浙大植物生理学报告植物衰老生理

专业： 生物系统工程 姓名： 缪宏樑 实验报告

学号： 3120100211 日期： 2014.5.29 地点：生物实验中心313 课程名称：植物生理学实验 指导老师： 成绩：

实验名称：植物衰老生理实验类型: 定量 同组学生姓名： 朱圣日美 一、实验目的和要求 二、实验内容和原理 三、实验材料和主要仪器 四、实验方法和步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果和分析 七、实验讨论和心得

一、 实验目的和要求

1.掌握可溶性蛋白测定的原理； 2.掌握植物组织中丙二醛的测定方法；

3.掌握植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定方法； 4.了解植物衰老的原理。

二、实验内容和原理

衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。

衰老时的生理生化变化:蛋白质显著下降,核酸含量的变化,光合速率下降,呼吸速率下降, 生物膜结构变化, 植物内源激素的变化等。

植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。 自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA ①可溶性蛋白测定的原理

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从。据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。

待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。 ②MDA测定原理：

MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物 最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处 消光系数为155 (mM)-1 cm-1

③超氧物岐化酶（SOD)活性测定原理：

四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。

三.实验材料和主要仪器

实验材料：叶龄差异明显的叶片若干 主要仪器：分光光度计，天平，离心机等 四、实验方法和步骤 ①可溶性蛋白测定 （1）制备蛋白提取液

称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。 (2) 蛋白标准曲线的制作

蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15M NaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160μg /200ul牛血清蛋白的标准溶液。 考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂的配制

准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160μg牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。 （3）显色反应 样品的测定：

取40 ?l蛋白提取液+160?l磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值 。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。 ②MDA测定

取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液 4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92oC水浴保温30min

空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （92oC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min; 10000rpm

测定A532, A450和A600

③超氧物岐化酶（SOD)活性测定

称叶龄差异明显的叶片各1.0g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（）离心10min，其上清液即为酶提取液。 在暗光条件下加入3mL NBT反应液 和100 μL酶提取液于试管中，在25℃照光（4000-10000lux)并计时,6-25min后出现颜色变化， 9min后测560nmOD值。同时作空白实验。

根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/gFW)。一个酶活单位相当于引起3mL NBT反应液 达到50%抑制所需要的酶量。测定时用未照光NBT反应液调零。

五、实验数据记录和处理 ①可溶性蛋白测定

标准曲线

显色反应： 叶片种类 新叶 老叶 OD 0.183 0.109 在标准曲线上查得新叶蛋白质量为28.916μg，老叶为16.231μg

可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（ μg ） × 提取液体积/（测定加样量*鲜重）

新叶=28.916*5/（40*10^-3*0.50）=7229μg/g.FW 老叶=16.231*5/（40*10^-3*0.50）=4057.75μg/g.FW ②MDA测定 叶片 新叶 老叶 532nm 0.283 0.402 450nm 0.622 1.482 600nm 0.208 0.205

求得新叶MDA（mM）=（0.283-0.208）/155/1=4.839*10^-4（mM） 老叶MDA（mM）=（0.402-0.205）/155/1=1.271*10^-3（mM） 蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除： MDA(μM)=6.45(A

532

-A

600

)-0.56A

450

求得新叶MDA(μM)=6.45（0.283-0.208）-0.56*0.622=0.1354(μM)

老叶MDA(μM)=6.45（0.402-0.205）-0.56*1.482=0.4407(μM)

③超氧物岐化酶（SOD)活性测定 组别 新叶 老叶 对照组 OD 560nm 0.433 0.893 1.223 SOD活力（单位/mg蛋白）=（对照管OD值-测定管OD值）/对照管OD值/0.5/加入粗酶液中的蛋白质含量 新叶：(1.223-0.433)/1.223/0.5/（28.916*10^-3）/2.5=17.9（单位/mg蛋白） 老叶：(1.223-0.893)/1.223/0.5/（16.231*10^-3）/2.5=13.3（单位/mg蛋白）

六、实验结果和分析 ①可溶性蛋白测定

新叶=7229μg/g.FW>老叶=4057.75μg/g.FW

说明在叶片衰老的过程中，可溶性蛋白的含量减少。 ②MDA测定

说明在叶片衰老的过程中MDA的含量在增加 ③超氧物岐化酶（SOD)活性测定

说明高等植物叶片中SOD活性随衰老而下降。 七、实验讨论和心得

①第二次离心的目的何在？

因为此时已经加入了TBA溶液，并摇匀，且已经过沸水浴加热，上清液中已混有不少杂质，需再次离心才不会干扰显色反应结果。

②植物组织中那些物质对丙二醛测定（TBA法）干扰较大？

丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。 测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反应，生成红棕色的三甲川，三甲川的最大吸收波长在532nm。 由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，而且糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDA与TBA反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。

③研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温？

因为TBA与MDA的反应需要酸性和高温的条件，这样才能在532nm处有最大光吸收。

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