耳(Nostoocommune)进行研究，并对其生物活性物质简单地进行了筛选,初步对包括水、乙酸乙酯等为溶剂的粗提物进行试验，并且验证了其抗肿瘤的活性。[8]何松等人分别以肺癌A549和肝癌7721作为材料,并通过实验进行体外抗肿瘤活性检测发现,地木耳乙酸乙酯提取物对这两类癌细胞的细胞毒性效果最强，分别为每毫升24.79微克地木耳提取物和每毫升51.33微克地木耳提取物。而进一步实验证实乙酸乙醋相中含量比较高的成分有两类物质：分别是粗黄酮和粗多酚,而其含量分别为4.57%和12.06%；地木耳石油醚相的提取物中粗黄酮的含量比较大,约为6.75%。

利用硅胶柱层析对地木耳乙酸乙酷相提取物再次进行分离纯化,得到几个洗脱部分，其中第4部分表现出很高的抗肿瘤活性，而且其中的粗多酚及粗黄酮含量很高,分别达到21.30%和70.71%,这便说明地木耳的活性物质中的粗多酚及粗黄酮类物质可能是具有抗肿瘤作用。[9]

另外有报道指出，将地木耳的水提物配制成一定浓度的多糖溶液，可以对体外培养宫颈癌细胞的增殖及扩散有抑制作用，从而抑制癌细胞扩散。这种水提物通过蒽酮试剂定性试验，已经证明其属于地木耳粗多糖。并且通过水提法提取的地木耳多糖，其提取率占9%-12%左右。 4.抑菌作用

地木耳多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有一定的抑制效果,且作用相当明显。但是都不如阳性对照品抗生素阿莫西林的抑菌效果强。随着多糖质量浓度的增大,抑制作用也逐渐增强；最小抑制浓度MIC在125-259μg/ml之间。地木耳对金黄色葡萄球菌的抑制作用表现的不明显。由此可见，在对这3种微生物的试验中，地木耳多糖对微生物的抑制作用是具有选择性的。[3] 2.1.4 食品领域

在我国许多省市地区, 地木耳（Nostoc commune）的利用方式是以食用型野菜营养资源为用途的。地木耳含有很多种类，比如氨基酸类、多肽蛋白质类、单

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糖以及多糖类、供人体利用的微量金属元素和少量的脂肪类、各种色素类, 成为氨基酸和纤维素丰富的来源之一。利用绿色保健的地木耳可以向保健功能性饮料或天然绿色食品方面研发, 例如以Nostoc commune为原料,按黄豆酱、米粉或者面粉、地木耳粉末一定的比例,辅以辣椒、麻椒等调味,便可以生产制作成风味地皮菜辣椒酱。 2.1.5 保护环境

资料显示地木耳生长区域广，易采集,成活的地木耳对大气污染也十分敏感,有研究表明，将地木耳挂袋暴露于空气中,选择地木耳的伤害面积、含硫量、PH值为主要监测指标,通过地木耳对大气污染的监测,同时以地区大气环境质量综合指数为参照,用模糊数学方法对大气环境质量作出综合评价。结果表明,地木耳的多指标模糊综合评判法与综合指数法一致,具有较高的可信度。杨学山等用荒漠藻地木耳挂袋法监测大气SO2污染,研究结果发现地木耳的含硫吸收量与大气SO2污染之间存在一定的相关性,该法有许多优点,可以把地木耳开发作为大气污染的监测器。

2.1.6 农林牧业

地木耳种属为固氮念珠藻类,既能合成固定氨从而使空气中的游离氮得到固定,又能进行固定二氧化碳的光合作用。在自然的条件下,地木耳可以与同种其他固氮藻类一样作为十分重要的分解者来为自然作物提供氮肥,可以开发成为一种新型的肥源。有些地区利用野生的地皮菜作肥料种地,比如说将其和所堆积的草皮一起混合作为堆肥，这样可以使地木耳中含有的生长促进剂作用在农作物上促进产量。有研究报道称多种农作物和花卉植物的生长在一定浓度的地木耳提取物的作用下，其生长可有明显的促进。有文章报道地木耳中含有起促进作用的物质，而这个物质被证实是地木耳（Nostoc commune）多糖。

2.2肿瘤侵袭机制

在我们的环境、饮食中存在许多诱变致癌因素。1.机体防御组织的功能降低，(l)人体外界防线，如头发，绒毛等均能排除和阻碍致病因素的侵入,当这些屏障发生破坏就容易发生肿瘤扩散,皮肤癌就是很好的例子。(2)正常菌群失调:体内菌中有的与致病菌拥有共同的抗原,有的能合成各类维生素，抗生素和细菌毒,所以有利于宿主抗病作用。(3)解毒，排毒能力降低:免疫系统的识别、清除以及修复能力降低,导致肿瘤病情的发展。3.内外致病因素联合战胜防御能力。2.致病因子，

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(1)环境(外界)致病因素的影响：生物致病因素，病毒方面如，乙肝病毒等；细菌方面如，幽门螺旋杆菌等。物理致病因素，放射线照射方面如，钴-60的持续照射；化学致病因子:多环芳烃类的化合物如苯丙胺、再如，亚硝胺、黄曲霉素、乙烯雌酚等长期接触可以引起肿瘤。必需营养元素缺乏也可以使人患癌；微量元素如果不足，如缺硒元素或者维生素类的长期缺乏也可诱发人体发生癌变。(2)机体(宿主)内部致病因子:遗传基因的缺陷，容易发生P53基因突变，可能使得造血器官，乳腺，胧，肝，脑，膀，肺和结肠发生常见癌变。精神刺激，在英国的一个报告会上面有报告称，二百多例恶性肿瘤患者中患癌前直接受过严重精神刺激的就有65%左右。 2.2.1 肿瘤

肿瘤是一种极不正常的肿块或组织,生长速度快,与正常组织不协调,受到刺激还会继续生长。肿瘤分为良性和恶性,良性肿瘤不是致命的。恶性肿瘤即癌,癌的发生和发展分致癌的启动(initiationofeareinogesis),促癌(promotion)和癌的形成和发展(development)三个阶段。它首先局部浸润周围组织,还能通过血液和淋巴系统转移到其他组织\侵袭!转移行为是恶性肿瘤的本质特征。癌侵袭(invasion)是指癌细胞脱离原发生长部位,突破基底膜和细胞外基质构成的屏障,侵袭毗邻的组织。首先癌细胞通过膜表面的受体与基底膜、基质成分如层粘连蛋白(laminin)、纤维粘连蛋白(fibroneetin)和胶原蛋白(eollagen)等结合,然后癌细胞分泌或诱导间质细胞分泌多种蛋白酶降解基底膜和基质,最后定向运动穿越破损的基底膜的基质部位\转移(metastasis)即癌细胞借助血管、可分为:a.原发瘤增殖,肿瘤新血管生成;b.肿瘤细胞侵袭毗邻的基底膜!基质和正常细胞;c.癌细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活;d.癌细胞栓塞、滞留于远隔靶器官的微血管中并增殖;e.癌细胞穿出血管或淋巴细胞,在靶器官内形成微转移灶;f.肿瘤间质内新血管生成,转移瘤快速生长。 2.2.2 瘤细胞从原发瘤体脱落

肿瘤形成以后，通过所在器官的弥散获得最初的生长营养，细胞逐渐分化、增生。当瘤体直径达到2mm以上，增殖生长要靠足够的血液供应。研究证明肿瘤细胞及间质细胞释放促血管生成的因子如血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor ,VEGF）,血管形成素（angiogenin），成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF),白细胞介素-8（interleukin-8），

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血小板来源的内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor, PD-ECGF）等。这些因子使内皮细胞迁移、增殖形成管腔结构，最终在瘤体内部形成微血管网。

已有结果证明瘤细胞之间相互黏着的能力较正常细胞为低，透射电镜显示多种肿瘤细胞的桥粒、半桥粒和间隙连接数量减少。细胞内的钙含量也减少，这些都是构成粘附力降低的原因之一。另外还有报告瘤细胞表面电荷密度增加，相互排斥力加大，尤其是转移率高的细胞电泳率增高，这使得瘤细胞从瘤体脱落的可能性增加。 还有细胞表面的某些粘附分子缺失令细胞间连接遭受破坏，也有脱落的危险。

2.2.3 瘤细胞侵袭周围组织

肿瘤扩散发生最初是侵袭，而侵袭发生之后就会导致一个结果，就是扩散。瘤细胞在侵袭的过程中间，是先从母体细胞中脱落分离，然后在向临近组织侵袭，不过有研究表明这两种运动也可同时进行。在十九世纪鲁道夫·路德维希·卡尔·菲尔绍就提出了突变之后的癌细胞具有类似于阿米巴虫伸出借以向各方向运动的伪足，故移动迁移速度比非恶性肿瘤细胞快。目前已有多位学者提出，在肿瘤细胞可以利用伪足运动来完成侵袭周围组织的这一过程。这个过程当中，肿瘤细胞的表面将分泌多种物质因子，使得癌细胞改变相应的骨架，从而完成固定向其他组织器官侵袭扩散的运动。【5】

2.3天然抗肿瘤活性物质研究现状

2.3.1 广泛的天然抗肿瘤活性研究

目前,化疗药物广泛应用在大部分的抗肿瘤前线,具有很大的副作用和细胞毒性,而且耐药性就是由于这些化疗药物在与恶性肿瘤细胞长期接触后而产生的;上述问题几乎不会发生在天然抗癌提取物当中,天然产物不仅对身体的负面影响远远小于以往抗肿瘤药物,副作用伤害小的抗肿瘤新药的发展也有非常广阔的前途。所以,开发绿色的抗肿瘤活性物质也逐渐被提上了日程。[5]

如今已天然抗肿瘤活性物质被筛选得到也比较多,许许多多的抗肿瘤的作用原理也都差不多。比如说，紫杉醇（自中华紫杉分离的）能够对微管蛋白作用,最终使得细胞破裂凋亡。从Green tea中提取出的有效成分聚酷型儿茶素,能诱导HL-60细胞向稳定成熟细胞分化；人参皂苷Rg3是存在于中药人参中的四环三帖皂苷,其分子式为C42H72013,它可通过对肿瘤细胞新生血管形成的阻断,诱导细胞调亡，

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从而达到抗癌疗效；再如，灵芝和灵芝的有效成分可增强免疫系统的巨噬细胞的吞噬功能,促进T淋巴细胞增殖,增强免疫T细胞的细胞毒副作用；斛皮素(quercetin)是一种黄酮类物质，广泛存在的生物体内,是自由基的捕获剂和抗氧剂,减轻氧自由基对细胞的损害可能是其抗癌和防癌的机制；金爱康片剂,是一种天然钙拮抗剂，它是由汉防己甲素制成，而汉防己甲素是汉防己的根部分离出来的有效成分。研究显示表明单独使用化疗药物治疗恶性淋巴癌等急慢恶性肿瘤的缓解作用比它与化疗药物合用效果差很多。[6] 2.3.2 藻类抗肿瘤活性物质的研究

藻类植物含有许多抗肿瘤的活性物质，其中所含多糖是其有效成分，藻类多糖可以直接的或间接的抑制癌细胞增殖和侵袭。1，可通过对淋巴细胞的刺激并使其增殖；对巨噬细胞活性的提高；或者增强吞噬指数的方式，提高机体免疫细胞抑制癌细胞的能力。2，可通过增强红细胞膜的流动性，抑制癌细胞通过血液途径侵袭或转移，并抑制癌细胞增殖。

通过对曲显俊等螺旋藻多糖体内和体外抗肿瘤研究分析发现，钝顶螺旋藻多糖对白血病细胞有46.0%抑瘤率，对乳腺癌细胞有68%的抑瘤率。当螺旋藻多糖浓度达到300mg/kg时通过灌胃给药的方式对小鼠进行灌胃。结果发现，此浓度的螺旋藻多糖对小鼠肉瘤有55.2%的抑瘤率。在体外抗肿瘤实验过程中，周岩冰等研究发现，螺旋藻多糖能够抑制体外培养的直肠癌细胞、结肠癌细胞及胃癌细胞,而且一定范围内的抑制率和浓度呈线性关系,螺旋藻多糖在20mg/l剂量下时,对结肠及直肠癌细胞抑制率为42.04%。[10]

对羊栖菜中提取的羊栖菜多糖研究发现，其可以对特定的肿瘤血管内皮细胞的增殖起到抑制作用，而这种特定肿瘤被证实是人体体外培养的肺癌细胞所诱导的。

海带根中的一种抗乳腺癌物质，对其研究表明其为一种氨基酸。长叶海带能够明显延长同种同系淋巴细胞白血病的小鼠的生命延长率。[11]

2.4 划痕实验

细胞划痕实验是指将细胞培养到相互融合后再用无菌枪头在孔板中央区域画一条直线,导致这条直线内的细胞被物理机械力去除掉,用无菌PBS液洗干净,在培养液中继续进行培养,并观察细胞向划痕区域侵袭迁移的情况。通过细胞向划痕移动并使划痕宽度缩减的程度确定细胞的迁移运动能力。细胞划痕实验的优点是,实

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验成本低,而且是一种简单易操作地检测细胞运动能力的基本方法，常用于评价肿瘤细胞的侵袭转移能力。

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3 研究方法

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料 试剂：蒸馏水；

无水乙醇（分析纯）； 浓硫酸（分析纯）； 氯仿（分析纯）； 葡萄糖（分析纯）； 正丁醇（分析纯）； 蒽酮（分析纯）；

药材：干地木耳（青海海东地区野生地木耳）； 3.1.2 仪器

紫外分光光度计（上海分析仪器厂，型号721）；

多功电子恒温水浴锅（上海凯乐电紫设备厂，型号SYG系列）； 电子分析天平（上海明桥精密仪器有限公司，型号FA1004N）； 低速台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司，型号:FYL-YS-30L ）。 旋转蒸发器（型号为RE—2000A，巩义市予华仪器有限公司）； 双人净化工作台（型号为HJ—CJ—2D,）；

3.2 地木耳多糖的提取

3.2.1 绘制标准曲线 (1）标准曲线的制作：

2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于浓H2SO4（A.R.95.5%），现配现用。0.1g/L葡萄糖溶液：准确称取标准葡萄糖0.01g，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL容量瓶中。

分别取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，然后向其中加入双蒸水配制至1.00mL；分别加入4.00mL蒽酮试剂，放置在冰水浴中迅速冷却，然后再沸水浴，直至在沸水浴中煮沸，管口应该密封完好，以防试剂挥发。煮沸持续10分钟，然后将其取出，快速冷却至室温，放置大约10min，在可见光分光光度计620nm处进行比色比色。空白项是以相同方法处理的蒸馏水，

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然后比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。以糖的含量（μg）为横坐标，OD值为纵坐标，自作出标准曲线。 3.2.2 地木耳的提取

准确称取地木耳粉末20.00g放入1000ml的原地烧瓶中，加入700ml的蒸馏水。连接好冷凝装置。将装置放入90℃的水浴锅中固定，连续提取3个小时，将提取液过滤，滤渣放入瓶中继续提取2个小时，滤出滤液。合并上清液，减压过滤后再利用旋转蒸发仪将上清液浓缩至20ml。加入60ml的无水乙醇，搅匀，静置在4℃低温冰箱过夜。

3.2.3 Sevage试剂除蛋白纯化及浓缩

取出地木耳多糖溶液，放入2000G，10℃高速离心机中离心15分钟，收集沉淀物。取地木耳多糖沉淀物加入4mLSavege试剂在振荡器中震荡20min，静置，取上清液，弃去下层溶液。再加入4mLSavege试剂，相同操作连续5次。除蛋白后放入减压干燥箱40℃烘干成粉，密封保存。 3.2.4 地木耳多糖提取率及其含量的测定

（1）地木耳多糖的测定：

将地木耳多糖稀释，取出1mL加入4mL蒽酮试剂，放置在冰水浴中迅速冷却，然后再沸水浴，直至在沸水浴中煮沸，管口应该密封完好，以防试剂挥发。煮沸持续10分钟，然后将其取出，快速冷却至室温，放置大约10min，在可见光分光光度计620nm处进行比色比色。空白项是以相同方法处理的蒸馏水，然后比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。

（2）提取率及纯度测定：提取率的计算：用测得的多糖质量除以20.00克，即为多糖的提取率。

3.3 多糖溶液的配制

取出去除蛋白后的地木耳多糖干燥粉末0.4035g，加入2.36ml蒸馏水，和2.60ml的pbs缓冲液以及双抗，溶解成溶液。分别配制成10μg/ml,20μg/ml和40μg/ml三种浓度的地木耳多糖溶液，放置在37℃的恒温培养箱。

3.4 HeLa细胞分板培养及划痕实验

3.4.1 试剂及设备

胰蛋白酶，青霉素和链霉素，二甲亚砜（DMSO）（sigma，USA），DMEM，胰

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酶（GBICO，USA），胎牛血清(碧云天)，单人单面净化工作台（苏州净化，中国），饱和湿度二氧化碳培养箱（Thermal Scientific,USA），倒置显微镜。 3.4.2 细胞培养 复苏：1.取出

摘 要

目的：地木耳(Nostoc commune vauch)是属于藻类蓝藻纲念珠藻科(Nostocaceae)，

全球广泛分布，资源十分丰富。已有研究表明地木耳含有丰富的氨基酸、糖苷、维生素、钙、磷等，在抑菌、抗氧等方面具有很高的活性。而近些年来，有很多关于多种植物、真菌多糖抗肿瘤领域的研究。随着地木耳以药材的身份逐渐走入了研究人员的视野，地木耳多糖的药理药效也开始得到重视。本课题拟针对地木耳多糖的抗肿瘤活性开展研究。

宫颈癌是女性患者常见的恶性肿瘤之一，原位癌高发的年龄为30～35

岁，浸润癌为45～55岁，而且近年来其发病更有向年轻女性发展的趋势，已是女性患者的一大杀手，而肿瘤细胞的侵袭和转移是导致放疗、化疗失败的主要因素。本实验利用多糖组和对照组宫颈癌细胞培养，并通过划痕实验，确定地木耳多糖对宫颈癌细胞侵袭的作用效果。

方法：首先，用水醇法按照60：1液料比，温度控制在90℃，反复提取三次，合

并提取液抽滤，并进行浓缩。加入无水乙醇，低温过夜。离心，取沉淀，并用savege试剂去除蛋白，干燥成粉末。然后绘制葡萄糖标准曲线，测出提取多糖的含量。将地木耳多糖配制成三种不同浓度溶液，加入宫颈癌HeLa细胞培养皿中，进行划痕实验，培养0、6、12、24、48小时后观察划痕的修复。最后进行统计学处理。

结果: 本实验利用水提法对地木耳进行提取，提取率为7.86%。地木耳多糖有抑制

宫颈癌Hela细胞侵袭的作用，在三种浓度中，40μg/ml的抑制效果强，并且具有剂量依赖性。

结论：地木耳多糖可抑制宫颈癌Hela细胞的侵袭能力，有望用于宫颈癌的治疗。 关键词：地木耳 多糖 宫颈癌 侵袭

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Abstract

Objective：Nostoc commune Vauch commonly known as Nostoc commune, Nostoc commune is a global wide species, mainly distributed in Karst karst area and limestone karstzone in Karst district. Nostoc contains a lot of amino acid, glucoside, vitamin, calcium, phosphorus. In recent years, there are many researches on polysaccharides efficacy in this direction. With the fungus medicine identity gradually into there search field of vision, pharmacological effect of polysaccharides of Nostoc commune also get attention.

Cervical cancer is one of the most common malignant tumor of female patients, in some cancer at the age of 30 to 35 years of age, invasive carcinoma was 45 ~ 55 years old, and more in recent years the incidence to the development trend of young women. Tumor invasion and metastasis is one of the main lethal factor. This experiment using polysaccharide group and control group to determine the effect on cultured cervical cancer cells.

Methods: Firstly, water alcohol method according to the 60:1 ratio of liquid to solid, temperature control in 90 ℃, repeated extraction. Repeated three times of extraction, merging the extracted liquid filtration, and concentrating. Adding anhydrous ethanol, cold night. Centrifugal, and precipitation, and Savege reagent was used to remove protein, drying into powder. Secondly, draw the standard curve of glucose, measure the content of polysaccharides extracted from. The fungus polysaccharide preparation of three different concentration solutions, adding to cervical cancer HeLa cell culture dishes. For wounding healing test, HeLa cell cultured for 0, 6, 12, 24, 48 hours. Finally, statistical analysis.

Results: To the Nostoc polysaccharide solution inhibited the invasive cervical carcinoma Hela cells, and 40μg/ml of the strongest inhibitory effect of the Nostoc polysaccharide.

Conclusion: after the processing, compared with the control group, the experimental findings, Nostoc polysaccharide solution, reduce the ability of cells to repair the scratches, as shown in figure shows more of Nostoc polysaccharide suppresses the motion ability of cervical cancer cell line. Key words: Nostoc commune polysaccharide cervical cancer invade

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目录

1 问题的提出 .......................................................................................................................... 1

1.1 研究的背景 .......................................................................................................................... 1 1.2 研究的目的和意义 ............................................................................................................... 1

2 文献综述 ................................................................................................................................ 2

2.1 地木耳的研究进展 ............................................................................................................... 2 2.1.1地木耳的性状.................................................................................................................... 2 2.1.2 地木耳的营养成分 ........................................................................................................... 2 2.1.2.1 蛋白类 .......................................................................................................................... 2 2.1.2.2 脂类 .............................................................................................................................. 3 2.1.2.3 氨基酸类....................................................................................................................... 3 2.1.2.4 多糖类 .......................................................................................................................... 3 2.1.2.5 维生素类....................................................................................................................... 4 2.1.2.6 矿物质类....................................................................................................................... 4 2.1.2.7 色素类 .......................................................................................................................... 4

2.1.3 医药领域 .......................................................................................................................... 5 2.1.3.1 地木耳在医药中的功效 ............................................................................................... 5 2.1.3.2 地木耳的药理作用研究进展 ....................................................................................... 6 2.1.4 食品领域 .......................................................................................................................... 7 2.1.5 保护环境 .......................................................................................................................... 8 2.1.6 农林牧业 .......................................................................................................................... 8

2.2肿瘤侵袭机制........................................................................................................................ 8 2.2.1 肿瘤 .................................................................................................................................. 9

2.3天然抗肿瘤活性物质研究现状 .......................................................................................... 10 2.4 划痕实验 ............................................................................................................................ 11

3 研究方法 .............................................................................................................................. 13

3.1 材料与仪器 ........................................................................................................................ 13 3.1.1 材料 ................................................................................................................................ 13 3.1.2 仪器 ................................................................................................................................ 13

3.2 地木耳多糖的提取 ............................................................................................................. 13 3.2.1 绘制标准曲线................................................................................................................. 13 3.2.2 地木耳的提取................................................................................................................. 14 3.2.3 Sevage试剂除蛋白纯化及浓缩 .................................................................................... 14 3.2.4 地木耳多糖提取率及其含量的测定 ............................................................................. 14

3.3 多糖溶液的配制................................................................................................................. 14 3.4 HeLa细胞分板培养及划痕实验 ........................................................................................ 14 3.4.1 试剂及设备..................................................................................................................... 14 3.4.2 细胞培养 ........................................................................................................................ 15

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3.4.3 地木耳多糖抑制Hela细胞侵袭活性检测 ................................................................... 22 3.5 实验结果 ................................................................................................................................. 23 3.5.1地木耳多糖含量测定 ...................................................................................................... 23 3.5.2 抑制Hela细胞侵袭活性检测 ....................................................................................... 24

4 结论和建议 ........................................................................................................................ 27 参考文献 .................................................................................................................................... 28 致 谢 ............................................................................................................................................. 29

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1 问题的提出

1.1 研究的背景

肿瘤侵袭扩散是恶性肿瘤的主要特征之一。具有浸润性生长的恶性肿瘤，不仅能在原发部位迅速生长，然后直接蔓延。而且肿瘤还可以通过侵袭等各种途径扩散到身体其他部位（转移），从而导致无法彻底的根治。肿瘤的侵袭扩散能力是肿瘤无法彻底根治的关键。

目前国内和国外对地木耳（Nostoc commune）的化学成分、生物活性和开发利用等研究正处于开始阶段, 对地木耳营养成分进行了一些初步的研究,但是研究结果差别相对较大，不宜采用;对地木耳的化学成分并未进行系统研究,其活性成分的构成及生物活性还有待深入研究;有关化学成分的纯化分离、结构的分析鉴定、活性检测等研究同样不够;针对地木耳功能食品、药品和环保产品的研究开发不够,其资源的综合利用有待进一步发现和探索。

1.2 研究的目的和意义

本课题“地木耳多糖抑制人宫颈癌侵袭能力实验研究”是研究Nostoc commune当中的多糖成分可能具有抑制宫颈癌侵袭的能力，对阻止癌细胞侵犯临近组织和细胞进而转移扩散全身具有重要的意义。原材料地木耳产地遍布多省，资源丰富，容易采集获得。而近些年来，有很多关于多种植物、真菌多糖抗肿瘤领域的研究。本课题研究地木耳多糖抑制人宫颈癌细胞侵袭能力，为抗癌药品的研发和推广、临床及应用提供新的思路。

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2 文献综述

2．1 地木耳的研究进展

2.1.1地木耳的性状

别名：天仙米、地皮菜、地耳等，为念珠藻科植物葛仙米的藻体，是真菌和藻类的结合体。多生于潮湿的地面、墙根以及静水面，夏季雨后湿地表面上最为常见，各省各地均有分布。此外，其富含蛋白质、多种维生素和磷、锌、钙等矿物质，可食用，亦作药用。

繁殖方式主要是异形胞将藻丝隔成若干个小段，叫藻殖段，极易从异形胞处断开分离，每个藻殖段再通过细胞分裂生长成长的丝状体。地木耳的这种以藻殖段进行繁殖的方式，也属于营养繁殖的一种增殖方式。地木耳（Nostoc commune）可固氮，也可食用。 地木耳由真菌和藻类结合而成的结合体，一般生长在光线稀少的阴暗潮湿地方，暗黑色，有点像泡软的黑木耳，藻体比黑木耳薄。多生于潮湿阴暗的土壤表面和静水当中，夏季雨后湿地面上最常见，而且各地均有分布。中国清代王磐编纂的《野菜谱》中，收录了滑浩一首名为《地踏菜》的词曰：“地踏菜，生雨中，晴日一照郊原空。庄前阿婆呼阿翁，相携儿女去匆匆。须臾采得青满笼，还家饱食忘岁凶。”这首歌谣记述了生长出的地木耳充饥救荒的情景。由此可见，地耳从古至今，就是饥荒年头重要渡荒的天然野生藻类，拯救过千万的劳苦大众，是大自然恩赐的佳品，它为广博大地上的人们立下了不可磨灭的功绩。 2.1.2 地木耳的营养成分 2.1.2.1 蛋白类

国内关于此类的文献也指出,地木耳（Nostoc commune）中蛋白质含量一般占干重的14.6%-21.81%,Maria Portia P.Briones等研究报道,地木耳中的蛋白质含量占干重的22.8%-28.7%,蛋白质的含量和地木耳的生长环境地域有关,并且发现地木耳（Nostoc commune）中含有可消化性很高的蛋白质,是多肽类物质的储存和来源。一些研究发现一种血红蛋白存在于Nostoc commune当中,取名cyanoglobin。这种血红蛋白结合氧分子的方式是可以逆转的, 它有较为厉害地和氧亲和力,但同时氧化的速度和X因子损失的速度也很快。Donna R.Hill等发现这种血红蛋白属于一种胞外蛋白。在经过了休眠多年的荒漠藻中Breanne Shirkey等得到活性强的含铁超氧化物歧化酶(SODF),这些SODF可以清除细胞外的超氧自由基，而这种自由基由多糖在UV照射下生成的。可以测定出了SODF的氨基酸的排列方式,并且减少紫外线间接

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损伤细胞。此外其他文献指出，地木耳还含有肌红蛋白等人体需要的蛋白质。 2.1.2.2 脂类

Nostoc commune是低脂肪藻类食品, 粗脂肪含量大约在0.2%-4.28%左右,因此可以作为低脂肪保健品。Patti Ann Ta-ran to等研究发现地木耳中含有一定数量的含硫黄糖脂质、半乳糖甘油二脂以及双半乳糖基甘油二脂、磷脂和磷脂酰甘油、和单葡萄糖基甘油二脂。研究表明地木耳中可以提取出一种新的脂肽,其分子式为 C48H76O18N10,一个异常的氨基酸和一个含有羟基、氨基的硬脂酸在此结构中,此结构的硬脂酸和氨基酸具有一定的抗真菌活性。再次研究发现表明，水的重吸收可以加快生物合成地木耳中脂质等脂类。 2.1.2.3 氨基酸类

地木耳（Nostoc commune）含有18种氨基酸,其中人体必需的8种氨基酸含量更为丰富,相互间的成分含量比例与人类个体需要量十分接近。总氨基酸含量也高于猴头、木耳等中氨基酸的含量,与发菜、香菇中氨基酸的含量相近。Rajeshwar P. Sinha等发现地木耳中含有霉孢菌素样氨基酸(MAA),利用高效液相色谱研究发现,这种物质包含丝氨酸组和甘氨酸组,在334nm处有一个最大吸收峰值,其保留时间大约是2.8分钟。 2.1.2.4 多糖类

地木耳（Nostoc commune）的总糖含量是0.53%-23.8%,钱信忠等科学家研究报道地木耳含有单糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖等多糖包括海藻糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、果胶多糖类、葡萄糖苷等以及细胞胞外多糖等多种糖类。用蒽酮比色法粗略估算地木耳中可提取的海藻糖的含量大约为0.24mg/g( 鲜重)。运用色谱法薄层层析分析方法研究发现地木耳中含有大量的海藻糖,盛家荣等对地木耳多糖（Nostoc polysaccharide）进行了研究,粗提取出来的多糖经过QAE-Sephadex-A-25层析得到几种水溶性多糖分别是，SP-1,SP-2,SP-3。又通过一种特殊的薄膜电泳方法进行Sephadex-100的层析,发现当中的均一多糖是SP-2,用高效液相色谱测定SP-2的相对分子质量为8.8×104,通过GC测定表明它是由单糖葡萄糖为单元组成,红外光谱显示SP-2为B-D-吡喃糖苷键构成,并且对其活性进行测试,结果测试证明地木耳多糖能促进一些植物种子的发芽速度。

有关文献报道，研究验证了多糖提取的最佳工艺条件,即提取温度98℃、提取时间3.8h,提取次数在3-5次，在此条件下水提水溶性多糖的最大提取率为 7. 91%;

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研究酸提水溶性多糖和碱提水溶性多糖均是按照地木耳利用水提法提取的,SP的提取率要比JP的提取率低,有实验证明SP由一种单糖（葡萄糖)构成的单一多糖,属于葡聚糖的一种,JP由木糖和葡萄糖这两种单糖所构成,所以JP是属于杂多糖。国外针对地木耳粘性胞外多糖(EPS)展开了研究,利用分光法和层析法结合测定出粘性EPS是一种以木质半乳糖葡聚糖(xylogalactoglucan)作为骨架,D-呋喃核糖和D-葡萄糖醛酸也连在骨架上。国外相关文献研究发现结合水分子流失经常不正常地在地木耳的胞外多糖上发生,而结合水分子流失速率和其亚显微结构和组成结构密切相关。有研究发现在缺水的环境下地木耳膜囊的融合能很好的被这些胞外多糖抑制,从而使地木耳（Nostoc commune）的抗旱性有效的提高。此外国外科学家们发现地木耳（Nostoc commune）是未来膳食纤维的主要供应。 2.1.2.5 维生素类

通过人们研究发现，生长在干燥地区的地木耳还含有多种维他命,例如维他命C、维他命 B1、维他命B2、维他命A和维维他命E。国内学者有报道地木耳中VB1、C、B２的含量很高，而且易于获得。贺宝珍等测得维生素各类的含量均不低，其中维生素C的含量尤为丰富，目前为止，地木耳中的VC在菌藻类食物中非常高。跟紫菜相比，大约可达紫菜中含量的19倍左右。 2.1.2.6 矿物质类

不仅在其他营养物质上面含量丰富，地木耳（Nostoc commune）含有多种矿物质例如钾、钠、钙和硒等人体所必须的微量元素,这些微量元素和其他常量元素都是人体不可缺少的，维持生命的物质。地木耳含钙量高,多食易壮,可使得小儿佝偻病和成人骨质疏松病及上消化道出血症得到预防和治疗。含铁量也相对比较高, 长期食用,可预防和缓解婴幼儿和孕妇缺铁性贫血症。这就说明了从膳食中摄取的微量元素要比通过人工合成的药物补给更容易被人体吸收利用。 2.1.2.7 色素类

藻类所含色素大致可分为三部分:类胡萝卜素、叶绿素和藻胆蛋白。地木耳中含有叶绿素A、B-胡萝卜素(B-caroteme)、4,4-C-二氧-B-胡萝卜素、4-氧-B-胡萝卜素和玉米黄素,还有眉藻黄素、海胆酮和念珠藻黄素。S.scherer等研究发现地木耳提取物中含有一种新的色素，用作于紫外线的防护。相对分子质量在1500-3000之间,有多糖的结构特征,地木耳中这种抑制紫外破坏的色素含量很高,占Nostoc commune干重十分之一上下。更深一步研究表明，地木耳色素中的合成过程中发现

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这种防护色素,紫外线照射能使地木耳胞外多糖被诱导生成,与此同时紫外线的照射能促进类胡罗卜素的增加,特别是对海胆酮和阿叶黄素这两种化合物的生成增加,但是研究结果表明对叶绿素A没有明显的影响。利用这种保护色素制成的美容防护产品可有效的阻止UV对人体皮肤的危害。 2.1.3 医药领域

2.1.3.1 地木耳在医药中的功效

地木耳（Nostoc commune）在国外科学家的一系列的试验当中，被提取出一种类似草酸类的物质,这种物质可溶。在实验过程中这种物质对老鼠有降胆固醇作用,而且没有毒副作用。《中国医学大辞典》等书记载,地耳具，明目益气的功效。全部藻体皆可入药,味甘，性寒,可以清热解读，润珠明目、令人有子，收敛益气之功效。其中含有维生素A，所以用作治疗夜盲症；对久痢脱肛等病症皆有疗效；目赤红肿，食之明目；干燥，研成粉末,加之植物油调理外用,可治疗烧伤和烫伤。有专家认为原有药方中可用地木耳代替的其他药材如：黑木耳或白木耳。来使得精神或神经方面的疾病得以缓解。《本草纲目》记载地皮菜（地木耳，Nostoc commune）具有补护心腑，清理肠胃,长时间食用可以美白补气,使人面色红润,返老还童等功效,是一种营养健康野菜品种。其他研究发现地木耳中提取出几种二萜类化合物这几种化合物对某种芽孢杆菌、某种葡萄球菌和大肠杆菌Ecoi也有相应抑制作用,其中一种二萜类化合物C型对抑制大肠杆菌的作用可以与其他抗生素的作用效过相类似而二萜类化合物E型抑制表皮葡萄球菌的作用可以达到氯霉素的抑菌效果。地木耳中含有一种具有抗菌活性的胞外二萜类化合物,对于某种葡萄球菌和某种芽孢杆菌来说这种化合物的抗菌作用甚至比对照品氯霉素强, 而对大肠杆菌的抗菌作用也相对来说要好的多。地木耳还含有三种代谢物都是具有抗菌活性的,其中一种是第一次作为天然产物被证实的,一种是从地木耳中得到的蒽醌类化合物,另外一种对某种葡萄球菌的抗菌作用强度达到了氯霉素的水平,这三种物质均对某种芽孢杆菌、大肠杆菌和某种葡萄球菌也有抑制效果。国外研究报道抗真菌活性的脂肽(nostofungicidine)也被从地木耳当中提取获得，这种抗真菌效果的化合物对白曲菌有抑制效果。下面列举几个地木耳作为药膳的功效：

1．降脂明目。地木耳（Nostoc commune）是一种非常实用的低脂肪营养保健菜，能降脂减肥。同时，对目赤、夜盲、脱肛等病症缓解和治疗也有一定疗效。

2．清热降火。地木耳性寒而滑，具有清热解毒的功效，内服外用皆可。还能

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辅助治疗烫伤、烧伤及疮疡肿毒。

3．补充营养。地木耳含有非常丰富的氨基酸蛋白质、钙、磷、铁等，可为人体机能提供多种营养成分和能量。还具有补虚益气，滋养肝肾的作用。

药用：以全藻体入药。夏秋雨后采摘收集，清洗干净，除去杂质，新鲜利用或晒干使用。可以口服。据《全国中草药汇编》介绍，地木耳（葛仙米）“性寒、味淡，有消热、收敛、益气、明目之作用，主治脱肛、夜盲症；外用可治烧伤、烫伤等病症，护肤美容也有疗效。”功能与主治,清热，明目，益气，收敛。用于夜盲症。主治目赤红肿，夜盲，久痢，烫火伤，脱肛等病症。性味与归经,淡，寒；味甘，性凉；入肝经。用法与用量,50g-100g；外用适量，研粉调敷患处。相传在东晋时期，医学家、道教理论家、炼丹术家葛洪隐居在南土时，灾荒之年便采以为食，偶获地木耳健体之功能。后来葛洪入朝以此为宝献给皇上，体弱多病的太子食后药到病除，再服，则体壮精益，皇上为感谢葛洪之功，随将天仙米也就是地木耳赐名“葛仙米”，并沿称至今。

现代的《秦巴山区天然药物志》、《陕西中草药》、《四川中草药志》等也有相似记载。民间常用来治夜盲、丹毒、烫火伤、皮疹赤热、久痢脱肛、痔疮等症。如新鲜炒食，可缓解夜盲和牙痛；白糖浸泡而凉食，能医脱肛；与糯米饭、鸡汤等熬粥，可补血益气；用其焙干研成粉末调菜油外敷，可治烫火伤。现代药理研究也可以证明：地耳用于食疗，功效卓著。地木耳含有15种氨基酸，多种维生素和其它自然食品不及而人体必须的微量元素Mn、Ca、Zn、Fe、P等矿物质成份。 2.1.3.2 地木耳的药理作用研究进展 1.抗氧化的作用

在实验质量浓度范围内,地木耳多糖对DPPH自由基的清除率随其质量浓度的增加而提高.质量浓度0-0.4mg/ml范围内,地木耳多糖对DPPH自由基的清除率迅速提高,在0.4-1mg/ml范围内清除率呈现平稳提升的趋势,最高可达66.35%. 2.抗辐射作用

地木耳天然提取物当中含有伪枝藻素、类菌孢素等具有超强抗辐射作用的物质。自然光下的紫外线能破坏人体内的表皮蛋白，核酸，使其化学键断裂导致DNA突变诱发皮肤炎症，甚至皮肤癌，同时刺激黑色素形成，进而形成黑斑，雀斑等各种色斑。目前应用于紫外线防护的物质大致分为两类：物理阻隔剂和化学吸收剂，这些物质可以通过化学合成如氧化锌，水杨酸酯等，也可在动植物体内天然提取如

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黄芩苷，芦丁，类菌孢素氨基酸，伪枝藻素等。地木耳中的抗辐射的色素类菌孢素和伪枝藻素含量在12%左右，含量也丰富。[7] 3.抗癌作用

文献报道称，根据对来自中国中西部荒漠地区存在的两种地木耳(Nostoocommune)进行研究，并对其生物活性物质简单地进行了筛选,初步对包括水、乙酸乙酯等为溶剂的粗提物进行试验，并且验证了其抗肿瘤的活性。[8]何松等人分别以肺癌A549和肝癌7721作为材料,并通过实验进行体外抗肿瘤活性检测发现,地木耳乙酸乙酯提取物对这两类癌细胞的细胞毒性效果最强，分别为每毫升24.79微克地木耳提取物和每毫升51.33微克地木耳提取物。而进一步实验证实乙酸乙醋相中含量比较高的成分有两类物质：分别是粗黄酮和粗多酚,而其含量分别为4.57%和12.06%；地木耳石油醚相的提取物中粗黄酮的含量比较大,约为6.75%。

利用硅胶柱层析对地木耳乙酸乙酷相提取物再次进行分离纯化,得到几个洗脱部分，其中第4部分表现出很高的抗肿瘤活性，而且其中的粗多酚及粗黄酮含量很高,分别达到21.30%和70.71%,这便说明地木耳的活性物质中的粗多酚及粗黄酮类物质可能是具有抗肿瘤作用。[9]

另外有报道指出，将地木耳的水提物配制成一定浓度的多糖溶液，可以对体外培养宫颈癌细胞的增殖及扩散有抑制作用，从而抑制癌细胞扩散。这种水提物通过蒽酮试剂定性试验，已经证明其属于地木耳粗多糖。并且通过水提法提取的地木耳多糖，其提取率占9%-12%左右。 4.抑菌作用

地木耳多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有一定的抑制效果,且作用相当明显。但是都不如阳性对照品抗生素阿莫西林的抑菌效果强。随着多糖质量浓度的增大,抑制作用也逐渐增强；最小抑制浓度MIC在125-259μg/ml之间。地木耳对金黄色葡萄球菌的抑制作用表现的不明显。由此可见，在对这3种微生物的试验中，地木耳多糖对微生物的抑制作用是具有选择性的。[3] 2.1.4 食品领域

在我国许多省市地区, 地木耳（Nostoc commune）的利用方式是以食用型野菜营养资源为用途的。地木耳含有很多种类，比如氨基酸类、多肽蛋白质类、单糖以及多糖类、供人体利用的微量金属元素和少量的脂肪类、各种色素类, 成为氨基酸和纤维素丰富的来源之一。利用绿色保健的地木耳可以向保健功能性饮料或天然绿

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色食品方面研发, 例如以Nostoc commune为原料,按黄豆酱、米粉或者面粉、地木耳粉末一定的比例,辅以辣椒、麻椒等调味,便可以生产制作成风味地皮菜辣椒酱。 2.1.5 保护环境

资料显示地木耳生长区域广，易采集,成活的地木耳对大气污染也十分敏感,有研究表明，将地木耳挂袋暴露于空气中,选择地木耳的伤害面积、含硫量、PH值为主要监测指标,通过地木耳对大气污染的监测,同时以地区大气环境质量综合指数为参照,用模糊数学方法对大气环境质量作出综合评价。结果表明,地木耳的多指标模糊综合评判法与综合指数法一致,具有较高的可信度。杨学山等用荒漠藻地木耳挂袋法监测大气SO2污染,研究结果发现地木耳的含硫吸收量与大气SO2污染之间存在一定的相关性,该法有许多优点,可以把地木耳开发作为大气污染的监测器。 2.1.6 农林牧业

地木耳种属为固氮念珠藻类,既能合成固定氨从而使空气中的游离氮得到固定,又能进行固定二氧化碳的光合作用。在自然的条件下,地木耳可以与同种其他固氮藻类一样作为十分重要的分解者来为自然作物提供氮肥,可以开发成为一种新型的肥源。有些地区利用野生的地皮菜作肥料种地,比如说将其和所堆积的草皮一起混合作为堆肥，这样可以使地木耳中含有的生长促进剂作用在农作物上促进产量。有研究报道称多种农作物和花卉植物的生长在一定浓度的地木耳提取物的作用下，其生长可有明显的促进。有文章报道地木耳中含有起促进作用的物质，而这个物质被证实是地木耳（Nostoc commune）多糖。

2.2肿瘤侵袭机制

在我们的环境、饮食中存在许多诱变致癌因素。1.机体防御组织的功能降低，(l)人体外界防线，如头发，绒毛等均能排除和阻碍致病因素的侵入,当这些屏障发生破坏就容易发生肿瘤扩散,皮肤癌就是很好的例子。(2)正常菌群失调:体内菌中有的与致病菌拥有共同的抗原,有的能合成各类维生素，抗生素和细菌毒,所以有利于宿主抗病作用。(3)解毒，排毒能力降低:免疫系统的识别、清除以及修复能力降低,导致肿瘤病情的发展。3.内外致病因素联合战胜防御能力。2.致病因子，(1)环境(外界)致病因素的影响：生物致病因素，病毒方面如，乙肝病毒等；细菌方面如，幽门螺旋杆菌等。物理致病因素，放射线照射方面如，钴-60的持续照射；化学致病因子:多环芳烃类的化合物如苯丙胺、再如，亚硝胺、黄曲霉素、乙烯雌酚等长期接触可以引起肿瘤。必需营养元素缺乏也可以使人患癌；微量元素如果不足，

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如缺硒元素或者维生素类的长期缺乏也可诱发人体发生癌变。(2)机体(宿主)内部致病因子:遗传基因的缺陷，容易发生P53基因突变，可能使得造血器官，乳腺，胧，肝，脑，膀，肺和结肠发生常见癌变。精神刺激，在英国的一个报告会上面有报告称，二百多例恶性肿瘤患者中患癌前直接受过严重精神刺激的就有65%左右。 2.2.1 肿瘤

肿瘤是一种极不正常的肿块或组织,生长速度快,与正常组织不协调,受到刺激还会继续生长。肿瘤分为良性和恶性,良性肿瘤不是致命的。恶性肿瘤即癌,癌的发生和发展分致癌的启动(initiationofeareinogesis),促癌(promotion)和癌的形成和发展(development)三个阶段。它首先局部浸润周围组织,还能通过血液和淋巴系统转移到其他组织\侵袭!转移行为是恶性肿瘤的本质特征。癌侵袭(invasion)是指癌细胞脱离原发生长部位,突破基底膜和细胞外基质构成的屏障,侵袭毗邻的组织。首先癌细胞通过膜表面的受体与基底膜、基质成分如层粘连蛋白(laminin)、纤维粘连蛋白(fibroneetin)和胶原蛋白(eollagen)等结合,然后癌细胞分泌或诱导间质细胞分泌多种蛋白酶降解基底膜和基质,最后定向运动穿越破损的基底膜的基质部位\转移(metastasis)即癌细胞借助血管、可分为:a.原发瘤增殖,肿瘤新血管生成;b.肿瘤细胞侵袭毗邻的基底膜!基质和正常细胞;c.癌细胞穿入血管或淋巴管并在循环系统中存活;d.癌细胞栓塞、滞留于远隔靶器官的微血管中并增殖;e.癌细胞穿出血管或淋巴细胞,在靶器官内形成微转移灶;f.肿瘤间质内新血管生成,转移瘤快速生长。

2.2.2 瘤细胞从原发瘤体脱落

肿瘤形成以后，通过所在器官的弥散获得最初的生长营养，细胞逐渐分化、增生。当瘤体直径达到2mm以上，增殖生长要靠足够的血液供应。研究证明肿瘤细胞及间质细胞释放促血管生成的因子如血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor ,VEGF）,血管形成素（angiogenin），成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF),白细胞介素-8（interleukin-8），血小板来源的内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor, PD-ECGF）等。这些因子使内皮细胞迁移、增殖形成管腔结构，最终在瘤体内部形成微血管网。

已有结果证明瘤细胞之间相互黏着的能力较正常细胞为低，透射电镜显示多种肿瘤细胞的桥粒、半桥粒和间隙连接数量减少。细胞内的钙含量也减少，这些都是

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构成粘附力降低的原因之一。另外还有报告瘤细胞表面电荷密度增加，相互排斥力加大，尤其是转移率高的细胞电泳率增高，这使得瘤细胞从瘤体脱落的可能性增加。 还有细胞表面的某些粘附分子缺失令细胞间连接遭受破坏，也有脱落的危险。 2.2.3 瘤细胞侵袭周围组织

肿瘤扩散发生最初是侵袭，而侵袭发生之后就会导致一个结果，就是扩散。瘤细胞在侵袭的过程中间，是先从母体细胞中脱落分离，然后在向临近组织侵袭，不过有研究表明这两种运动也可同时进行。在十九世纪鲁道夫·路德维希·卡尔·菲尔绍就提出了突变之后的癌细胞具有类似于阿米巴虫伸出借以向各方向运动的伪足，故移动迁移速度比非恶性肿瘤细胞快。目前已有多位学者提出，在肿瘤细胞可以利用伪足运动来完成侵袭周围组织的这一过程。这个过程当中，肿瘤细胞的表面将分泌多种物质因子，使得癌细胞改变相应的骨架，从而完成固定向其他组织器官侵袭扩散的运动。【5】

2.3天然抗肿瘤活性物质研究现状

2.3.1 广泛的天然抗肿瘤活性研究

目前,化疗药物广泛应用在大部分的抗肿瘤前线,具有很大的副作用和细胞毒性,而且耐药性就是由于这些化疗药物在与恶性肿瘤细胞长期接触后而产生的;上述问题几乎不会发生在天然抗癌提取物当中,天然产物不仅对身体的负面影响远远小于以往抗肿瘤药物,副作用伤害小的抗肿瘤新药的发展也有非常广阔的前途。所以,开发绿色的抗肿瘤活性物质也逐渐被提上了日程。[5]

如今已天然抗肿瘤活性物质被筛选得到也比较多,许许多多的抗肿瘤的作用原理也都差不多。比如说，紫杉醇（自中华紫杉分离的）能够对微管蛋白作用,最终使得细胞破裂凋亡。从Green tea中提取出的有效成分聚酷型儿茶素,能诱导HL-60细胞向稳定成熟细胞分化；人参皂苷Rg3是存在于中药人参中的四环三帖皂苷,其分子式为C42H72013,它可通过对肿瘤细胞新生血管形成的阻断,诱导细胞调亡，从而达到抗癌疗效；再如，灵芝和灵芝的有效成分可增强免疫系统的巨噬细胞的吞噬功能,促进T淋巴细胞增殖,增强免疫T细胞的细胞毒副作用；斛皮素(quercetin)是一种黄酮类物质，广泛存在的生物体内,是自由基的捕获剂和抗氧剂,减轻氧自由基对细胞的损害可能是其抗癌和防癌的机制；金爱康片剂,是一种天然钙拮抗剂，它是由汉防己甲素制成，而汉防己甲素是汉防己的根部分离出来的有效成分。研究显示表明单独使用化疗药物治疗恶性淋巴癌等急慢恶性肿瘤的缓解作用比它与化疗

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药物合用效果差很多。[6]

2.3.2 藻类抗肿瘤活性物质的研究

藻类植物含有许多抗肿瘤的活性物质，其中所含多糖是其有效成分，藻类多糖可以直接的或间接的抑制癌细胞增殖和侵袭。1，可通过对淋巴细胞的刺激并使其增殖；对巨噬细胞活性的提高；或者增强吞噬指数的方式，提高机体免疫细胞抑制癌细胞的能力。2，可通过增强红细胞膜的流动性，抑制癌细胞通过血液途径侵袭或转移，并抑制癌细胞增殖。

通过对曲显俊等螺旋藻多糖体内和体外抗肿瘤研究分析发现，钝顶螺旋藻多糖对白血病细胞有46.0%抑瘤率，对乳腺癌细胞有68%的抑瘤率。当螺旋藻多糖浓度达到300mg/kg时通过灌胃给药的方式对小鼠进行灌胃。结果发现，此浓度的螺旋藻多糖对小鼠肉瘤有55.2%的抑瘤率。在体外抗肿瘤实验过程中，周岩冰等研究发现，螺旋藻多糖能够抑制体外培养的直肠癌细胞、结肠癌细胞及胃癌细胞,而且一定范围内的抑制率和浓度呈线性关系,螺旋藻多糖在20mg/l剂量下时,对结肠及直肠癌细胞抑制率为42.04%。[10]

对羊栖菜中提取的羊栖菜多糖研究发现，其可以对特定的肿瘤血管内皮细胞的增殖起到抑制作用，而这种特定肿瘤被证实是人体体外培养的肺癌细胞所诱导的。

海带根中的一种抗乳腺癌物质，对其研究表明其为一种氨基酸。长叶海带能够明显延长同种同系淋巴细胞白血病的小鼠的生命延长率。[11]

2.4 划痕实验

细胞划痕实验是指将细胞培养到相互融合后再用无菌枪头在孔板中央区域画一条直线,导致这条直线内的细胞被物理机械力去除掉,用无菌PBS液洗干净,在培养液中继续进行培养,并观察细胞向划痕区域侵袭迁移的情况。通过细胞向划痕移动并使划痕宽度缩减的程度确定细胞的迁移运动能力。细胞划痕实验的优点是,实验成本低,而且是一种简单易操作地检测细胞运动能力的基本方法，常用于评价肿瘤细胞的侵袭转移能力。

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3 研究方法

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料 试剂：蒸馏水；

无水乙醇（分析纯）； 浓硫酸（分析纯）； 氯仿（分析纯）； 葡萄糖（分析纯）； 正丁醇（分析纯）； 蒽酮（分析纯）；

药材：干地木耳（青海海东地区野生地木耳）； 3.1.2 仪器

紫外分光光度计（上海分析仪器厂，型号721）；

多功电子恒温水浴锅（上海凯乐电紫设备厂，型号SYG系列）； 电子分析天平（上海明桥精密仪器有限公司，型号FA1004N）； 低速台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司，型号:FYL-YS-30L ）。 旋转蒸发器（型号为RE—2000A，巩义市予华仪器有限公司）； 双人净化工作台（型号为HJ—CJ—2D,）；

3.2 地木耳多糖的提取

3.2.1 绘制标准曲线 (1）标准曲线的制作：

2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于浓H2SO4（A.R.95.5%），现配现用。0.1g/L葡萄糖溶液：准确称取标准葡萄糖0.01g，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL容量瓶中。

分别取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，然后向其中加入双蒸水配制至1.00mL；分别加入4.00mL蒽酮试剂，放置在冰水浴中迅速冷却，然后再沸水浴，直至在沸水浴中煮沸，管口应该密封完好，以防试剂挥发。煮沸持续10分钟，然后将其取出，快速冷却至室温，放置大约10min，在可见光分光光度计620nm处进行比色比色。空白项是以相同方法处理的蒸馏水，然

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后比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。以糖的含量（μg）为横坐标，OD值为纵坐标，自作出标准曲线。 3.2.2 地木耳的提取

准确称取地木耳粉末20.00g放入1000ml的原地烧瓶中，加入700ml的蒸馏水。连接好冷凝装置。将装置放入90℃的水浴锅中固定，连续提取3个小时，将提取液过滤，滤渣放入瓶中继续提取2个小时，滤出滤液。合并上清液，减压过滤后再利用旋转蒸发仪将上清液浓缩至20ml。加入60ml的无水乙醇，搅匀，静置在4℃低温冰箱过夜。

3.2.3 Sevage试剂除蛋白纯化及浓缩

取出地木耳多糖溶液，放入2000G，10℃高速离心机中离心15分钟，收集沉淀物。取地木耳多糖沉淀物加入4mLSavege试剂在振荡器中震荡20min，静置，取上清液，弃去下层溶液。再加入4mLSavege试剂，相同操作连续5次。除蛋白后放入减压干燥箱40℃烘干成粉，密封保存。 3.2.4 地木耳多糖提取率及其含量的测定

（1）地木耳多糖的测定：

将地木耳多糖稀释，取出1mL加入4mL蒽酮试剂，放置在冰水浴中迅速冷却，然后再沸水浴，直至在沸水浴中煮沸，管口应该密封完好，以防试剂挥发。煮沸持续10分钟，然后将其取出，快速冷却至室温，放置大约10min，在可见光分光光度计620nm处进行比色比色。空白项是以相同方法处理的蒸馏水，然后比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。

（2）提取率及纯度测定：提取率的计算：用测得的多糖质量除以20.00克，即为多糖的提取率。

3.3 多糖溶液的配制

取出去除蛋白后的地木耳多糖干燥粉末0.4035g，加入2.36ml蒸馏水，和2.60ml的pbs缓冲液以及双抗，溶解成溶液。分别配制成10μg/ml,20μg/ml和40μg/ml三种浓度的地木耳多糖溶液，放置在37℃的恒温培养箱。

3.4 HeLa细胞分板培养及划痕实验

3.4.1 试剂及设备

胰蛋白酶，青霉素和链霉素，二甲亚砜（DMSO）（sigma，USA），DMEM，胰酶

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（GBICO，USA），胎牛血清(碧云天)，单人单面净化工作台（苏州净化，中国），饱和湿度二氧化碳培养箱（Thermal Scientific,USA），倒置显微镜。 3.4.2 细胞培养

复苏：1.取出液氮中的冻存管，于37℃水浴锅中迅速放入，轻轻晃动。待融化所有的液体后（大概一分半钟），对超净工作台进行消毒处理。2.离心管中装入10ml培养基的15ml的离心管，把培养的细胞悬液吸到离心管中，的（用培养基将粘壁细胞洗掉），1000转离心5分钟。3.去除上清液，将培养皿中加入培养基，促使细胞悬浮。把装有10ml培养基的10cm培养皿里加入细胞悬液，前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。4.放到CO2培养箱中培养，并在之前标好细胞类型和日期、培养人等，及时更换培养基防止细胞贴壁。3天将培养基换一次。

传代：1.当覆盖率达到80%-90%时,细胞要传代。2. 吸掉培养皿中的培养基。3.加适当的胰蛋白酶消化分散细胞120s。4.终止消化时确保细胞都变圆后，往其中加入含血清的培养基。5.悬浮细胞的方法:用Marker枪对细胞反复吹打。6.向离心管中加入15ml细胞，离心1000r，5min。7.将上清液倒掉，并加入培养基1-2ml，用移液枪吹打细胞。8.一般,癌细胞分5个培养基,正常细胞传3个培养基。然后继续培养。

冻存：将消化下来的细胞离心。配制好冻存液，然后把悬浮细胞，取灭菌的冻存管进行分装，放置一段时间，细胞种类，冻存日期等记录好。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃，第二天保存到液氮灌中。冻存液的配制：70%的完全培养基加入20?S和10%DMSO。DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。 3.4.3 地木耳多糖抑制Hela细胞侵袭活性检测

划痕实验：(1)用胰蛋白酶消化Hela细胞,并吹打成浓度为大约5×104个/ml的细胞悬液;(2)用marker笔在12孔板的后面用直尺均匀的画横线,每孔画1条线; (3)在12孔板中分别加入实验组和对照组细胞;(4)放入,5% C02，37℃细胞培养箱中继续培养;(5)第2天用10ul的无菌枪头划横线,枪头尽量垂直,不要划歪，不要倾斜;(6)用配制好无菌PBS洗涤数次,去除划痕下的残留细胞;(7)加入含不同浓度NCV多糖或对照培养液;(8)再放入37℃,5à2细胞培养箱中继续培养,分别在0,6，12，24，48h后观察照相。

利用画图工具网状格功能统计各组划痕在各个时间段相对宽度，通过迁移百分比确定地木耳多糖对抑制HeLa细胞迁移的能力。

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3.5 实验结果

3.5.1地木耳多糖含量测定

1.标准曲线的绘制，配制不同浓度的标准葡萄糖溶液测得的OD值（表一），根据OD值绘制出一条葡萄糖标准曲线，其方程式为y=0.0094x+0.1744(表二)。 （表一）葡萄糖溶液浓度、OD值对照表

糖浓度mg/ml OD值 0 0.175 10 0.262 20 0.358 30 0.473 40 0.546 60 0.735 80 0.925

（表二）葡萄糖标准曲线

2. 地木耳多糖含量测定

将不同浓度地木耳多糖的吸光度值（表三）带入葡萄糖标准曲线当中，测得利用水提法提取地木耳多糖的提取率为7.86%。

（表三）地木耳多糖不同浓度的OD值 多糖浓度mg/ml OD值 0.000 0.246 0.100 0.300 0.300 0.396 0.600 0.518

3.5.2 抑制Hela细胞侵袭活性检测

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利用photoshop中的测量软件，测量不同加药剂量下0，6，12，24，48h时的划痕宽度。以对照组与40ug/ml组为例，随着培养时间的增加，划痕的宽度明显减小（图一与图二），说明本次实验中的HeLa细胞具有明显的迁移能力。

图一 空白组在不同时间下的划痕宽度

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（图二）40μg/ml地木耳多糖在不同时间下的划痕宽度

通过划痕宽度百分比来分析地木耳多糖对抗Hela癌细胞侵袭能力的实验发现，在一定的浓度范围内，地木耳多糖抗侵袭作用具有浓度依赖性。对比空白组的划痕宽度（图一）和40μg/ml地木耳多糖组的划痕宽度（图二）减小的速度，可见40μg/ml组恢复速度明显减慢。统计各浓度不同时间相对于0小时的划痕宽度

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百分比的均值（表四），可见40ug/ml组下划痕宽度明显恢复较慢。对48小时下各浓度组与空白组划痕宽度的差异做显著性分析，发现相对于对照组，20ug/ml组与40ug/ml组的差异显著，P值均小于0.01（表五），而10ug/ml组差异不显著，可能是剂量不足引起的。

（表四）：各时间相对于划痕宽度百分比统计表

6h

12h

24h

48h

空白组相对D百分比 92.1% 86.3% 87.1% 87.4% 95.2%

72.5% 78.3% 81.8% 88.9%

53.6% 66.8% 71.1% 82.2%

10μg/ml相对 D百分比 93.1% 20μg/ml 相对D百分比 95.5% 40μg/ml相对 D百分比 98.2%

（表五）P值对照表

(I)x (J)x Sig. LSD 0 10 .086

20 .002 40 .000

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